Del 3: Effekter af Isorhamnetin på diabetes og dets tilknyttede komplikationer: En gennemgang af in vitro og in vivo undersøgelser og en post hoc transkriptomanalyse af involveret molekylær vej

For mere info. kontakttina.xiang@wecistanche.com

5. En post hoc transkriptomanalyse forudsiger den potentielle effekt af Isorhamnetin på diabetes i et stamcellebaseret værktøj

Vi har etableret et stamcelle-baseret værktøj ved hjælp af en perinatalstamcelle, humane amniotiske epitelceller (hAEC'er), for at evaluere bioaktiviteterne af naturlige forbindelser ved at anvende hel-genom mikroarray-analyse [71,140-144]. I de senere år er et stadigt større antal bioaktive forbindelser i lægeplanter blevet screenet for deres potentielle terapeutiske og forebyggende virkninger. I denne sammenhæng får stamcellebaserede tilgange ved hjælp af humane pluripotente stamceller (hPSC'er) stor opmærksomhed som fysiologisk mere relevante in vitro humane modeller til lægemiddelscreening og validering af tusindvis af forbindelser i både akademisk forskning og den farmaceutiske industri[{{4} }]. Imidlertid har hPSC'er, herunder embryonale stamceller (hESC'er) og inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er), begrænsede celleressourcer, kræver invasive ekstraktionsprocedurer, dyr celleomprogrammering og kritiske vedligeholdelsesprocedurer, samt udgør etiske begrænsninger, og derfor er mindre gunstige som praktisk kilde til lægemiddelscreening. På den anden side er hAEC'er afledt af kasseret term placenta, et medicinsk affaldsprodukt. De kræver ikke invasive høstprocedurer og har minimale etiske bekymringer. Ydermere er hAEC'er afledt af de pluripotente epiblaster og opretholder således ESC-lignende multilineage differentieringspotentiale og kan differentieres til celler fra alle tre kimlag [148-151].

Det er værd at bemærke, at efter passende differentieringsprotokol kan hAEC'er differentieres til hepatocytlignende celler [152-155], cholangiocytter [156] og, vigtigst af alt, pancreaslignende insulinproducerende celler[157-160 ]. Transplantation af hAEC-inducerede pankreatiske celler til streptozotocin-inducerede diabetiske mus kunne normalisere blodsukkerniveauet [161]. hAECs [162], såvel som exosomer afledt af hAECs [163], kunne accelerere diabetisk sårheling ved at fremme angiogenese og fibroblastfunktion og reducere inflammation. Inkorporering af hAEC'er i ø-organoider [164] og afskærmning af native øer med et lag af hAEC'er [165] kunne forbedre ø-engraftment og revaskularisering i diabetiske musemodeller. Derudover er hAEC-afledte hepatocytlignende celler, såvel som hAEC selv, blevet rapporteret at have terapeutisk effekt ved leversygdomme, herunder hepatisk fibrose [166.167], cirrhose [168] og leversvigt [169].

I betragtning af den komplekse patofysiologi af DM er hAEC muligvis ikke en ideel in vitro-model til at studere de antidiabetiske virkninger af forbindelser. Men på grund af dets stamcellelignende egenskaber kan det bruges til den indledende screening af målforbindelser. Vi har tidligere undersøgt det antifibrotiske [71] og hepatisk differentierings-inducerende [170] potentiale af isorhamnetin i hAEC'er. I denne undersøgelse har vi udført en målrettet sekundær analyse af vores tidligere publicerede data [71] for at udforske de potentielle funktionaliteter af isorhamnetin idiabetes(Figure 4). Data analysis was conducted for three biological replicates of day 10 control (n = 3) and isorhamnetin-treated (n =3) hAECs. The cells were grown in 3D cell culture. Control cells were maintained in placental basal epithelial cell medium(Promo Cell, Cat.#C-26140)in absence of any differentiation medium or growth factors, whereas treatment cells were supplemented with 20 mM of isorhamnetin (Sigma-Aldrich, Japan) for 10 days. Differentially expressed genes (DEGs) are referred to as genes with a linear fold change>2 og p-værdi<0.05(one-way between-subjects="" anova).="" a="" total="" of="" 303="" degs="" were="" identified;="" among="" them,="" 60="" were="" upregulated="" and="" 243="" were="" downregulated.="" details="" of="" methodology="" have="" been="" explained="" elsewhere="" [71,170].="" all="" microarray="" data="" are="" available="" at="" gene="" expression="" omnibus(geo)="" under="" accession="" number:="" gse153149="" (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc="GSE153149,accessed" on="" 24="" november="">

