Antioxidant og anti-melanogene aktiviteter af varmebehandlet lakrids (Wongam, Glycyrrhiza Glabra × G. Uralensis) ekstrakt

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Min Hye Kang 1,2, Gwi Yeong Jang 1, Yun-Jeong Ji 1, Jeong Hoon Lee 1, Su Ji Choi 1, Tae Kyung Hyun 2,* og Hyung Don Kim 1,*

Abstrakt:Melanin er et brunt eller sort pigment, der beskytter huden mod ultraviolet stråling og aktive oxygenarter (ROS). Imidlertid er overproduktion af melanin forbundet med lentiginer, melasma, fregner og hudkræft.Lakridshar vistantioxidant, anti-tumor, anti-blodplader, anti-inflammatoriske og immunmodulerende aktiviteter og bruges som en naturlig behandling af hudenblegning.Vi havde til formål at bekræfte potentialet i Wongam, en ny kultivar af lakrids udviklet af RuralDevelopment Administration (RDA), som enblegningagent i kosmetik. Derudover verificerede vi effekten af ​​varmebehandling på bioaktiviteten af ​​lakrids ved at sammenligneantioxidantoganti-melanogeneaktiviteter af lakridsekstrakt før og efter opvarmning (130 ◦C). Den varmebehandlede lakridsekstrakt (WH-130) viste højere radikal-fjernende aktiviteter i ABTS plus (2,20-azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyre syre) diammoniumsalt) og DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)-assays. Derudover hæmmede WH-130 melanogenese mere effektivt på grund af nedreguleringen af ​​tyrosinase i B16F10-melanomceller end ikke-opvarmedelakridsuddrag. Desuden øgede varmebehandling det samlede phenolindhold. Især isoliquiritigenin, enantioxidantoganti-melanogenesammensætning af lakrids, blev fremstillet ved varmebehandling. Som konklusion har WH-130, med øgede niveauer af bioaktive phenoler, såsom isoliquiritigenin, potentiale for udvikling til en ny hudblegningmateriale med anvendelser i kosmetik.

Nøgleord: anti-melanogeneaktivitet; varmebehandling;lakrids; murine melanomceller (B16F10)

Cistanche er en antioxidant

1. Introduktion

Lakrids(Glycyrrhiza-arter), en flerårig urt med medicinske anvendelser i familien Leguminosae, er vidt udbredt over Centralasien, Kina, Rusland, Manchuriet, Mongoliet og Europa [1]. Det har længe været brugt som smags- og sødemiddel. Lakridstørret og stolonen af ​​lakrids er blevet brugt til behandling af forkølelse, hoste, astma, træthed og luftvejsinfektioner på grund af lakrids biologiske aktiviteter, bl.a.antioxidant,antimikrobielle, antitumor-, anti-blodplade-, anti-inflammatoriske og immunmodulerende aktiviteter [2,3]. Slægten Glycyrrhiza består af omkring 22 lakridsarter, herunder G. uralensisFisch, G. glabra L. og G. inflata Batal.

Wongam, en ny interspecifik hybridkultivar af lakrids, blev udviklet af RuralDevelopment Administration som en hybrid af Glycyrrhiza glabra x G. uralensis (G. korshinskiGrig). Wongam har højere udbytter og bedre sygdomsresistens end G. uralensis. Adskillige undersøgelser er blevet udført på de biologiske aktiviteter af G. uralensis, hvorimod eksisterende forskning på Wongam, en ny kultivar, er begrænset til dens anti-allergiske, immunmodulerende og anti-ulcus aktiviteter [1,2]. Det er således nødvendigt at undersøge den brede bioaktivitet af Wongam.

De vigtigste bioaktive komponenter ilakridsrod er flavonoider og triterpen saponiner, herunder liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritigenin (ISL) og glycyrrhizin (eller glycyrrhizicacid) [4,5]. ISL er et flavonoid, der findes i lakrids, og som har vist forskellige farmaceutiske aktiviteter, herunder anti-blodplader, anti-allergisk, anti-tumor, anti-inflammatorisk ogantioxidantaktiviteter [6-8]. ISL er et hydrolyseprodukt fra isoliquiritin i lakridsrod. Det kan hæmme melanogenese gennem nedbrydning af mikrophthalmia-associeret transkriptionsfaktor (MITF) ved aktivering af den ekstracellulære signalregulerede proteinkinase (ERK) signalvej. Følgelig undertrykte MITF-nedbrydning ekspressionen af ​​tyrosinase(TYR) og tyrosinase-relaterede proteiner (TRP-1 og TRP-2) gener i SK-MEL-2 celler [9,10].ISL kan hæmme mono- og diphenolaseaktiviteterne af svampe-TYR samt themelanogenese i melanocytter [11].

