Del 2: Bioaktive forbindelser fra Ephedra Fragilis: Ekstraktionsoptimering, kemisk karakterisering, antioxidant- og antiglykationsaktiviteter
Mar 26, 2022
For mere info. kontakttina.xiang@wecistanche.com
2.7.Antiglykationsaktivitet
2.7.1.UV-synlig analyse
UV-vis spektret er en hurtig, konsistent og enkel teknik, der almindeligvis bruges til at detektere proteinkonformationelle ændringer og kompleks dannelse. Absorptionsspektrene for nativ og glykeret BSA inkuberet i 15 dage i nærvær eller fravær af CEE/fraktioner samtquercetin(positiv kontrol) er vist i figur 3A.
Det blev tydeligt vist, at den native BSA udviser en karakteristisk top ved 入2s0 nm, hvilket mest skyldes de aromatiske aminosyrer, herunder tyrosin, tryptophan og phenylalanin [47].
Efter modifikation med glucose var absorbansen ved λ280 nm 60,57 procent mere hyperkrom end nativ BSA. Den øgede absorptionsintensitet ved 入2s0 nm kan tilskrives den glycation-inducerede udfoldning af proteinhelixen, hvilket kan påvirke dens normale fysiologiske funktion.
Treatment with CEE/fractions reduced significantly the absorbance at入2so nm compared to glycated BSA, and this reduction varied markedly between fractions according to the solvent polarity. Overall, descending antiglycation activity was portrayed as EAF>WBF>DMF>CCE>WF>HE, som var 1.82,1.71,1.57,1.35,1.28 og 1.13-fold lavere end glyceret BSA. Ikke desto mindre var denne aktivitet markant lavere end forquercetinbruges som en positiv kontrol (2.24-fold lavere end glykeret BSA). Så det kan klart konkluderes ud fra absorptionsundersøgelser, at EAF fra E.fragilis har en beskyttende virkning mod BSA-udfoldelse induceret af proteinglykering.
2.7.2. Inhibering af proteinglykation i BSA-Glu-modellen
AGE'er er en heterogen gruppe af forbindelser med fluorescensegenskaber ved λ440 nm, når de exciteres ved ± 370 nm. Evnen af CEE og dets forskellige fraktioner fra E. fragilis til at inhibere AGEs-dannelse blev evalueret ved hjælp af BSA-glucoseassayet, og resultaterne er vist i figur 3B.
Som det fremgår af figur 3B, udviste AGEs inhiberingshastigheden for alle testede prøver en opadgående tendens med stigningen i koncentrationer. Ved 1 mg/ml hæmmede CCE, HE, DME EAE, WBF, WF og quercetin AGEs-dannelsen med henholdsvis 53.26,39.83,54.82,76.68,69.09.48.83 og 97.84 procent efter inkubation, hhv. i 15 dage. EAF(ICs =0.375±0.034 mg/mL) var den mest effektive AGEs-hæmmer blandt alle fraktioner, efterfulgt af WBF, DMF, CCE og WF med IC5 0 værdier af 0.595 ± {{30}}.047, 0,857 ± 0,018, 0,951 ± 0,099 og 1,044± 0,032 mg/ml, hhv. HF viste den svageste aktivitet med ICso-værdien på 1,212±0,063 mg/ml.
Den højeantiglykeringpotentialet for EAF kan skyldes den høje mængde af phenol- og flavonoidindhold, som er blevet beskrevet som meget gode hæmmere af AGEs-dannelse [48]. Højere antiglykering af EAF af Liquidambar formosana Hance bladekstrakt blev også rapporteret af Zhang et al. [31] sammenlignet med dets dichlormethan-, n-butanol- og vandfraktioner.
Som angivet i tabel 5 var AGEs-hæmning stærkt korreleret på en positiv måde til både TF(r=0.950;p<0.01)and tp(r=""><0.01)contents, which="" were="" in="" line="" with="" previously="" reported="" studies="" [2,29].="" the="" ages="" inhibition="" was="" also="" correlated="" in="" a="" positive="" way="" to="" dpph",abts,h2o2,reducing="" power,="" tac,andβ-carotene="" assays="" withr="">
r=0.914,r=0.983, r=0.975,r=0.923,og r=0.963 (s.<0.01),respectively. these="" reflected="" that="" ages="" inhibition="" is="" linked="" to="" the="" efficiency="" of="" primary="" antioxidants="" [6].="" kaewseejan="" and="" siriamornpun="" [29]="" also="" reported="" that="" phenolic="" compounds="" prevented="" the="" formation="" of="" ages="" through="" its="">fjernelse af frie radikalerogantioxidantkapaciteter.