Klik her for at lære flere produkter

5.1. Celletypesignaturgensæt

I vores tidligere undersøgelser af hAEC'er fandt vi ud af, at forskellige typer forbindelser kunne styre differentieringen af ​​hAEC'er mod forskellige cellelinjer, såsom en koffeinsyreester, rosmarinsyre [142] og et caffeoylquinsyrederivat3,4,5- Tri-O-Caffeoylquinic Acid (TCQA)[140], som kunne øge neural celledifferentiering, hvorimod en anthocyanin, cyanidin-3-O-glucosid(Cy3G), inducerede adipocytdifferentiering [143] i hAEC'er. Vi observerede, at bioaktiviteterne eller funktionaliteterne af naturlige forbindelser generelt kunne forudsiges ud fra de berigede celletyper af DEG'erne.

Vi undersøgte de signifikant berigede celletypesignaturdatasæt ved hjælp af Molecular Signatures Database (MSigDB) ver. 7.4 af GSEA online-software (https://software. broadinstitute.org/gsea/index.jsp; tilgået den 26. november 2021)[171]. Disse gensæt indeholder klyngemarkørsignaturgener for celletyper identificeret i enkeltcelle-sekventeringsundersøgelser af humant væv og letter celletypetildelingerne i datasæt, såsom eksperimenter med udvikling af organoide modeller.

Vi fandt ud af, at det mest signifikant berigede celletype gensæt var pancreas mesenchymale stromale celler [172] (figur 4A). Derudover blev pancreas duktale og endotelcelletyper signifikant beriget [172]. Pancreas signaturgener i isorhamnetin-behandlede hAEC'er er involveret i epitel-mesenchymal overgang, TGF-signalering, TNF-signalering via NF-kB, KRAS-signalering og fedtsyremetabolisme. Adskillige hepatiske signaturgensæt blev også signifikant beriget, såsom HSC'er, kupffer-celler, galdekanalceller [173] og føtale lever mesothelceller [174]. Der var også flere signifikant berigede skeletmuskelsignaturgensæt, herunder fibrillin1 plus fibro-adipogene progenitor (FBN1 plus FAP) celler, fibro-adipogene progenitor (FAP) celler og skeletmuskel pericytter [175]. De biologiske funktioner af hepatiske signaturgener i isorhamnetin-behandlede hAEC'er inkluderer adskillige inflammatoriske reaktionsveje, hvorimod skeletmuskulaturens signaturgener regulerer sårheling, kollagenfibrillers organisation og MAPK-kaskade. Signifikans blev målt som den falske opdagelsesrate, en analog af hypergeometrisk p-værdi efter Benjamini og Hochberg-korrektion for multiple hypotesetest (FDR q-værdi)<>

5.2. Betydeligt berigede kendetegnsgensæt

Dernæst undersøgte vi de signifikant berigede kendetegnsgensæt på MSigDB (hentet den 26. november 2021). Hallmark-gensæt repræsenterer specifikke, veldefinerede biologiske tilstande eller processer, der er genereret baseret på identifikation af gensæt-overlapninger og fastholdelse af gener, der viser sammenhængende ekspression. Kendetegnene har en samling af 50 gensæt kondenseret fra over 4000 overlappende gensæt og har således reduceret støj og redundans [176].