Melanin, et hovedpigment, der giver hudfarve, syntetiseres i epidermale melanocytter og opbevares i intracellulære organeller kaldet melanosomer [12]. Melaninpigmenter består af to typer: brun eller sort eumelanin og rød eller gul pheomelanin [12]. Melanogenese kan induceres af eksterne stimuli, herunder ultraviolet (UV) stråling, reaktive oxygenarter (ROS) og kemikalier såsom -melanocytstimulerende hormon (-MSH) andisobutylmethylxanthin (IBMX), som hæver niveauerne af cyklisk adenosinmonofosfat (cAMP). Melanin beskytter huden mod disse stimuli, mens dets overproduktion forårsager hudhyperpigmentering, som kan føre til sygdomme som hudkræft [13-17]. Hudblegningmidler som kojinsyre, hydroquinon, arbutin og ascorbinsyre, som er TYR-hæmmere, er blevet brugt til at behandle hyperpigmentering i flere kosmetiske produkter [13,18]. Melanogenese reguleres gennem en række signalveje, og disse signaler er forbundet med opreguleringen af ​​MITF. Aktivering af MITF fremmer udtryk for TYR og TRP'er (TRP-1, TRP-2). Derefter katalyserer TYR oxidationen af ​​L-tyrosin til 3,4-dihydroxy-L-phenylalanin (L-DOPA), som efterfølgende oxideres til DOPAquinon. TRP-2 konverterer dopachrome til 5,6-dihydroxyindol-2-carboxylsyre (DHICA) eller 5,6-dihydroxyindol (DHI). Endelig oxideres DHICA og DHI af TRP-1, hvilket resulterer i melanogenese [19].

Termiske processer påvirker de fysisk-kemiske og biologiske egenskaber af planteekstrakter. De ødelægger cellevægge og spalter kovalente bindinger, hvilket resulterer i frigivelse af bioaktive forbindelser [20,21]. Varmebehandling af bryggere brugte kornekstrakter over 130 ◦Forøger det totale phenolindhold (TPC) og det totale flavonoidindhold (TFC) niveauer med tilsvarende stigninger i antioxidantaktiviteter [16,20,21]. Opvarmning af citrusskaller kan føre til frigivelse af phenolforbindelser og øgetantioxidantaktivitet [17].

Vores hovedmål er at bekræfte Wongams potentiale som en naturlig hudblegningmateriale i kosmetik. Derudover er denne undersøgelse også beregnet til at bevise, om varmebehandling kan forbedre antioxidant- og anti-melanogene aktiviteter aflakrids. Vi undersøgteantioxidantaktiviteter sammen med TPC for Wongam-ekstrakter.Anti-melanogenvirkningerne af Wongam-ekstrakter blev verificeret af TYR-hæmningsaktivitet og melaninindhold i melanomceller.

Cistanche er en naturlighudblegning urt

2. Materialer og metoder

2.1. Prøveforberedelse

Prøver blev fremstillet efter en tidligere rapporteret metode [22].Lakrids(Wongam, Glycyrrhiza glabra x G. uralensis, identificeret af Yun Ji Lee fra NIHHS, RDA og registreret i Korea Medicinal Resources Herbarium med vouchernummer MPS006326) blev dyrket og høstet ved Department of Herbal Crop Research (Eumsung, Chungcheongbuk-do, Korea) ) i 2018 og tørret ved 60 ◦C i 20 timer. 10 kglakridsvasket og 1 kg blev malet. Efter blanding blev der opnået 3 prøver af henholdsvis WC eller WH. Malet lakrids (5 g) blev anbragt i en glasbeholder med 1 mL destilleret vand og behandlet i en autoklave (Jisico, Seoul, Korea) i 1 time ved 130 ◦C (WH-130). Ubehandlet kontrollakrids (WC) 5 g) og WH-130 blev ekstraheret separat under anvendelse af 70 procent ethanol (prøve: opløsningsmiddel, 1:50, v:v) i 24 timer ved stuetemperatur (RT). Efter filtrering blev ekstrakterne inddampet under vakuum, frysetørret og opbevaret ved -80 ◦C. Alle ekstrakter blev solubiliseret i dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO, USA) og methanol (Sigma, St. Louis, MO, USA).

2.2. Bestemmelse af bruning

Bruningsindekset pålakridsekstrakter (WC og WH-130) blev registreret baseret på deres absorbansværdi ved 420 nm (A420) målt ved hjælp af en mikropladelæser (BioTek, Winooski, VT, USA). Højere værdier af absorbans ved 420 nm svarer til et højere bruningsindeks [23,24].

2.3. Samlet phenolindhold (TPC)

Ifølge en tidligere rapporteret metode [25] blev TPC målt baseret på princippet om, at Folin-Ciocalteus reagens reduceres til en blå kromofor bestående af aphosphowolfram-phosphomolybdæn-kompleks afhængigt af alkaliske forhold og koncentrationen af ​​phenoliske forbindelser. Hver prøve (10 µL) blev blandet med 2 procent natriumcarbonat (200 µL) og derefter Folin-Ciocalteus reagens (10 µL). Blandingen blev aktiveret i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev absorbansen målt ved 750 nm under anvendelse af en mikropladelæser (BioTek, Winooski, VT, USA). TPC blev beregnet ud fra standardkurven for gallussyre, og resultaterne blev udtrykt som gallussyreækvivalentværdier, mg GAE g-1-ekstrakt.