2.7.3. Virkninger på glycation-induceret proteinoxidation
Glykering af proteiner (Maillard-reaktion) er en reaktion startet af den kovalente binding af reducerende sukker til en aminogruppe af proteiner (hovedsageligt lysin- og argininrester), som fører til fremstilling af et ustabilt og reversibelt produkt, dvs. Schiffs base, der yderligere gennemgår Amadori-omlejring. at danne mere stabile ketamins navngivne Amadori-produkter. Efterfølgende gennemgår Amadori-produkter en endiol-reaktion for at producere carbonylerede proteiner [48]. Nedbrydningen af denne ketamin kunne genererefrie radikalersåsom superoxidradikaler, som yderligere omdannes til HO·via Fenton-reaktion, hvilket forårsager oxidativ og cellulær skade [49].
Protein oxidation is accompanied by carbonyl protein formation and loss of protein thiols, which are often employed as protein oxidation indicators[50]. As given in Figure 3C, the level of carbonyl content in native BSA was 1.16±0.04 nmol/mg protein, which was increased to more than 3.62-fold (4.21 ± 0.10 nmol/mg protein) upon glycation. The treatment with CEE and its various fractions reduced the level of carbonyl content with the increase of samples concentrations ranging from 0.1 to 1 mg/mL. Furthermore, the inhibition effect of quercetin on the formation of carbonyl proteins was stronger than that of all fractions at every concentration point. When the concentration was 1 mg/mL, CEE, HF, DMF, EAF, WBF, WF, and quercetin decreased the level of carbonyl content by 42.29, 17.37,58.68,73.44,69.17,28.84,and 98.68%, respectively, compared to native BSA. Overall descending, the inhibition of carbonyl content formation was portrayed as Q>EAF>WBF >DMF > CCE> WF >HF.
Virkningerne af CEE/fraktioner på glycation-induceret proteinthioloxidation er vist i figur 3D. I naturligt BSA var niveauet af proteinthiol 1.06± 0.086nmol/mg protein, hvilket blev reduceret med mere end tre gange(0 0,34±0,021 nmol/mg protein) i glyceret protein. I nærvær af CEE/fraktioner var niveauet af thiolgruppen signifikant forøget på en dosisafhængig måde i området fra 0,1 til 1 mg/ml. Desuden steg niveauet af proteinthiol i følgende rækkefølge: HF<><><><>
Lignende resultater blev observeret i planten Teucrium polium, da EAF var mere effektiv end de andre fraktioner (diethylether og vandfraktioner) mod glycation-medieret proteinoxidation[51]. I deres undersøgelse rapporterede Golshahi og Bahramikia [52] også lignende resultater ved brug af flere opløsningsmidler med stigende polaritet (diethylether og vand) i spaltningen af en lægeplante Trachyspermum copticum. Ifølge disse forfattere har EAF den mest potente beskyttende effekt mod glycation-medieret proteinoxidation, fjernt efterfulgt af diethylether og vand. Dette viser tilstedeværelsen i EAF af sådanne forbindelser, der kan have en forebyggende virkning mod hyperglykæmi-inducerede oxidative skader på protein, som menes at forekomme under glycoxidationsprocesserne ved at reducere proteincarbonyldannelse og beskytte proteinthioler mod oxidation som antydet af data.
2.8.Identificerede phenoliske forbindelser i EAF
EAF, som viste den højeste biologiske aktivitet fra andre fraktioner, blev udvalgt til identifikation af dets vigtigste bioaktive forbindelser ved RP-HPLC. Et samlet antal på seks forbindelser blev identificeret ved at sammenligne deres retentionstid med referencestandardernes. De identificerede phenoliske forbindelser er præsenteret i figur 4. Galliske, vanilliske, koffeinsyrer og ferulsyrer blev identificeret som phenolsyrer, hvorimod kun to forbindelser, nemlig rutin og quercetin, blev identificeret som flavonoider. Ifølge en undersøgelse af Soumaya et al. [53], ferulinsyre, luteolin-7-O-glucosid, myricetin og kaempferol 3-O-rutinosid blev identificeret som til stede i EAF i luftdele af tunesisk E.fragilis, hvorimod tilstedeværelsen af rutin , quercetin, gallussyre og koffeinsyre blev kun påvist for første gang i vores undersøgelse. Forskellen i den kemiske sammensætning af EAF opnået fra den samme planteart kan variere i forskellige dele af en plante, planteudviklingsstadiet, vækstbetingelserne (f.eks. jord, lys, temperatur, vand, fugtighed og gødning). høsttid, tørresystemet og ekstraktionsproceduren [54]. De opnåede resultater fra den fytokemiske fingeraftryksprofil viste et godt væld af E.fragilis, der havde adskillige phenolforbindelser, der anses for at være væsentlige bidragydere til frie radikalers opfangning og antioxidantaktiviteter [55]. Derudover er disse forbindelser kendt for deres kraftige antiglykeringsevne [48]. Adskillige undersøgelser har afsløret den direkte forbindelse mellem phenolforbindelsernes antioxidantaktiviteter og deres antiglykeringsevne.