Signifikant berigede kendetegnsgensæt inkluderer gener, der definerer epitel-mesenkymal overgang, gener opreguleret som reaktion på hypoxi, gener reguleret af NF-kB som reaktion på TNF, gener op- og nedreguleret af KRAS-aktivering, gener, der medierer apoptose ved aktivering af caspaser, gener involveret i myogenese, gener opreguleret som respons på TGF- 1, gener opreguleret af STAT5 som respons på IL-2-stimulering, gener der definerer inflammatorisk respons, gener involveret i p53-veje og netværk og gener der koder for proteiner involveret i glykolyse og gluconeogenese (figur 4B). Signifikans blev betragtet ved FDR q-værdi<>

Et interessant fund er berigelsen af ​​KRAS-aktivering af DEG'erne af de isorhamnetin-behandlede hAEC'er. Adskillige KRAS-inducerede genekspressioner viste sig at være signifikant nedreguleret af isorhamnetin, såsom MMP9, TSPAN1 og ITGBL1. Hyperglykæmi udløser genomisk ustabilitet, der fører til KRAS-mutationer i bugspytkirtelceller [177] og er også blevet forbundet med øget risiko og invasivitet af bugspytkirtel [178] og tyktarmskræft [179]. Wang et al. rapporterede, at isorhamnetin undertrykker proliferationen af ​​pancreas-adenokarcinomcellelinje PANC-1 gennem nedregulering af Ras/MAPK-signalvejaktivitet [134]. Derfor, som nævnt i afsnit 4.2.4, er effekten af ​​isorhamnetin på den KRAS-inducerede risiko for cancere ved diabetes, især pancreascancer, værd at undersøge nærmere.

5.3. Betydeligt berigede stier

Yderligere pathway-analyse af DEG'erne blev udført ved hjælp af Comparative Toxicogenomics Database (CTD) (http://ctdbase.org/; adgang til den 29. november 2021)[180]. CTD repræsenterer Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) og REACTOME pathways. Vi fandt, at flereinflammatoriskveje, kollagendannelse og samling, PI3K-Akt-signalvej og AGE-RAGE-signalvej i diabetiske komplikationer blev signifikant beriget (figur 4C).

Avancerede glykeringsslutprodukter (AGEs) produceres gennem den ikke-enzymatiske glykering og oxidation af proteiner, lipider og nukleinsyrer. Receptorerne for avancerede glykeringsslutprodukter (RAGE) tilhører immunglobulinsuperfamilien. AGE/RAGE-signalering er en kompleks og indviklet kaskade, der aktiverer flere intracellulære signalveje, der involverer proteinkinase C, NADPH-oxidase og MAPK'er, hvilket resulterer i NF-kB-induceret ekspression af IL-1, IL-6, TNF-, VCAM-1 og VEGF. Især AGE/RAGE-signalering er blevet impliceret i diabetes-medieret vaskulær forkalkning gennem aktivering af TGF-medieret fibrose-, NFkB- og ERK1/2-veje [181-184]. Vi fandt ud af, at isorhamnetin signifikant reducerede AGE/RAGE-signalrelateret genekspression, såsom COL1A1, COL1A2, COL4A6, FN1, MMP2 og SERPINE1. Som diskuteret i det tidligere afsnit er isorhamnetins antifibrotiske virkninger blevet veldokumenteret [71,74,99,119], og derfor kan det hævdes, at isorhamnetin også kan have gavnlige virkninger i diabetes-induceret vaskulær patologi.

5.4. Betydeligt berigede stofskiftesygdomme og relaterede genudtryk

Kurerede gen-sygdomsassocieringsdata blev hentet fra CTD (hentet den 29. november 2021). Vi kurerede kun væsentligt berigede stofskiftesygdomme. Betydningen af ​​berigelse blev beregnet ved den hypergeometriske fordeling justeret ved Bonferroni-metoden. Signifikant berigede metaboliske sygdomme inkluderede DM, glucose og lipidmetabolismeforstyrrelser, hyperglykæmi og fedme (figur 4D). Heatmap viser, at PPAR'er, TGF'er, TNF'er, IL'er, kollagen og apoptose-inducerende genekspressioner blev signifikant nedreguleret i isorhamnetin-behandlede hAEC'er (Figur 4E). På den anden side blev insulinreceptorer, lipoproteinlipaser og apoptoseinhibitorer signifikant opreguleret i isorhamnetin-behandlede hAEC'er.

