Phoenix Dactylifera L. frøekstrakt udviser antioxidanteffekter og dæmper melanogenese

Huey-Chun Huang1 , Shr-Shiuan Wang2, Tsang-Chi Tsai3, Wang-Ping Ko3 og Tsong-Min Chang2,*

Abstrakt:Baggrund: Virkningsmåden af ​​Phoenix dactylifera frøekstrakt i hudpleje er aldrig blevet undersøgt. Metoder: P. dactylifera L. frø blev ekstraheret ved ultralydsekstraktion. Ekstraktens antioxidantkarakteristika blev bestemt af 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) og 2,2'-azino-di-(3-ethylbenzthiazolinsulfonsyre) (ABTS plus ) analyser og rensemetoder. Det totale phenolindhold, reducerende kapacitet, jern (II) ion-chelering og intracellulære reaktive oxygenarter (ROS)-fjernende kapaciteter blev også undersøgt. Virkningerne af P. dactylifera L. frøekstrakt på melanogenese blev evalueret spektrofotometrisk ved en svampetyrosinaseaktivitetsanalyse, bestemmelse af intracellulær tyrosinaseaktivitet og melaninindhold. Ekspressionsniveauerne af melanogenese-relaterede proteiner blev analyseret ved Western blotting. Resultater: Resultaterne afslørede, at P.dactylifera L.frøekstrakt udøvede tilsyneladende antioxidantkapacitet og reducerede signifikant intracellulært ROS-indhold ved koncentrationer på {{0}}.245 og 0.49 (mg/mL). Yderligere reducerede ekstraktet ekspressionen af ​​melanocortin 1-receptor (MC1R), mikrophthalmia-associeret transkriptionsfaktor (MITF), tyrosinase, tyrosinase-relateret protein-1 (TRP1) og tyrosinase-relateret protein-2 ( TRP2), og hæmmede melanogenese i B16F10-celler. Konklusioner: Vores resultater afslørede, at P. dactylifera L. frøekstrakt svækkede melanogenese i B16F10-celler ved at nedregulere proteinkinase A (PKA) signalveje. Derfor kan ekstraktet bruges som en type hudblegemiddel i hudplejeprodukter.

Nøgleord: Phoenix dactylifera;tyrosinase; melanin; ROS; PKA

cistanche pharma specialer en type hudblegemiddel.

1. Introduktion

Antioxidanter er blevet anvendt i vid udstrækning til at forebygge eller behandle oxidativ stress-relaterede lidelser inden for kosmetiske og dermatologiske områder. I løbet af de sidste par årtier er antioxidanter også blevet brugt i kosmetikindustrien til at forhindre eller forsinke hudens aldring. Det er rapporteret, at frie radikaler og reaktive oxygenarter (ROS) er forbundet med flere sygdomme, såsom aldring og aldersrelaterede sygdomme [1]. Interessant nok spiller frie radikaler på huden forårsaget af UV-bestrålingsstress og ROS en vigtig rolle i processen med fotoældning af huden [2,3]. Antioxidanter rapporteres at interferere med oxidationsprocessen ved at fjerne frie radikaler og ROS eller ved at chelatere oxidationskatalytiske metaller [4]. Derfor har der været en dramatisk stigning i antallet af påføringer af antioxidanter eller antioxidant kosttilskud for at reducere oxidativ stress eller oxidativ stress-induceret skade i kroppen [5,6]. Nogle kemiske antioxidanter, herunder natriumascorbat, tert-butylhydroxyanisol (BHA), natriumerythorbat og tert-butylhydroxytoluen (BHT), har imidlertid vist sig at fremme kræftfremkaldende virkninger på menneskers sundhed [7]. Derfor er den hurtige vækst i undersøgelser af planteafledte naturlige antioxidanter sket i løbet af de sidste årtier. Det er vigtigt, at det blev fundet, at stigninger i niveauet af ROS kan fremskynde hudpigmentering. Blandt de ROS, der stammer fra melanocytter og keratinocytter, stimulerer nitrogenoxid, NO, melaninsyntesen ved at øge proteinekspressionsniveauer af tyrosinase og tyrosinase-relateret protein 1 (TRP1) [8,9]. Effekten af ​​ROS på melaninproduktionen er blevet undersøgt ved hjælp af forskellige antioxidanter, såsom N-acetylcystein, for at ophæve virkningen af ​​UVB-induceret -melanocytstimulerende hormon (-MSH) [10].

Melanin produceres og udskilles af melanocytter, der er fordelt i det basale lag af hudens epidermis [11]. De første to trin af melanogenese-vejen hos mennesker er hydroxylering af L-tyrosin til 3-4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) og oxidation af L-DOPA til o-dopaquinon. Tyrosinase (EC 1.14.18.1) er et hastighedsbegrænsende enzym, der katalyserer begge de to første reaktioner under melanogenese [12]. Melanin spiller en afgørende rolle i at beskytte huden mod sollys ultraviolet (UV) skade og er også ansvarlig for at farve hår, hud og øjne. Det er blevet rapporteret, at forskellige dermatologiske lidelser, såsom alderspletter, melasma, post-inflammatorisk melanodermi, fregner og steder med aktinisk skade, som følge af akkumulering af et for højt niveau af epidermal melanin [13]. Inhibitorer af melaninsyntese er i stigende grad blevet anvendt i hudplejeprodukter til behandling eller forebyggelse af hyperpigmenterede hudlidelser [14,15]. Derudover er antioxidanter, såsom arbutin eller kojinsyre [16], blevet brugt til behandling af hyperpigmentering [17]. På det seneste har hudblegende kosmetik udgjort en stor del af kosmetiske produkter. Ikke kun kvinder med mørk hud, men også dem, der forsøger at klare mørke pletter på deres hud som følge af UV-lys, graviditet eller øget alder, gør i vid udstrækning brug af disse hudblegende produkter.