2.9. Molekylær docking-undersøgelse af identificerede forbindelser
For klart at visualisere den detaljerede mekanisme, hvorved de identificerede forbindelser i EAF fra E. fragilis binder til BSA og RAGE, udførte vi en molekylær docking-undersøgelse. Docking-resultater er præsenteret i tabel 6, mens interaktioner mellem den mest aktive forbindelse og mål er vist i figur 5. Resultaterne viste, at quercetin passede tæt ind i bindingsstedet, lokaliseret i det hydrofobe hulrum af subdomæne IB af BSA med den laveste bindingsenergi af{ {2}}.7 kcal/mol (figur 5A). I modsætning hertil blev der opnået mindre bindingsenergi med ferulinsyre, vanillinsyre, koffeinsyre, gallussyre og rutin (-6.35,{{7} }.05, -5.84,-5.25 og -4.41 kcal/mol, henholdsvis). Normalt er en høj grad af negativitet af bindingsenergi mere effektiv, og forbindelsen vil blive brugt til at kontrollere glykeringsprocesserne. Fra figur 5B er det klart, at quercetin danner otte hydrogenbindinger med SER109, ASP111, LEU112, LEU115, ARG144, ARG185 og ARG458 af BSA, og fire hydrofobe interaktioner medieret af de alifatiske aminosyrer (L41PRO1410, L4RG14310, L4RG14310 og L4G1414,4) . Også fire aminosyrer (ASP108, HIS145, LEU189 og LEU462) omkring quercetin interagerede via van der Waals kræfter. Det er blevet rapporteret, at lysin og arginin er de vigtigste aminosyrerester involveret i glykeringsprocessen [56]. Derfor kunne maskeringen af quercetin til lysin- og argininrester være en af E. fragilis' mulige mekanismer til at inhibere proteinglykering i et indledende stadium.
![. The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively. Engagement of AGEs products with RAGE are known to trigger, through ROS formation via NADPH oxidase and mitochondria [57], the activation of multiple intracellular signaling pathways (including JAK/STAT, phosphoinositol-3 kinase, rho GTPases, SAPK/JNK MAP kinases, p38 and erk1/2 (p44/p42) MAP kinases), and culminating in the activation of the NF-κB transcription factors [58], leading to the pathogenesis of diabetes and aging-associated disorders [5]. Therefore, blocking the AGEs–RAGE interactions can repress stress-provoking signals transduction, which is considered a therapeutic strategy of inhibiting glycation at a later stage. Docking results with RAGE, as shown in Table 6, proved that gallic acid has the highest docking score (ΔG= −6.8 kcal/mol) in comparison to those of vanillic acid, ferulic acid, caffeic acid, quercetin, and rutin (−6.68, −5.94, −5.89, −5.58 and −4.89 kcal/mol, respectively). Moreover, 2D modeling of gallic acid and RAGE showed that gallic acid formed five conventional hydrogen bonds with CYS38, GLY40, ALA41, LYS43, and SER83 of RAGE (Figure 5C,D). Also, LYS37 and LYS43 were responsible for the hydrophobic interactions of gallic acid with RAGE. Five amino acids surrounding gallic acid (GLU32, LYS39, PRO42, ASN81, and GLY82) were attached by van der Waal's forces, thereby stabilizing the gallic acid-RAGE complex by providing a strong cohesive environment. In summary, the current study has shown the efficient interaction of certain bioactive compounds in the EAF of E. fragilis with the target proteins of BSA and RAGE. E. fragilis could be a source of potential competitors to glucose and AGEs, which might resist their binding towards BSA and RAGE, respectively, and therefore reducing the subsequent development of oxidative stress and inflammation (Figure 6). Figure 5. The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively](/Content/uploads/2022842169/202203241046127d567c69ab264671b6814abd1b4544c7.png ". The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively. Engagement of AGEs products with RAGE are known to trigger, through ROS formation via NADPH oxidase and mitochondria [57], the activation of multiple intracellular signaling pathways (including