2.4. Bestemmelse af antioxidantkapacitet

Den radikalfjernende aktivitet blev målt under anvendelse af 2,20-azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin6-sulfonsyre) diammoniumsalt (ABTS) ifølge en tidligere beskrevet metode med let modifikation [19, 26]. ABTS radikalkationopløsning blev fremstillet ved at blande 2,6 mM kaliumpersulfat og 7,4 mM ABTS og lade dem reagere i 24 timer ved ST. ABTS-opløsningen blev derefter fortyndet med destilleret vand for at justere absorbansen til intervallet 1.000–1.500. Dernæst blev 20 µL af prøven omsat med 180 µL ABTS plus opløsning, beskyttet mod lys, og blandingen af ​​prøve og opløsning blev inkuberet i 30 minutter ved RT. Absorbans blev målt ved hjælp af en mikropladelæser (BioTek, Winooski, VT, USA) ved 735 nm. Fra en Trolox-standardkurve, Trolox-ækvivalentenantioxidantkapacitet (TEAC) blev beregnet og udtrykt i mg troloxækvivalent (TE) pr. g tør prøve.

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radikalopløsning blev fremstillet ved at opløse 0.2 mM DPPH i 99 procent ethanol. DPPH-opløsning blev fortyndet med destilleret vand til anabsorbans ved 520 nm på 1000-1500. Derefter blev 50 µL af prøven blandet med 200 µL DPPH-opløsning og reageret i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter reaktionen blev absorbansen af ​​blandingen bestemt ved 520 nm. Ud fra Trolox-standardkurven blev TEAC beregnet og udtrykt i mg TE pr. g tør prøve.

2.5. Højtydende væskekromatografi (HPLC) analyse

En modificeret HPLC-metode blev anvendt [22]. ISL indholdet aflakridsekstrakter blev analyseret ved HPLC med en UV-synlig detektor (HPLC: 1200-serien, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA; kolonne: SynergiTM, 250 × 4,6 mm, 4 µm, Fusion-RP 8{{40}} Å, Phenomenex, Torrance, CA, USA). Den mobile fase bestod af opløsningsmiddel A (0,1 procent myresyre i vand) og opløsningsmiddel B (0,1 procent myresyre i acetonitril). Gradientprogrammet for den mobile fase blev kørt under følgende gradient: 0–8 min (20–20 procent B), 8–30 min (20–38 procent B), 30–42 min (38–50 procent) B), 42-47 min (50-90 procent B), 47-53 min (90-90 procent B), 53-54 min (90-20 procent B) og 54-60 min (20-20 procent B) . Strømningshastigheden, detektionsbølgelængden og injektionsvolumen blev indstillet til henholdsvis 1,0 ml/min, 360 nm og 10 µL. ISL-standardopløsningerne blev analyseret med fire forskellige koncentrationer (0,05, 0,1, 0,2, 0,4 mg/ml). Kalibreringskurven (y=ax plus b) blev brugt til at bestemme indholdet af ISL. I regressionsligningen refererer x til koncentrationen af ​​ISL (mg mL−1), og y betyder toparealet.

2.6. Svampetyrosinaseinhiberende aktivitetsanalyse

TYR-inhibitoraktivitetsassayet blev udført under anvendelse af et TYR-hæmmerscreeningskit (BioVision, Milpitas, CA, USA). Hver ekstrakt (WC og WH-130) blev opløst i DMSO til en slutkoncentration på 250 µg/ml. Kojinsyre, anvendt som en positiv kontrol, blev også fortyndet til 250 µg/ml i DMSO. Kort fortalt blev 20 µL ekstrakt eller kojinsyre kombineret med 50 µL TYR-enzymopløsning. Efter inkubation ved stuetemperatur i 10 minutter blev 30 µL TYR-substratopløsning tilsat til hver brønd. Slutkoncentrationen af ​​ekstrakterne og kojinsyren var 50 µg/ml. Den optiske tæthed af brøndene blev derefter målt ved 510 nm i kinetisk tilstand i 1 time med en mikropladelæser (BioTek, Winooski, VT, USA).

cistanche pulver: anti-oxidation

2.7. Cellekultur

Murine melanom B16F10-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). B16F10-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10 procent føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder/ml penicillin og 100 µg/ml streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA) indeholdende en fugtig atmosfære procent CO2 ved 37 ◦C.

2.8. Cellelevedygtighedsanalyse

Cytotoksiciteten aflakridsekstrakter (WC og WH-130) til B16F10-celler blev bestemt ved hjælp af MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,{{8 }}diphenyltetrazoliumbromid] assay.B16F10-celler blev dyrket ved 4 × 103 celler/brønd i en 96-brøndsplade i 24 timer. Derefter blev ekstrakter tilsat til cellerne i koncentrationer på 50, 100 og 200 µg/ml og inkuberet ved 37 ◦C i 48 timer. Derefter blev MTT-opløsning tilsat til hver brønd (500 µg/ml), og pladen blev inkuberet i 1 time ved 37 ◦C. Mediet i hver brønd blev kasseret, og 100 µL DMSO blev tilsat. Efter omrystning i 30 minutter blev absorbansen målt ved 540 nm med en mikropladelæser. Alle test blev udført i tre eksemplarer.