Melanogenese reguleres af flere faktorer. For eksempel blev tyrosinase-relateret protein-1 (TRP1), mikrophthalmia-associeret transkriptionsfaktor (MITF) og tyrosinase-relateret protein-2 (TRP2) rapporteret at regulere produktionen af ​​melanin [18-20 ]. Melanocortin 1-receptoren (MC1R) er også fremtrædende i -MSH-induceret melaninsyntese [21]. Der er flere signalveje involveret i melaninproduktion. Blandt de forskellige signalveje, der regulerer melaninproduktion, spiller cyklisk AMP (cAMP)-medieret proteinkinase A (PKA) aktivering en kritisk rolle i reguleringen af ​​melanogenese [22]. I cAM-PKA-signalvejen inducerer cAMP aktiveringen af ​​PKA [23], som efterfølges af phosphorylering af cAMP-responselementbindende protein (CREB). CREB er en intracellulær transkriptionsfaktor, der stimulerer ekspressionen af ​​microphthalmia factor (MITF) genet, som er vigtigt i melanogenese. MITF er en transkriptionsfaktor, der binder til promotorregionerne af de melanogene gener tyrosinase, TRP1 og TRP2, og opregulerer deres ekspression [24,25]. Bagefter stiger det intracellulære melaninindhold [26]. Det er blevet rapporteret, at -MSH øger cAMP-niveauer og normalt anvendes til at aktivere phosphoryleringen af ​​CREB og derefter øge MITF-proteinniveauer [27].

MITF-ekspression reguleres af flere signalveje. c-Jun N-terminal kinase (JNK) og p38 mitogen-aktiveret proteinkinase (MAPK) er involveret i aktiveringen af ​​MITF-ekspression og den deraf følgende øgede tyrosinase-ekspression. Ekstracellulære responsive kinase (ERK) aktiveringssignaler øger også CREB-phosphorylering og efterfølgende MITF-ekspression, som modulerer melaninsyntese [28,29]. Derfor blev flere hudblegende midler rapporteret at hæmme MITF-transkriptionel aktivitet ved at reducere proteinekspressionsniveauerne af tyrosinase, TRP1 og TRP2 gennem nedregulering af p38MAPK-medieret MITF-phosphorylering. Derudover er ERK-vejen blevet beskrevet at være involveret i MITF-regulering under melanogenese [30,31]. Aktivering af ERK-phosphorylater MITF, hvilket fører til nedbrydning af MITF, hvilket resulterer i en reduktion af melaninindholdet [32,33].

Oxidativt stress kan være resultatet af enten ROS-overproduktion eller nedsat antioxidantforsvar [1]. Søgen efter og anvendelser af naturlige antioxidanter forbliver i fokus hos talrige forskerhold over hele verden. På det seneste har der været stigende interesse for forskning og udvikling af fytokemikalier, såsom naturlige antioxidanter og phenolforbindelser fra forskellige naturlige kilder, som kan bruges som ernæringsmidler, anti-aldringskosmetik og lægemidler [34]. Phoenix dactylifera L. er en af ​​de vigtigste frugtafgrøder produceret i Mellemøsten og Nordafrika [35,36]. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at P. dactylifera L. frugter udviser antioxidante, frie radikaler-fjernende, antimikrobielle og antiinflammatoriske aktiviteter [37,38]. De funktionelle virkninger af P. dactylifera L. er ikke kun begrænset til frugterne selv, men også til deres frø, som er en slags biprodukt af frugterne [39,40]. P. dactylifera L. frøekstrakter kan på grund af dets antioxidantegenskaber tjene som en kilde til antioxidantstoffer, der virker mod oxidativt stress [41-43]. Der er dog kun udført få undersøgelser af anvendelsen af ​​P. dactylifera L. frø til udvikling af kosmetiske produkter. Disse frø kasseres normalt som affald, men deres betydning som en funktionel kosmetisk ingrediens er fremhævet heri. Til dato har der ikke været rapporter om virkningsmekanismen af ​​P. dactylifera L. frøekstrakt inden for hudplejekosmetik eller frøekstraktets virkning på melaninproduktionen. Fokus for denne undersøgelse var at bestemme potentialet af P. dactylifera L. frøekstrakt som en melanogenese-hæmmer for den kosmetiske industri.

De mekanismer, der ligger til grund for de hæmmende virkninger af P. dactylifera L. frøekstrakt på melanogenese er endnu ikke blevet undersøgt. Formålet med den aktuelle undersøgelse var at undersøge antioxidantkarakteristika og potentielle virkningsmekanismer af P. dactylifera L. frøekstrakt på melanogenese ved at undersøge MITF-transskriptionsregulatorerne og phosphorylering af regulatorer af MAPK- og PKA-signalvejene.

frisk cistanche

2. Materialer og metoder

2.1. Kemikalier og reagenser

De kemiske reagenser anvendt i undersøgelsen blev købt fra Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MS, USA). Antistofferne var fra Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA, USA), og ECL-reagenset var fra Millipore (Billerica, MA, USA).