Vores målrettede mikroarray-dataanalyse af isorhamnetin-behandlede hAEC'er bekræftede også isorhamnetins potentiale til at regulere biologiske funktioner relateret til DM og dets tilknyttede komplikationer.

6. Biotilgængelighed og intestinal absorption af Isorhamnetin Aglycone og dets glycosylerede derivater

Med tilstedeværelsen af ​​forskellige kategorier afflavonoideri naturen er det interessant at analysere tilstedeværelsen af ​​disse forbindelser i kroppen. Når vi taler om metabolismen af ​​isorhamnetin og dets tilgængelighed i den menneskelige krop efter indtagelse, taler vi om oprindelsen, metabolismen og transporten. Dette er baseret på en observation foretaget ved kromatografi af nogle flavonoider såsom flavonoler i humant serum. Væskekromatografi-massespektrometri giver indsigt i biotilgængeligheden af ​​visse flavonoider i deres aglycon- og glykosidformer i kroppen [49]. Massespektrometri kan bruges til at bestemme flavonoider i biologiske prøver [185]. En undersøgelse rapporterede 23 blandede sulfat-, methyl-, glucuronid- og glucosederivater afquercetini både urin og plasma fra menneskelige frivillige 1 time efter indtagelse af let stegte rødløg. Denne undersøgelse påviste glykosider af både quercetin og isorhamnetin i plasma [186].

Flere faktorer spiller en rolle i tilførsel af næringsstoffer gennem fordøjelseskanalen. For eksempel påvirker enzymer fra tarmmikrobiotaen indtrængen af ​​phenolforbindelser.

En undersøgelse udført på ginkgobladekstrakterne i en musemodel viste betydningen af ​​tarmmikrobiota på biotilgængeligheden og absorptionen fra mave-tarmkanalen af ​​nogle bioaktive molekyler, især isorhamnetin [187]. I dette trin producerer enzymer af tarmmikrobiotaflavonoidaglyconer og en række forskellige ringfissionsprodukter. Analyser af fuldblodsprøverne indikerede, at optagelsen af ​​isorhamnetin blev øget ved antibakteriel behandling, hvilket tyder på, at tarmmikrobiotaenzymer har en negativ effekt på farmakokinetikken af ​​naturlige molekyler, såsom isorhamnetin.Antibakterieleller probiotisk forbrug kan øge biotilgængeligheden af ​​glykosidformen af ​​isorhamnetin. Derudover var in vitro-biotransformationshastighederne og opholdstiderne for bioaktive molekyler forskellige mellem normale, diabetiske og diabetiske nefropatirotter [188].

På den anden side styrer forskellige membrantransportører transporten af ​​flavonoider, såsom den natriumafhængige glucosetransporter 1(SGLT1) og de multilægemiddelresistensassocierede proteiner 2 og 3 (MRP2 og MRP3)[189]. I denne sammenhæng regulerer MRP-transportører de transcellulære og paracellulære transportveje for isorhamnetin [190]. Inde i celler var transporten af ​​isorhamnetin fra apikalen til basalsiden 6.8-9.3-fold højere. I figur 5 er de antidiabetiske virkninger af isorhamnetin opsummeret.

7. Konklusioner

Isorhamnetin er en phenolforbindelse af flavonoidfamilien, mere præcist af flavonolerne. Oprindeligt er det et quercetin-molekyle, men har gennemgået methylering. Isorham-netin er fordelt i planteriget i mange vilde og kosmetiske planter. Derudover producerer flere lægeplanter dette molekyle, og adskillige undersøgelser har bevidnet dets anti-diabetiske virkning blandt andre biologiske aktiviteter. Alle disse data viser således isorhamnetins interesse i den terapeutiske industri. Fra dette perspektiv ville det være meget interessant at udforske effekten af ​​isorhamnetin og dets derivater, isoleret især fra naturressourcer, på metaboliske lidelser. Det er også nødvendigt at fremhæve og gennemgå de kliniske undersøgelser, der er udført i denne sammenhæng med brug af flavonoidrige fraktioner og naturlige produkter for at undgå virkningen af ​​bivirkninger forårsaget af syntetiske og kemiske lægemidler.