2.9. Måling af cellulært melaninindhold

Intracellulært melaninindhold blev målt ved hjælp af en let modificeret version af den tidligere beskrevet metode [27]. B16F10 melanomceller blev podet i 6-brøndplader med en tæthed på 8 × 104 celler/brønd og inkuberet i 24 timer. Cellerne blev udsat for ekstrakterne (WC og WH-130, 100 µg/mL), kojinsyre (100 µg/ml) eller ISL (10 µM, Millipore Sigma, Burlington, MA, USA) i 48 timer i tilstedeværelsen af ​​100 µM 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX). Efter behandling blev cellerne vasket med Dulbeccos phosphatpufret saltvand (DPBS) og opløst i 200 µL 1 N NaOH i 2 timer ved 90 ◦C. Absorbansen ved 405 nm blev målt under anvendelse af en mikropladelæser.

2.10. Cellulær tyrosinaseaktivitetsanalyse

Intracellulær TYR-aktivitet blev målt ved hjælp af en let modificeret version af en tidligere beskrevet metode [27]. B16F10 melanomceller (8 x 104 celler/brønd) blev behandlet med ekstrakterne (100 µg/ml) eller kojinsyre (100 µg/ml) i nærværelse af 100 µM IBMX i 48 timer, opsamlet og vasket med DPBS. Proteinprøverne blev lyseret i 1 procent TrionX-100 (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) med natriumphosphatbuffer (pH 6,8) og derefter centrifugeret ved 15,000 rpm i 10 min. Supernatantfraktionen blev opsamlet, og proteinkoncentrationen blev bestemt under anvendelse af bicinchoninsyre (BCA) assaykittet (Waltham, MA, USA). En reaktionsblanding bestående af 30 µg protein (justeret til 100 µL med 1 procent Trion X-100) og 100 µL 10 mM L-DOPA blev tilsat til hver brønd i en 96-brøndplade. Efter inkubation ved 37 ◦C i 1 time blev dopakrom overvåget ved at måle absorbansen ved 490 nm ved hjælp af en mikropladelæser. TYR-aktivitet blev beregnet med følgende formel:

Tyrosinaseaktivitet ( procent )=(OD405 af prøve/OD405 af kontrol) × 100

2.11. Realtidspolymerasekædereaktion (RT-PCR)

mRNA-ekspressionsniveauerne af melanogenese-relaterede gener inklusive MITF, TYR,TRP-1 og TRP-2 blev bestemt ved hjælp af et modificeret RT-PCR-assay [28]. Kort fortalt blev B16F10-celler podet i 6-brøndsplader ved en tæthed på 8 x 104 celler pr. brønd og dyrket i 24 timer. Derefter blev cellerne behandlet med ekstrakter (100 µg/ml), kojinsyre (100 µg/ml) eller ISL (10 µM) i 48 timer. Total RNA blev isoleret fra cellerne under anvendelse af TRIzol-reagens (Ambion, Austin, TX, USA), og derefter blev koncentrationen af ​​RNA kvantificeret ved hjælp af en mikropladelæser. Efter klargøring af cDNA (2 µg) ved hjælp af Reverse Transcriptase Premix Kit (ElpisBiotech, Daejeon, Korea) i henhold til producentens protokoller, blev realtids-PCR udført ved hjælp af MITF, TYR, TRP-1, TRP-2 og -actin-primere (tabel 1, Bioneer, Daejeon, Korea) med et SYBR Green-kit (ProGEN, Heidelberg, Tyskland) i et CFX96 Real Time PCR-instrument (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Alle data blev normaliseret til niveauer af -actinmRNA som et reference husholdningsgen.

2.12. Fremstilling af cellelysater og Western blot-analyse

B16F10-celler blev podet i 6-brøndsplader med en tæthed på 8 × 104 celler pr. brønd, inkuberet i 24 timer og derefter udsat for ekstrakter (100 µg/ml), kojinsyre (100 µg/ml) ) eller ISL (10 µM) i 48 timer. Efter vask med DPBS blev cellerne høstet og lyseret i Triton X-100buffer (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) indeholdende 1 procent protease og phosphataseinhibitorcocktail. Proteinkoncentrationerne af helcellelysater blev målt under anvendelse af aBCA assaykit (Waltham, MA, USA). Lige store mængder protein (20 µg) blev fyldt på 10 procent natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgeler, som blev kørt i 4 timer ved 70 V. Derefter blev proteinerne overført til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran. Membranen blev vasket tre gange med Tris-pufret saltvand [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl] indeholdende 0,1 procent Tween 20 (TBST) og blokeret med 2 procent bovint serumalbumin (GenDEPOT) i 1 time. Derefter blev membranerne inkuberet natten over ved 4 ◦C med de primære antistoffer (fortynding 1:1000) i 4 timer ved stuetemperatur. MITF, TYR, TRP-1, TPR-2 og -actin blev detekteret med polyklonalt anti-MITF-antistof fra kanin (Abcam, Cambridge, UK); gedepolyklonalt anti-TYR-antistof (Santa Cruz, Dallas, TX, USA); og muse monoklonale antiTRP-1, anti-TRP-2 og anti- -aktin-antistoffer (Santa Cruz, Dallas, TX, USA). Bagefter blev membranerne vasket flere gange med TBST og inkuberet med sekundære antistoffer (fortynding 1:2000) i 1 time, nemlig kanin-anti-muse-IgG, muse-anti-ged-IgG og gede-anti-mus-IgG (Santa Cruz, Dallas, TX, USA), efterfulgt af adskillige vaske med TBST. Målproteiner blev påvist ved hjælp af forstærket kemiluminescens (ECL) reagens (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) med ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Proteinbåndkvantificering blev udført ved hjælp af ImageJ-software (version 1.52a til Windows; NIH, Rockville, MD, USA) [28].