2.2. Fremstilling og ekstraktion af P. dactylifera frøekstrakt

Tørrede P. dactylifera L. frugter blev høstet i 2019 fra traditionelle butikker i Medina City, Saudi-Arabien. P. dactylifera L. frøene blev vasket fuldstændigt, udsat for sollys, lufttørret i en dag og derefter tørret ved 80 ◦C i 2 timer i en ovn. De dehydrerede frø blev pulveriseret til et fint pulver (#50 mesh) med en forpligtet mølle (Retsch Ultra Centrifugal Mill and Sieving Machine, Type ZM1, Haan, Tyskland). Pulveret blev opsamlet i en forseglet glasflaske og opbevaret ved 25 ◦C indtil brug. Pulveriseret udtørret P. dactylifera L. frøpulver (2 g) blev anbragt i et ekstraktionsbæger indeholdende 10 ml destilleret vand. Dernæst blev ultralydsekstraktion udført med ULTRAsonikTM 57H-modellen (250 W, C, and A Sales Industrial Supplies, Yucaipa, CA, USA). Arbejdsfrekvensen var 45 kHz i 30 min. Efter ekstraktion blev prøverne centrifugeret ved 4500 rpm i 50 minutter ved 25 ◦C med en Eppendorf Centrifuge 5810 R (Hamburg, Tyskland). Supernatanterne blev opsamlet og filtreret med et nylonfilter (porestørrelse: 0,45 μm), og filtratet blev koncentreret til 9,8 mg/ml.

2.3. Ultra-Performance Liquid Chromatography (UPLC) analyse af P. dactylifera frøekstrakt og ferulsyre

P. dactylifera frøekstraktet blev analyseret under anvendelse af en ACQUITY UPLC H klasse med en fotodiode array detektor (Waters, Milford, MA, USA). Søjlen var en ACQUITY UPLC BEH C18 søjle, 130 Å, 1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm. Mobil fase A var 0,5 procent eddikesyre, og mobil fase B var acetonitril. For tidspunkter 0 og 5 minutter var procentforholdet mellem A/B 95/5; i 20 minutter var procentforholdet af A/B 5/95; for tidspunkterne 21 og 25 minutter var procentforholdet mellem A/B 95/5. Ferulsyre (1 ppm) blev anvendt som den positive standard.

2.4. DPPH Scavenging Activity Assay

I denne analyse blev C-vitamin ({{0}},5 mg/mL) og BHA (0,1 mg/mL) brugt som antioxidantstandarder. P. dactylifera L. frøekstraktet i forskellige koncentrationer (0.0049, 0,0245 og 0,049 mg/ml) blev tilsat til 2,9 ml DPPH (60 μM) opløsning. Antioxidantkomponenter i frøekstrakten kunne donere brint til DPPH og omdanne DPPH til den reducerede form. Det resulterende fald i absorbans ved 517 nm blev registreret ved anvendelse af et UV-Vis spektrofotometer [44].

2.5. ABTS plus Scavenging Capacity Assay

ABTS plus opfangningskapaciteten af ​​P. dactylifera L. frøekstrakt blev sammenlignet med kapaciteten for C-vitamin ({{0}},9 mg/mL) og BHA ({{10}}. 9 mg/ml). Til dette assay blev ABTS plus anvendt. Kation blev først fremstillet ved at omsætte opløsningen af ​​ABTS (7 mM) med kaliumpersulfat (2,45 mM), og blandingen fik lov at stå i mørke i mindst 6 timer før brug. Absorbansen ved 734 nm blev målt 1 0 min efter blanding af forskellige koncentrationer af frøekstraktet (0,0098, 0,049 og 0,098 mg/mL) med 1 ml ABTS plus opløsning [45].

2.6. Bestemmelse af totalt phenolindhold

Det totale phenolindhold blev bestemt ved hjælp af Folin-Ciocalteu-reagenset [46], og gallussyre (2 ug/ml) blev anvendt som en positiv standard. Forskellige koncentrationer af P. dactylifera L. frøekstrakt (0.0196, 0.098 og 0,196 mg/mL) blev fremstillet i 80 procent methanol; 100 μL ekstrakt blev overført til et reagensglas, og 0,5 mL Folin-Ciocalteu-reagens (tidligere fortyndet 10-fold med deioniseret vand) blev tilsat og blandet. Blandingen fik lov at henstå ved stuetemperatur i 5 minutter; 1,5 ml 20% natriumcarbonat blev tilsat. Efter henstand ved stuetemperatur i 2 timer blev absorbansen aflæst ved 760 nm ved anvendelse af et UV-Vis spektrofotometer.

2.7. Bestemmelse af reducerende kapacitet

Vitamin C ({{0}}.008 mg/mL) eller BHA (4,8 mg/mL) blev brugt som positive standarder i denne analyse. Frøekstraktets reducerende kapacitet blev bestemt ifølge metoden beskrevet af Oyaizu [47]. Forskellige koncentrationer af P. dactylifera L. frøekstrakt (0.0073, 0,036, 0,073 mg/ml) blev blandet med phosphatbuffer (2,5 ml, 0,2 M, pH 6,6) ) og kaliumferricyanid [K3Fe (CN)6] (2,5 ml, 1 procent vægt/volumen). Blandingen blev inkuberet ved 50 ◦C i 20 min. Trichloreddikesyre (2,5 ml, 10 % vægt/volumen) blev tilsat til blandingen, som derefter blev centrifugeret ved 1000 x g i 10 minutter. Det øverste lag af opløsning (2,5 ml) blev blandet med destilleret vand (2,5 ml) og FeCl3 (0,5 ml, 0,1 procent vægt/volumen), og absorbansen ved 700 nm blev målt.