Referencer

1. Gill, SS; Tuteja, N. Reaktive oxygenarter og antioxidantmaskineri i abiotisk stresstolerance i afgrødeplanter. Plante Fysiol. Biochem. 2010, 48, 909-930. [CrossRef] [PubMed]

2. Corpas, FJ; Gupta, DK; Palma, JM Produktionssteder for reaktive oxygenarter (ROS) i organeller fra planteceller. I reaktive iltarter og oxidativ skade i planter under stress; Springer: Berlin/Heidelberg, Tyskland, 2015; s. 1-22.

3. Falleh, H.; Oueslati, S.; Guyot, S.; Dali, AB; Magné, C.; Abdelly, C.; Kouri, R. LC/ESI-MS/MS karakterisering af procyanidiner og propelargonidiner, der er ansvarlige for den stærke antioxidantaktivitet af den spiselige halofyt Mesembryanthemum edule L. Food Chem. 2011, 127, 1732-1738. [CrossRef]

4. Trabelsi, N.; Oueslati, S.; Falleh, H.; Waffo-Téguo, P.; Papastamoulis, Y.; Mérillon, J.-M.; Abdelly, C.; Ksouri, R. Isolering af kraftfulde antioxidanter fra den medicinske halofyt Limoniastrum guyonianum. Food Chem. 2012, 135, 1419-1424. [CrossRef] [PubMed]

5. Boulaaba, M.; Mkadmini, K.; Tsolmon, S.; Han, J.; Smaoui, A.; Kawada, K.; Ksouri, R.; Isoda, H.; Abdelly, C. In vitro antiproliferativ effekt af Arthrocnemum Indicum ekstrakter på Caco-2 cancerceller gennem cellecykluskontrol og relateret phenol LC-TOF-MS identifikation. Evid.-baseret komplement. Altern. Med. 2013, 2013, 529375. [CrossRef]

6. Karker, M.; De Tommasi, N.; Smaoui, A.; Abdelly, C.; Ksouri, R.; Braca, A. Nye sulfaterede flavonoider fra Tamarix Africana og biologiske aktiviteter af dets polære ekstrakt. Planta Med. 2016, 82, 1374-1380. [CrossRef]

7. Bourgou, S.; Rebey, IB; Mkadmini, K.; Isoda, H.; Kouri, R.; Kouri, WM LC-ESI-TOF-MS og GC-MS profilering af Artemisia urte og evaluering af dets bioaktive egenskaber. Food Res. Int. 2017, 99, 702-712. [CrossRef]

8. Boulaaba, M.; Medini, F.; Hajlaoui, H.; Mkadmini, K.; Falleh, H.; Kouri, R.; Isoda, H.; Smaoui, A.; Abdelly, C. Biologiske aktiviteter og fytokemisk analyse af phenolekstrakter fra Salsola kali L. Endogene faktorers rolle i udvælgelsen af ​​de bedste planteekstrakter. S. Afr. J. Bot. 2019, 123, 193-199. [CrossRef]

9. Najjar, H.; Abdelkarim, BA; Doria, E.; Boubakri, A.; Trabelsi, N.; Falleh, H.; Tlili, H.; Neffati, M. Fenolsammensætning af nogle tunesiske lægeplanter forbundet med en anti-proliferativ virkning på humane brystkræft MCF-7-celler. EuroBiotechnol. J. 2020, 4, 104-112. [CrossRef]

10. Bourgou, S.; Bettaieb Rebey, I.; Ben Kaab, S.; Hammami, M.; Dakhlaoui, S.; Sawsen, S.; Msaada, K.; Isoda, H.; Ksouri, R.; Fauconnier, M.-L. Grønt opløsningsmiddel til at erstatte hexan med bioaktive lipider-ekstraktion fra sort spidskommen og basilikumfrø. Foods 2021, 10, 1493. [CrossRef]