2.13. Statistisk analyse Dataene blev analyseret ved hjælp af Microsoft Excel 2016, og alle eksperimentelle resultater præsenteres som middelværdien ± standardafvigelsen (SD) af tre uafhængige målinger. Elevens t-test med to prøver blev brugt til at vurdere forskelle mellem kontrollen og prøverne. Envejs-variansanalyse (ANOVA) og Duncan-testen blev udført ved hjælp af Rsoftware (version 3.6.3) for at bestemme signifikansen af ​​hver sammenligning kl. niveauer af p < 0.05="" (*),="" p="">< 0,01="" (**)="" og="" p="">< 0,001="" (***).="" korrelationsanalyse="" blev="" udført="" under="" anvendelse="" af="" prism5.02="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca,="">

3. Resultater

3.1. Browning Index af lakridsekstrakter

Graden af ​​bruning aflakridsekstrakter er vist i figur 1a. Disse resultater bekræftede, at varmebehandlet ekstrakt (WH-130, 0.965 ± 0.025 AU [absorbansenheder]) havde meget højere bruningsindeksværdier end ikke-opvarmet ekstrakt (WC, 0,758 ± 0,005 AU). Vi forventer, at termisk behandling øger melanoidindannelsen i WH-130, og at denne ændring kan være forbundet med forskellige biologiske aktiviteter.

3.2. Samlet phenolindhold (TPC) af lakridsekstrakter

Figur 1b viser TPC forlakridsekstrakter. Vi fandt en forskel i TPC mellem WC og WH{{0}}, da WC havde en TPC på 12.093 ± 0,061 mg GAE/g ekstrakt, mens WH-130 havde en TPC på 14,098 ± 0,781 mg GAE/g ekstrakt. Varmebehandling øgede TPC af lakridsekstrakter.

3.3. Radikal-fjernende aktivitet af lakridsekstrakter

Detantioxidantaktivitet aflakridsekstrakter er vist i figur 1c,d. ABTS plus radikal-fjernende kapacitet var højere for WH-130 ekstrakt (6.086 ± 0.304 mg TEAC/geekstrakt) end WC ekstrakt (3.542) ± 0,093 mg TEAC/g ekstrakt). I DPPH-assayet blev en lignende tendens observeret. WH-130 (7,442 ± 0,292 mg TEAC/g ekstrakt)-ekstrakt viste større DPPH-radikalfjernende aktivitet end WC-ekstrakt (4,033 ± 0,160 mg TEAC/geekstrakt). Disse resultater indikerer, at opvarmning kan øge antioxidantaktiviteten af ​​ekstrakter.

3.4. Isoliquiritigenin Indhold af lakridsekstrakter

Resultaterne viste, at ISL-indholdet i WC steg markant efter varmebehandling (tabel 2, figur 2), hvilket indikerer, at termisk behandling kan påvirke indholdet af denneantioxidantoganti-melanogenesammensatte.

cistanche tubolosa

3.5. Cellelevedygtighed

Som vist i figur 3,lakridsekstrakter påvirkede ikke cellelevedygtighed ved 50 eller 100 µg/ml i forhold til den IBMX-behandlede kontrol. I 50 og 100 µg/mL behandlingerne af alle ekstrakter forblev cellelevedygtigheden større end 100 procent. Derfor blev yderligere eksperimenter udført med lakridsekstraktkoncentrationer på op til 100 µg/ml.

3.6. Effekter af lakridsekstrakter på melaninproduktion i B16F10 melanomceller

Pigmenteringen og melaninindholdet i B16F10-celler er vist i figur 4a,b. Melaninindholdet i B16F10-celler steg op til 3.4-fold med IBMX-behandling i forhold til den ubehandlede kontrol. WC og WH-130 viste signifikant nedsat pigmentering og melaninindhold sammenlignet med den IBMX-behandlede gruppe (figur 4a,b). Både WC og WH{{10}} udviste lavere melaninindhold end KA-behandlede celler. Den hæmmende virkning af melaninsyntese i B16F10-celler behandlet med WH-130 var større end WC. Mængden af ​​melanin til stede efter behandling med 100 µg/mL WC og WH-130 blev reduceret til henholdsvis ca. 0.59-fold og 0.51-fold af niveauet i de IBMX-behandlede group.ISL (10 µM) og KA (100 µg/mL) undertrykte melaninproduktionen til henholdsvis 0.59-fold og 0.67-fold af niveauet i IBMX-behandlede celler.

Dette resultat viser, at varmebehandletlakridsekstrakt (WH-130) kan hæmme melaninproduktionen mere effektivt end ikke-opvarmet ekstrakt (WC). Desuden observerede vi, at behandling med WH-130-ekstrakt ved 25, 50 og 100 µg/mL (figur 4c) resulterede i et koncentrationsafhængigt fald i melaninindholdet i B16F10-melanomceller. Tilsammen viser disse resultater, at opvarmning forbedredeanti-melanogeneaktivitet af lakridsekstrakt.