2.8. Måling af jern(II)ion-chelateringskapacitet

Til måling af Fe2 plus -ion-chelateringskapaciteten af ​​P. dactylifera L. frøekstrakt, EDTA (0.02, 0.04 og { {10}}.08 mg/mL) blev brugt som en positiv standard. Forskellige koncentrationer af frøekstraktet (0,0196, 0,098 og 0,196 mg/ml) blev tilsat til en FeCl2-opløsning (0,05 ml, 1 mM). Reaktionsblandingen blev omsat med ferrozin (0,1 ml, 1 mM), derefter blev blandingen kvantificeret til 1 ml med methanol og inkuberet ved 25 ◦C i 10 min. Absorbansen af ​​reaktionsblandingen blev målt ved 562 nm [48].

2.9. Cellelevedygtighedsanalyse

Cellelevedygtighedsassayet blev udført under anvendelse af MTT-metoden [49]. Cellerne blev udsat for forskellige koncentrationer af P. dactylifera L. frøekstrakt (0.049, 0.245 og 0,49 mg/mL) i 24 timer ved 37 ◦C og 5 procent CO2 i en befugtet inkubator, og MTT-opløsningen blev tilsat til brøndene. Det uopløselige derivat af MTT blev solubiliseret med ethanol-DMSO (1:1 blandingsopløsning). Absorbansen af ​​brøndene ved 570 nm blev målt under anvendelse af en mikropladelæser. B16F10-celler (BCRC60031) blev opnået fra Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu city, Taiwan. Cellerne blev holdt i DMEM (Hyclone, Logan, UT, USA) suppleret med 10 procent føtalt bovint serum og 1 procent antibiotika. Derudover blev virkningen af ​​P. dactylifera L. frø på B16F10-cellelevedygtighed også evalueret ved trypanblåt-eksklusionsassaymetoden. Efter behandling med frøekstraktet blev celler trypsinbehandlet og centrifugeret for at opsamle pelleten. Cellepelleten blev resuspenderet i 300 μL DMEM-cellekulturmedier. En lille alikvot af cellesuspension (20 μL) blev blandet forsigtigt med 10 μL trypanblåt (4 procent i PBS). Celleantallet blev talt (ikke-levedygtige celler var blå og levedygtige celler ufarvede) ved anvendelse af et hæmocytometer under mikroskopet.

2.10. Måling af svampetyrosinaseaktivitet

Svampetyrosinaseopløsningen (10 μL, 200 enheder) blev tilsat til en 96-brønds mikroplade. Reaktionsblandingen indeholdt 5 mM L-DOPA opløst i phosphatbufret saltvand (PBS) (50 mM, pH 6,8) og P. dactylifera L. frøekstrakt (0.049, 0,245 og 0,49 mg/ml), kojinsyre (200 mM; 0,03 mg/ml) eller arbutin (2 mM; 0,54 mg/ml). Assayblandingen blev inkuberet ved 37 ◦C i 30 minutter, og absorbansen af ​​dannet dopakrom blev målt ved 490 nm. Måling af svampe-tyrosinase-aktivitet blev udført som tidligere beskrevet [50].

2.11. Bestemmelse af melaninindhold

B16F10-cellerne blev behandlet med -MSH (100 nM) i 24 timer og derefter behandlet med enten P. dactylifera L. frøekstrakt (0,0245-0,147 mg/mL) eller arbutin (0,54 mg/ml) i yderligere 24 timer. Efter behandling blev cellepelleterne solubiliseret i NaOH-opløsning (1 N) ved 60 ◦C i 60 min. Melaninindholdet blev detekteret ved 405 nm, som tidligere beskrevet af Tsuboi [51].

Cistanche hæmmer melaninproduktionen.

2.12. Måling af intracellulær tyrosinaseaktivitet

Intracellulær tyrosinaseaktivitet blev bestemt som beskrevet tidligere [52]. Cellerne blev behandlet med -MSH (100 nM) i 24 timer og derefter med P. dactylifera L. frøekstrakt (0.0245-0,147 mg /ml) eller arbutin (0,54 mg/ml) i 24 timer. Efter behandling blev celleekstrakterne (100 μL) blandet med frisklavet L-DOPA-opløsning (0,1 procent i PBS) og inkuberet ved 37 ◦C, og absorbansen ved 490 nm blev målt.

2.13. Western Blotting-eksperiment

Cellerne blev behandlet med P. dactylifera L. frøekstrakt ({{0}}.0245, 0.0368, 0.{ {14}}49 og 0,147 mg/ml) eller arbutin (0,54 mg/ml) og derefter lyseret i PBS indeholdende nondiet P-40 (1 procent), natriumdeoxycholat (0,5 procent), natriumdodecyl sulfat (SDS, 0,1 procent), aprotinin (5 ug/ml), phenylmethylsulfonylfluorid (100 ug/mL), pepstatin A (1 ug/ml) og EDTA (1 mM) ved 4 ◦C i 20 min. Totale lysater blev kvantificeret ved anvendelse af et mikro-BCA-kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Proteiner (30 ug) blev opløst ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese og overført elektroforetisk til en polyvinylidenfluoridmembran. Membranen blev blokeret i 5 procent fedtfri mælk i PBST (PBS med 0,05 procent Tween-20) og inkuberet ved 4 ◦C natten over med følgende primære antistoffer fortyndet i PBST: MITF Ab (1:1000), TRP1 Ab (1:6000), TRP2 Ab (1:1000), MC1R Ab (1:500), GAPDH Ab (1:1500), tyrosinase Ab (1:2000), p-p38 Ab (1:500), p38 Ab (1:500), p-JNK Ab (1:500), JNK Ab (1:500), p-ERK Ab (1:500), ERK Ab (1:500), p-CERB Ab (1: 500), og CERB Ab (1:200), alle fra Santa Cruz Biotech (Dallas, TX, USA)). De bundne antistoffer blev påvist af peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Amersham Corp.) efterfulgt af ECL-detektionssystem (Amersham) i henhold til producentens anvisninger.

2.14. PKA-hæmmeranalyse

Cellerne blev behandlet med -MSH (100 nM) i 24 timer efterfulgt af en 1 times tilsætning af 10 μM PKA-regulator H89. Efter behandling blev P. dactylifera L. frøekstrakt (0,147 mg/ml) og H89 tilsat til cellerne og inkuberet i yderligere 23 timer. Melaninindholdet blev bestemt som beskrevet ovenfor.

2.15. Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Tukeys post hoc-test, som blev brugt til sammenligninger af målte data ved hjælp af Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 22.0 statistisk software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). * p < 0.05="" blev="" betragtet="" som="" signifikant,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p=""><>

3. Resultater

3.1. UPLC-analyse af P. dactylifera L. frøekstrakt

UPLC-analyseresultaterne er vist i figur 1A, B. Figur 1A viser den overlappede top af P. dactylifera L. frøekstrakt og ferulinsyre ved 330 nm. Figur 1B viser lignende scanningsspektre mellem 220 og 500 nm for P. dactylifera L. frøekstrakt og ferulinsyre.

3.2. Antioxidantkarakteristika af P. dactylifera L. frøekstrakt

Antioxidantaktiviteten af ​​P. dactylifera L. frøekstrakt in vitro afslørede tilstedeværelsen af ​​antioxidantpotentiale. I DPPH-analyse, C-vitamin ({{0}}.05 mM; 0,53 mg/ml) og tert-butylhydroxyanisol (BHA) (0 0,1 mg/ml) blev anvendt som positive antioxidantstandarder. DPPH-opfangningskapaciteten for ekstraktet var 49,97 ± 2,9 procent, 81,36 ± 0,56 procent og 78,53 ± 3,83 procent af kontrollen for ekstraktkoncentrationerne af 0.0{{ 31}} henholdsvis 49, 0,0245 og 0,049 (mg/ml). Til sammenligning var opfangningskapaciteten af ​​vitamin C og BHA henholdsvis 90,12 ± 0,31 procent og 90,44 ± 0,49 procent (figur 2A).

Denne ABTS radikalkation er blå i farven og er reaktiv over for de fleste antioxidanter. Under denne reaktion omdannes den blå ABTS-radikalkation tilbage til sin farveløse neutrale form. Reaktionen blev overvåget spektrofotometrisk. ABTS plus-opfangningskapaciteten af ​​ekstraktet var 5,69 ± 1,36 procent, 18,81 ± 0,68 procent og 66,82 ± 8,51 procent af kontrollen ved koncentrationer på 0.0{{16 }}98, 0.{{20}}49 henholdsvis 0.098 mg/ml. I modsætning hertil var ABTS plus opfangningskapaciteten for vitamin C (0,9 mg/ml) og BHA (0,9 mg/ml) henholdsvis 95,52 ± 0,12 procent og 40,3 ± 0,83 procent. Resultaterne i figur 2B indikerer, at frøekstrakten fjerner en betydelig mængde af ABTS plus radikal.

For at bestemme det totale phenolindhold i P. dactylifera L. frøekstraktet blev gallussyre (2 ug/ml) anvendt som en positiv standard. Resultaterne i figur 2C indikerer, at det samlede phenolindhold i 0.0196, 0.{{20}}98 og 0. 196 (mg/mL) af ekstraktet var henholdsvis 33,43 ± 2,33 procent, 117,22 ± 7,81 procent og 195,4 ± 10,91 procent. Gallussyreækvivalenterne (GAE) af de førnævnte koncentrationer af frøekstrakter var henholdsvis 0.068 ± 0,01, 0,365 ± 0,01 og 0,642 ± 0,03 (figur 2C).

3.3. Inhiberende virkninger af P. dactylifera L. frøekstrakt på melanogenese

Resultaterne vist i figur 4A viser, at 0.049 mg/ml af P. dactylifera L. frøekstraktudøvede ikke en hæmmende effekt på svampe-tyrosinase-aktivitet. På den anden side var enzymhæmningsprocenterne 8,34 ± 2,67 procent og 33 ± 2,36 procent af kontrollen for 0.245 og 0.49 mg/mLP. dactylifera L. frøekstraktbehandlinger, hhv. Derudover er tyrosinaseinhiberingsprocenterne for kojinsyre (200 μM; 0.03 mg/mL) og arbutin (2 mM; 0,54 mg/mL) 56,26 ± 5,06 procent og 64,56 ± 2,88 procent af kontrollen, henholdsvis (figur 4A). De højere koncentrationer af P. dactylifera L. frøekstrakt (0,245 og 0,49 mg/ml) kunne således repræsentere hæmmende niveauer af svampetyrosinase.