3.7. Virkninger af lakridsekstrakter på Tyrosinase-aktivitet

3.7.1. Svampe Tyrosinase aktivitet

Effekten aflakridsekstrakter af svampe-TYR-aktivitet er vist i figur 5a. Vi bekræftede, at virkningen af ​​ekstrakterne (WC og WH-130) på oxidationen af ​​substrater af svampe-TYR fandt sted under cellefrie forhold. Ved 50 µg/mL hæmmede WC-ekstrakt enzymaktiviteten til 81,33 procent, mens WH-130 undertrykte TYR-aktiviteten til 65,95 procent af EC-niveauet. I mellemtiden forårsagede kojinsyre (KA), en TYR-hæmmer, hæmning af enzymaktivitet til 47,09 procent af EC-niveauet. Hæmningen af ​​TYR-aktivitet var større i varmebehandlet lakrids (WH-130) end i ikke-opvarmet lakrids (WC).

3.7.2. Cellulær tyrosinaseaktivitet

Som vist i figur 5b steg TYR-aktiviteten af ​​IBMX-behandlede celler til 233 procent i forhold til den ubehandlede kontrol (100 procent). WC reducerede TYR-aktiviteten til 82,17 procent sammenlignet med den IBMX-behandlede gruppe. WH-130-ekstrakt hæmmede cellulær TYR-aktivitet til 59,88 procent sammenlignet med IBMX-behandlede celler. KA reducerede cellulær TYR-aktivitet til 74,07 procent af niveauet i IBMX-behandlede celler. Tilsammen viser disse resultater, at lakridsekstrakter (WC og WH-130) undertrykker TYR-aktivitet, og at WH-130 har mere potent TYR-hæmmende aktivitet end WC og KA.

Dernæst undersøgte vi sammenhængene mellem TPC, ISL-indhold,antioxidantaktivitet og anti-melanogen aktivitet (tabel 3). TPC var positivt korreleret med ISL-indhold (0.827) såvel som med ABTS plus og DPPH radikal-fjernende aktiviteter (henholdsvis 0.886 og 0.896), hvorimod TPC var omvendt korreleret med melaninindhold (–0.859). ISL-indholdet var positivt korreleret med ABTS plus og DPPH radikal-opfangende aktiviteter (henholdsvis 0.977 og 0.985), hvorimod ISL-indhold var omvendt korreleret med TYRactivity (–0. 834) og melaninindhold (–0.995). Antioxidantaktiviteter (ABTS plus og DPPH) var omvendt korreleret med TYR-aktivitet (henholdsvis –{{20}}.879 og –0.856) og melaninindhold (–0. henholdsvis 974 og –0,984). Disse resultater indikerer, at phenolforbindelser såsom ISL i lakrids er tæt forbundet med antioxidanten oganti-melanogeneaktiviteter af lakridsekstrakter.

3.8. Effekter af lakridsekstrakter på mRNA-ekspression af melanogenese-relaterede gener

Vi undersøgte ekspressionen af ​​melanogenese-relaterede gener i B16F10-celler for at belyse virkningerne af lakridsekstrakter på melanogenese. Både WC og WH-130 undertrykte mRNA-ekspressionen af ​​MITF, TYR, TRP-1 og TRP-2 (figur 6). WC hæmmede mRNA-ekspressionen af ​​MITF, TYR, TRP-1 og TRP-2 til niveauerne 0.{{10}}fold, 0.{ {12}}fold, 0.71-fold henholdsvis 0.65-fold af dem i IBMX-behandlede celler. WH-130 hæmmede mRNA-ekspressionen af ​​MITF, TYR, TRP-1 og TRP{{20}} til 0.43-fold, {{33 }}.60-fold henholdsvis 0.62-fold og 0.49-fold af de IBMX-behandlede gruppeniveauer. WH{{30}}-ekstrakt havde en stærkere hæmmende effekt på mRNA-ekspression end WC-ekstrakt. ISL undertrykte også udtrykket af MITF, TYR, TRP-1 og TRP-2 (0.42-fold, 0.59-fold, 0.68-fold og henholdsvis 0.44-fold i forhold til IBMX-behandlede celler). I den WH-130-behandlede gruppe var omfanget af faldet i mRNA-ekspression af melanogenese-relaterede gener større end i den WC-behandlede gruppe, hvilket indikerer, atlakridsekstrakter hæmmer melanogenese via undertrykkelse af transskriptionen af ​​melanogenese-relaterede gener, og at varmebehandling forbedreranti-melanogeneaktivitet af lakridsekstrakt.