I figur 4B viste resultaterne, at kun 0.147 mg/mL af P. dactylifera L. frøekstrakt kunne reducere melaninindholdet i B16F10 melanomceller signifikant. Efter behandling var melaninindholdet i B16F10-celler 80,66 ± 5,43 procent af kontrollens. For den positive standard, arbutin (0,54 mg/mL), var det resterende intracellulære melaninindhold 61,19 ± 8,17 procent af kontrollens. Resultaterne viste, at 0,147 mg/ml af P. dactylifera L. frøekstrakt viste mindre virkninger end arbutin. De resterende intracellulære tyrosinaseaktivitetsværdier var 85,1 ± 8,1 procent og 73,7 ± 11,9 procent for henholdsvis 0,098 og 0,147 mg/ml P. dactylifera L. frøekstrakt. Den resterende intracellulære tyrosinaseaktivitet var 64,3 ± 14,9 procent af kontrollen, efter at cellerne var blevet behandlet med arbutin (figur 4C). Resultaterne indikerede, at højere koncentrationer af P. dactylifera L. frøekstrakt stadig udviste en mindre hæmmende virkning på -MSH-induceret tyrosinaseaktivitet i B16F10-celler end arbutin.

3.4. P. dactylifera L. frøekstrakt hæmmer ekspressionsniveauerne af proteiner involveret i melaninogenese

Western blots blev brugt til at undersøge ekspressionsniveauerne af melanogenese-relaterede proteiner i B16F10-celler (figur 5A). Resultaterne indikerer, at behandling med forskellige koncentrationer af P. dactylifera L. frøekstrakt førte til reducerede niveauer af MC1R, MITF, tyrosinase, TRP1 og TRP2. De hæmmende virkninger af ekstraktet på proteinekspression var tydelige ved en koncentration på {{10}}.147 mg/ml. Gangændringen i proteinekspressionsniveau for MC1R var 0.74 ± 0.02; for MITF var det {{20}}.51 ± 0.03; for tyrosinase var det 0,54 ± 0,26; for TRP-1 var det 0,57 ± 0,15; og for TRP-2 var den 0,49 ± 0,1 (figur 5B).

Ekspressionsniveauerne af melanogenese-relaterede signalproteiner blev undersøgt ved hjælp af Western blots (figur 5C). Resultaterne indikerer, at 0.147 mg/ml af P. dactylifera L. frøekstraktbehandling tilsyneladende førte til reducerede niveauer af p-p38, p-JNK, p-ERK og p-CREB. Gangændringen af ​​proteinekspressionsniveau for p-p38 var 0.88 ± 0.15; for p-JNK var det 0.68 ± 0.39; for p-ERK var det 0.65 ± 0.23; og for p-CREB var det 0.44 ± 0.07 (figur 5D).

3.5. P. dactylifera L. Frøekstrakt påvirker ikke tyrosinase-, TRP1-, TRP2- eller MITF-genekspression

Genekspressionsniveauerne for melanogenese-relaterede proteiner, såsom tyrosinase, TRP1, TRP2 og MITF, blev undersøgt ved kvantitativ real-time polymerase kædereaktion (RT-PCR). De relative normaliserede ekspressionsniveauer af tyrosinase/GAPDH for 0.0367, 0.049 og 0.147 mg/mL P. dactylifera L. frøekstraktbehandlinger var henholdsvis 3,51 ± 0.52, 2.38 ± 0.24 og 1.64 ± 0.55. For TRP-1/GAPDH, de relative normaliserede udtryksniveauer for 0.0367, 0.049 og {{4{{43} }}}.147 mg/mL P. dactylifera L. frøekstraktbehandlinger var 1,64 ± 0.2, 1,15 ± 0.02 og 0. 89 ± 0.07, hhv. De relative normaliserede udtryksniveauer af TRP-2/GAPDH for 0.0367, 0.049 og 0.147 mg /ml af P. dactylifera L. frøekstrakt var henholdsvis 1.08 ± 0,13, 0,85 ± 0,01 og 0,7 ± 0,05. For MITF/GAPDH var de relative normaliserede ekspressionsniveauer for 0,0367, 0,049 og 0,147 mg/ml af P. dactylifera L. frøekstraktbehandlinger henholdsvis 1,48 ± 0,19, 1,03 ± 0,02 og 0,74 ± 0,05 gur.

4. Diskussion

Det er blevet rapporteret, at melanogenese øger cellulært oxidativt stress. Derudover kan adskillige antioxidanter, ROS-fjernere, inhibitor-fjernere og inhibitorer hæmme UV-medieret melaninsyntese [54]. Derfor er antioxidanter, ROS-fjernere og inhibitorer af melanogenese i stigende grad blevet anvendt til hudblegende kosmetik til forebyggelse af uønsket hudhyperpigmentering [14]. Det blev også fundet, at stimulering af metallothionein, en endogen antioxidant, kunne undertrykke melanogenese i melanocytter [55]. Menneskets hud udsættes ofte for miljømæssige oxiderende forurenende stoffer eller UV-lys og er beskadiget af ydre miljøfaktorer. Især er UV-bestråling blevet rapporteret at inducere dannelsen af ​​ROS i huden og fremme cellemembranlipidperoxidation [56]. For at modvirke oxidativ stress er huden udstyret med særlige antioxidantsystemer [57].