3.9. Effekter af lakridsekstrakter på proteinekspression af melanogenese-relaterede gener

Som vist i figur 7b reducerede behandling med WC og WH-130 signifikant proteinekspressionsniveauerne for MITF, TYR, TRP-1 og TRP-2. Ekspressionsniveauer af MITF, TYR,TRP-1 og TRP-2 blev undertrykt i celler behandlet med WC (0.79-fold, 0.{{9 }}fold, {{10}}.89-fold og 0.67-fold henholdsvis i forhold til IBMX-behandlede celler). WH-130 viste reducerede proteinekspressionsniveauer af MITF, TYR, TRP-1 og TRP-2 ({{20}}.74-fold, {{24 }}.73-fold, henholdsvis 0.80-fold og {{30}}.48-fold i forhold til IBMX-behandlede celler) . ISL sænkede proteinekspressionsniveauerne for MITF, TYR og TRP-2 (henholdsvis 0.76-fold, 0.83-fold og 0.41-fold i forhold til IBMX-behandlet celler). WH-130 undertrykte proteinekspressionen af ​​melanogenese-relaterede gener kraftigere end WC, hvilket viste, atlakridsekstrakter hæmmer melanogenese via undertrykkelse af translationen af ​​melanogenese-relaterede gener, og at varmebehandling forbedreranti-melanogeneaktivitet af lakridsekstrakt.

hudblegning cistanche pulver

4. Diskussion

Resultaterne af denne undersøgelse viser, at varmebehandling aflakridspåvirker TPC, antioxidantaktivitet oganti-melanogeneaktivitet. WH-130 havde et højere bruningsindeks og TPC-værdier end WC. Forarbejdningsbetingelser, herunder temperatur og tryk, påvirker prøvernes bestanddele. [29]. Opvarmning kan fremme Maillard-reaktioner, som er forbundet med melanoidinproduktion [23]. Melanoidiner har nogle biologiske virkninger, bl.aantioxidant, antitumor og antihypertensive aktiviteter samt blodsukkermodulation [30]. Disse forbindelser er polymere brunfarvede makromolekyler dannet gennem Maillard-reaktionen fra interaktioner mellem sukkerarter og aminosyrer ved høje temperaturer [21]. Jo flere melanoidiner i opvarmet ekstrakt, jo højere bruningsindeks. Farven på ikke-opvarmet lakridsekstrakt (WC) viste lysebrun, men farven blev gradvist mørkere med høj temperatur (130 grader). Opvarmningsprocessen kan også inducere nogle ændringer i de kemiske strukturer af phenoliske forbindelser og forårsage nedbrydning af cellevægge i planter, frigivelse af phenoler, hvilket fører til antioxidantaktiviteter [31]. Fenolindholdet i lakridsekstrakter kan således stige ved varmebehandling [21]. Tidligere rapporter viste, at varmebehandling af honning øgede melanoidindannelsen, og graden af ​​brunfarvning faldt sammen med stigningen i antioxidantaktivitet [24]. Derfor viste WH-130 højere antioxidantkapacitet end WC i ABTS plus og DPPH radikal-fjernende assays, som er blevet brugt i vid udstrækning til at bestemme antiradikale aktiviteter af prøver baseret på kapaciteten til at overføre elektroner eller hydrogenatomer [32].

Den mest almindelige naturligeantioxidantog anti-melanogene forbindelser er phenoler. Tricin og 9-hydroxyoctadecadiensyre blev identificeret som de vigtigste phenoler i Sorghum bicolor. Derudover viste disse komponenter antioxidant- og anti-melanogene virkninger ved hæmning af tyrosinaseaktivitet [19]. Derudover er p-cumarsyre, en aktiv forbindelse af Sasa quelpaertensis Nakai, blevet bevist, at denne forbindelse kraftigt hæmmede tyrosinaseaktivitet og reducerede melaninproduktion i melanomceller [27]. Ifølge tidligere forskning udviser ISL, en velkendt flavonoidforbindelse i hydrolyseproduktet af lakridsrod [6-8], antioxidante og anti-melanogene aktiviteter ved hæmning af TYR-aktivitet, melanosomtransport og induktion af melanin-nedbrydning [10,31] Så vi fokuserede på ISL-indholdet af ekstrakterne og ISL's handling i melanogenese-relaterede mekanismer. ISL anvendes som et terapeutisk middel til mange sygdomme på grund af dets talrige biologiske aktiviteter, herunder antiinflammatoriske, antimikrobielle, antioxidative, anti-cancer, immunregulerende, leverbeskyttende og kardiobeskyttende virkninger [33]. I denne undersøgelse blev et højere ISL-indhold målt i WH-130 end i WC. Hudhyperpigmentering er relateret til oxidativ stress. Frie radikaler er blevet rapporteret at spille en vigtig rolle i at undertrykke hyperpigmentering [17,34]. Tilsammen viser disse resultater, at varmebehandling af lakrids kan forbedre dens radikal-fjernende aktiviteter oganti-melanogeneaktiviteter via stigende niveauer af antioxidant-phenolforbindelser såsom ISL. Ifølge tidligere litteratur er der glabrene, glabridin, glabrol, liquiritigenin i lakrids (Glycyrrhiza uralensis, G. glabra), der udviser tyrosinaseinhibering. Så disse forbindelser kan også have en indvirkning på anti-melanogene aktiviteter [10,11,15,35]. Yderligere undersøgelser af dem er vigtige for at belyse de anti-melanogene virkninger af lakrids.