For at belyse antioxidantaktiviteten af ​​P. dactylifera L. frøekstrakt blev DPPH og ABTS plus radikalfjernende aktivitet, totalt phenolindhold, reducerende kapacitet og metalion-chelaterende kapacitet af ekstrakten bestemt som tidligere beskrevet [47,48]. P. dactylifera L. frøekstraktet udøvede betydelige antioxidantaktiviteter i alle de førnævnte analytiske undersøgelser. Resultaterne viste antioxidantpotentialet af P. dactylifera L. frøekstrakt over forskellige områder med forskellige effektiviteter. DPPH-fjernende aktivitet af frøekstraktet blev vist i figur 2A var forskellig fra ABTS plus vist i figur 2B, hvilket kan være et resultat af forskellige mekanismer af antioxidant-radikal interaktioner. Derudover kan støkiometrien af ​​reaktioner mellem antioxidantkomponenterne i frøekstraktet variere, hvilket resulterer i en forskel i frie radikaler-fjernende kapacitet [58]. De potentielle antioxidanter i P. dactylifera L. frøekstrakten kunne omdanne et Fe3 plus/ferricyanid-kompleks til jernformen, og den reducerende kapacitet tjente som en indikator for antioxidantaktiviteten af ​​frøekstraktet vist i figur 2D. Det blev fundet, at kojinsyre [59] virker som en tyrosinaseinhibitor, fordi kojinsyre virker som en metalchelator for at chelatere kobberionerne og hæmme de ioner, der kommer ind i det aktive sted af tyrosinase. Derfor kan antioxidanter i frøekstrakten danne uopløselige metalkomplekser med jernholdige ioner og derefter hæmme interaktionen mellem metalioner og lipider. Frøekstraktets højere metalion-chelaterende kapacitet indikerede dets potentielle antioxidantaktivitet og mulige hæmmende virkninger på tyrosinaseaktivitet (figur 2E).

Princippet for analysen af ​​intracellulær ROS er, at DCFH-DA diffunderer gennem cellemembranen og hydrolyseres enzymatisk til DCFH af esterase; derefter reagerer DCFH med ROS (såsom H2O2) for at give DCF. Hurtige stigninger i DCF indikerede oxidation af DCFH af intracellulære radikaler [60]. Ideen bag at søge efter nye antioxidanter til hudblegende aktiviteter ligger i hypotesen om, at det oxidative stress som følge af UV-bestråling kan bidrage til at stimulere melaninsyntesen. UV-bestråling er blevet rapporteret at producere ROS i kutant væv, der kan inducere melaninproduktion ved at aktivere tyrosinase [61]. Desuden blev det rapporteret, at adskillige hudblegningsmidler kan hæmme melanogenese ved at interagere med kobberioner på det aktive sted af tyrosinase eller med o-quinoner for at blokere polymerisationen af ​​mellemprodukter i melaninsyntesevejen [62]. Derudover kan C-vitamin eller E-vitamin reducere oxidationen af ​​allerede eksisterende melaninpartikler. Derfor er disse vitaminer blevet anvendt i vid udstrækning i produkter til hvidtning af huden [63]. Interessant nok demonstrerede vores resultater antioxidantegenskaberne af P. dactylifera L. frøekstrakt, hvilket indikerer, at frøekstraktet af P. dactylifera L. kunne fungere som en hudblegende ingrediens i kosmetik.

MTT-assayet er et velkendt kolorimetrisk assay, der måler aktiviteten af ​​cellulære NADH/NADPH-afhængige oxidoreduktase-enzymer, der reducerer MTT til lillafarvede formazanfarvestoffer. Dette assay kan anvendes til at undersøge den potentielle cytotoksicitet af medicinske midler og toksiske materialer, da disse midler øger eller hæmmer cellelevedygtighed. Resultaterne vist i figur 3A var i overensstemmelse med resultaterne af trypanblåt udelukkelsesassayet i figur 3B, hvilket indikerer, at P. dactylifera L. frøekstraktet ikke havde nogen cytotoksisk virkning på B16F10 melanomcellelevedygtighed.

Svampetyrosinase bruges almindeligvis som et målenzym til screening af potentielle inhibitorer af melanogenese. Det blev først fundet, at dosisområdet ({{0}}.049-0,49 mg/mL) af P. dactylifera L. frøekstrakt kunne hæmme aktiviteten af ​​svampetyrosinase. Resultaterne vist i figur 4A indikerer, at frøekstraktet udviste lavere inhiberende virkninger på svampetyrosinaseaktivitet end kojinsyre. Tyrosinase spiller en stor rolle i de første to trin af melanogenese-vejen. For at belyse den sande inhiberende effekt af P. dactylifera L. frøekstraktet på melaninproduktionen blev B16F10 melaninindholdet og intracellulær tyrosinaseaktivitet bestemt. Resultaterne vist i figur 4B indikerer, at en højere koncentration af P. dactylifera L. frøekstrakt udøvede en tilsyneladende hæmmende virkning på melanindannelse. Dataene viste, at P. dactylifera L. frøekstrakt virkelig blokerer melanogenese i melanomceller. Med dette var resultaterne vist i figur 4C i overensstemmelse med resultaterne vist i figur 4B. I de førnævnte cellulære eksperimenter blev -MSH brugt som en inducer til at stimulere melaninsyntese. -MSH blev rapporteret at binde melanocortin 1-receptor (MC1R) og aktivere intracellulær adenylatcyclase, som igen katalyserer ATP til cAMP og aktiverer cAMP-afhængig PKA. Resultaterne i figur 5A afslørede, at P. dactylifera L. frøekstraktet inhiberede ekspressionen af ​​MC1R og blokerede derved melaninproduktion induceret af -MSH-medieret intracellulær cAMP-opregulering. Endvidere blev den cAMP-medierede PKA-signalvej inaktiveret, og melanogenese blev hæmmet. For at bekræfte slutningen har vi udført PKA-hæmmerforsøgene, og dataene vist i figur 4D indikerede den hæmmende virkning af P. dactylifera L. frøekstrakt (0,147 mg/ml) på melanogenese i B16F10-celler blev undertrykt af H{{ 24}}behandling. H89 (N-[2-p-bromocinnamylamino-ethyl]-5-isoquinolinsulfonamid) er en selektiv og potent hæmmer af PKA. Resultaterne indikerer, at cAMP-medieret PKA-signalering blev påvirket af P. dactylifera L. frøekstrakt.