Melaninsyntese reguleres af TYR, TRP-1, TRP-2 (dopachrome tautomerase) og MITF (figur 8). TYR, et kobberholdigt glycoprotein, fungerer som det hastighedsbegrænsende enzym og spiller en afgørende rolle i melaninproduktionen. TYR katalyserer hydroxyleringen af ​​tyrosin til 3,4-dihydroxyphenylalanin (DOPA). TYR katalyserer også oxidationen af ​​DOPA til dopaquinon og omdannelsen af ​​dopaquinon til dopachrome. Derefter omdannes dopachrom til dihydro-indolizin (DHI) eller indol 5,6-quinon-2-carboxylsyre (DHICA) [36-38]. På denne vej katalyserer TRP-2 omdannelsen af ​​dopachrome til DHICA, som oxideres af TRP-1 til dannelse af eumelanin. MITF er en specifik transkriptionsfaktor, der spiller en kritisk rolle i melanogenese som den vigtigste regulator af TYR, TRP-1 og TRP-2 ekspression (figur 8) [28,37]. Den kemiske inducer af melanogenese er 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), som øger TYR-aktiviteten gennem cAMP-signalvejen [13]. IBMX øger den intracellulære cAMP-koncentration ved at hæmme cAMP-phosphodiesterase. Stigningen i cAMP-niveauer aktiverer proteinkinase A (PKA), og aktiveret PKA forbedrer aktiviteten og ekspressionen af ​​cAMP-relateret bindingsprotein (CREB) [39]. CREB binder til MITF-promotoren, hvilket fører til opregulering af MITF-genekspression. Aktivering af MITF fremmer ekspressionen af ​​TYR og TRP'er [13,19]. Derfor resulterer nedregulering af MITF i hypopigmentering.

Opvarmet lakridsekstrakt (WH-130) hæmmede svampe-TYR og cellulær TYR-aktivitet mere effektivt end ikke-opvarmet lakridsekstrakt (WC). Hæmningen af ​​cellulær TYRaktivitet i lakridsekstrakter kan være forårsaget af nedregulering af TYR. Disse resultater er knyttet til melaninindholdet i B16F10 melanomceller. I B16F10-celler undertrykte WH-130-behandlinger IBMX-induceret melaninproduktion bedre end WC-behandling. Ydermere nedregulerede WH 130 transkriptionen og translationen af ​​melanogenese-relaterede markører (MITF, TYR, TRP-1, TRP-2) i B16F10-celler i højere grad end WC. Disse markører kan tilsammen bidrage til det overordnedeanti-melanogeneaktivitet [40].

Opvarmningen aflakridsekstrakt øgede overfloden af ​​antioxidante phenolforbindelser såsom ISL, og denne stigning var forbundet med øgetantioxidantaktiviteter (ABTS plus og DPPH). Opvarmet lakridsekstrakt (WH-130) udviste også øget hæmmende aktivitet af TYR og nedsat melaninsyntese. Der er en ny trend i udviklingen af ​​naturlige materialer på grund af potentialet for sikkerhed. Lakrids er blevet brugt i kosmetiske cremer til hyperpigmentering [41]. Vi demonstrerede potentialet i Wongam som en nyhudblegningmiddel til brug i kosmetik og verificeret, at varmebehandling kan forbedre dets potentiale.

Glycyrrhiza uralensis Fischer (lakrids) har antioxidant- og UV-fotobeskyttende aktiviteter i humane dermale fibroblaster [22]. Imidlertid skal undersøgelserne af sammenligning mellem Wongam (lakrids) og andre hjemmehørende arter udføres efterfølgende. Ydermere bør der udføres yderligere undersøgelser af de uidentificerede komponenter, såsom glabrene, glabridin, af Wongam forbundet med dets anti-melanogene virkning ved hjælp af egnede metoder. Det er nødvendigt at undersøge de synergistiske eller antagonistiske virkninger blandt phenolforbindelser efter analyse af bestanddele i lakridsekstrakt [40]. For at undersøge, hvordan disse stoffer virker påantioxidantog anti-melanogene mekanismer, hydrogenatomoverførsel eller enkeltelektronoverførselssystemer og mitogenaktiverede proteinkinasesignalveje bør evalueres [32,37].

5. Konklusioner

I denne undersøgelse undersøgte vi potentialet for ekstrakter af Wongam, en ny kultivar aflakrids, som enblegningmiddel til anvendelse i kosmetik og virkningen af ​​varmebehandling på deres bioaktivitet. Wongam-ekstrakter (WC og WH-130) viste høje radikal-opfangende aktiviteter og hæmmede melaninsyntese i IBMX-inducerede melanocytter ved at undertrykke aktiviteten af ​​TYR. Varmebehandling øgedeantioxidantog anti-melanogene aktiviteter af Wongam. Som et resultat viste WH-130 overlegen antioxidativ oganti-melanogeneaktiviteter end WC. Vores resultater tyder på, at varmebehandlet Wongam-ekstrakt (WH-130) er et stærkt pigmentreducerende middel med mulige anvendelser ved forskellige dermatologiske hyperpigmenteringslidelser, herunder brune pletter, fregner og melasma, og viser, at termisk behandling kan bruges til at forbedre anti-melanogen aktivitet af lakrids.

cistanche tubolosa fordele: hudblegning