Tyrosinase, TRP1 og TRP2 er de tre vigtigste enzymer, der regulerer melaninsyntesen i pattedyrsceller [64]. Desuden er MITF den vigtigste transkriptionelle regulator af tyrosinase, TRP1 og TRP2, og er den vigtigste regulator af melanocytpigmentering [65]. Resultaterne i figur 5A indikerer, at P. dactylifera L. frøekstraktet reducerede proteinekspressionsniveauerne af disse melanogenese-relaterede proteiner, inhiberede tyrosinaseaktivitet og reducerede melaninindholdet i B16F10-celler.

I denne undersøgelse undertrykte P. dactylifera L. frøekstrakt CREB-phosphorylering og PKA-aktivering. Disse data tyder på, at cAMP-PKA-vejen kan være ansvarlig for P. dactylifera L. frøekstrakt-induceret anti-melanogenese (figur 5C).

MAPK'er er blevet rapporteret at modulere melanogenese [66]. MAPK-familien omfatter tre typer proteinkinaser, herunder ekstracellulær responsiv kinase (ERK), c-Jun N-terminal kinase (JNK) og p38 MAPK. p38 MAPK kan aktivere det cAMP-respons element-bindende protein (CREB og CREB aktiverer MITF-ekspression, som positivt bidrager til melaninsyntese [67]. Resultaterne i figur 5C giver bevis for, at P. dactylifera L. frøekstraktet kunne inaktivere CREB, JNK og p38 hæmmer igen MITF-ekspression (figur 5A). Disse resultater tyder på, at den. dactylifera L. frøekstrakt-inducerede antilanogene effekt kan medieres af nedregulering af PKA-vejene. Desuden er UV-lysbestråling blevet rapporteret at spille fremtrædende i begyndelsen af ​​adskillige hudlidelser, herunder afskalning, rynker og hyperpigmentering [68] Resultaterne tydede på, at P. dactylifera L. frøekstrakt nedsatte melaninproduktionen, hvilket kan tilskrives udtømningen af ​​intracellulær ROS.

For at vurdere effekten af ​​P. dactylifera L. frøekstrakt på cellulær melaninproduktion, bestemte vi mRNA-niveauerne i B16F10-celler behandlet med -MSH og P. dactylifera L. frøekstrakt. De -MSH-behandlede celler viste øgede niveauer af MITF, tyrosinase, TRP-1 og TRP-2 som forventet. Interessant nok viste P. dactylifera L. frøekstraktbehandlede celler en reduktion i mRNA-ekspressionen af ​​disse melanogenese-relaterede gener. Der eksisterede imidlertid ingen statistisk signifikant forskel mellem kolonner, hvilket indikerede, at P. dactylifera L. frøekstrakt ikke påvirker genekspressionsniveauerne for MITF, tyrosinase, TRP1 og TRP2.

Dette er vores produkt.

For mere information, klik venligst her.

Det er blevet rapporteret, at den vigtigste phenolsyre fundet i P. dactylifera L. frø er ferulinsyre [69]. Ferulinsyre har vist sig effektivt at hæmme melaninsyntese i B16 melanomceller ved at hæmme kaseinkinase 2-induceret phosphorylering af tyrosinase på en dosisafhængig måde [70]. Disse rapporter understøtter vores resultater vist i figur 1 - ferulsyre i vandekstraktet af P. dactylifera L. frø bidrog til inhiberingen af ​​melanogenese i B16F10-celler. Bestemt bør andre funktionelle komponenter i frøekstraktet undersøges i den nærmeste fremtid.

Vores resultater indikerede, at P. dactylifera L. frøekstrakt hæmmede melanogenese i B16F10-celler ved at nedregulere PKA-signalveje. Derfor kunne P. dactylifera L. frøekstraktet anvendes som et effektivt hudblegende middel.

5. Konklusioner

Dette er den første rapport om virkningsmekanismen af ​​P. dactylifera L. frøvandekstrakt i melaninsyntese. Den nuværende undersøgelse demonstrerede involveringen af ​​cAMP/PKA/CREB-vejen i den depigmenterende virkning af P. dactylifera L. frøekstrakt. Vores resultater indikerede, at P. dactylifera L. frøekstraktet hæmmede melanogenese i B16F10-celler ved at nedregulere PKA-signalvejene. Derfor kunne P. dactylifera L. frøekstrakten anvendes som et nyt dermatologisk antimelanogenesemiddel og et effektivt hudblegende middel.