JAK/STAT, phosphoinositol-3 kinase, rho GTPases, SAPK/JNK MAP kinases, p38 and erk1/2 (p44/p42) MAP kinases), and culminating in the activation of the NF-κB transcription factors [58], leading to the pathogenesis of diabetes and aging-associated disorders [5]. Therefore, blocking the AGEs–RAGE interactions can repress stress-provoking signals transduction, which is considered a therapeutic strategy of inhibiting glycation at a later stage. Docking results with RAGE, as shown in Table 6, proved that gallic acid has the highest docking score (ΔG= −6.8 kcal/mol) in comparison to those of vanillic acid, ferulic acid, caffeic acid, quercetin, and rutin (−6.68, −5.94, −5.89, −5.58 and −4.89 kcal/mol, respectively). Moreover, 2D modeling of gallic acid and RAGE showed that gallic acid formed five conventional hydrogen bonds with CYS38, GLY40, ALA41, LYS43, and SER83 of RAGE (Figure 5C,D). Also, LYS37 and LYS43 were responsible for the hydrophobic interactions of gallic acid with RAGE. Five amino acids surrounding gallic acid (GLU32, LYS39, PRO42, ASN81, and GLY82) were attached by van der Waal's forces, thereby stabilizing the gallic acid-RAGE complex by providing a strong cohesive environment. In summary, the current study has shown the efficient interaction of certain bioactive compounds in the EAF of E. fragilis with the target proteins of BSA and RAGE. E. fragilis could be a source of potential competitors to glucose and AGEs, which might resist their binding towards BSA and RAGE, respectively, and therefore reducing the subsequent development of oxidative stress and inflammation (Figure 6). Figure 5. The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively")
Engagement af AGEs-produkter med RAGE er kendt for at udløse aktiveringen af flere intracellulære signalveje (herunder JAK/STAT, phosphoinositol-3-kinase, rho GTPaser, SAPK/INK gennem ROS-dannelse via NADPH-oxidase og mitokondrier [57] MAP-kinaser, p38 og erk1/2 (p44/p42) MAP-kinaser), og kulminerer i aktiveringen af NF-kB-transkriptionsfaktorerne [58], hvilket fører til patogenesen af diabetes og aldringsassocierede lidelser [5]. Derfor kan blokering af AGEs-RAGE-interaktionerne undertrykke stress-fremkaldende signaltransduktion, som betragtes som en terapeutisk strategi til at hæmme glycation på et senere tidspunkt. Docking-resultater med RAGE, som vist i tabel 6, viste, at gallussyre har den højeste docking-score (G=-6.8 kcal/mol) sammenlignet med dem for vanillinsyre, ferulinsyre, koffeinsyre, quercetin og rutin(-6.68,-5.94,-5.89,-5.58, henholdsvis -4,89 kcal/mol). Desuden viste 2D-modellering af gallussyre og RAGE, at gallussyre dannede fem konventionelle hydrogenbindinger med CYS38, GLY40, ALA41, LYS43 og SER83 af RAGE (figur 5C, D). LYS37 og LYS43 var også ansvarlige for de hydrofobe interaktioner mellem gallussyre og RAGE. Fem aminosyrer, der omgiver gallussyre (GLU32, LYS39, PR042, ASN81 og GLY82) blev bundet af van der Waals kræfter og stabiliserede derved gallussyre-RAGE-komplekset ved at tilvejebringe et stærkt sammenhængende miljø. Sammenfattende har den aktuelle undersøgelse vist, at den effektive interaktion mellem visse bioaktive forbindelser i E. fragilis' EAF med målproteinerne fra BSA og RAGE.E.fragilis kan være en kilde til potentielle konkurrenter til glucose og AGE'er, som kan modstå deres binding til henholdsvis BSA og RAGE og reducerer derfor den efterfølgende udvikling af oxidativt stress og inflammation (Figur 6).
3. Materialer og metoder
3.1. Kemikalier og reagenser
22-azinobis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyre)(ABTS), butyleret hydroxytoluen (BHT), natriumazid, guanidinhydrochlorid, tween-40,1,{ {7}}diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), Folin Ciocalteau-reagens, -caroten, linolsyre, glucose, 2,4-dinitrophenylhydrazin(DNPH),5,5'-Dithiobis-({{16 }}Nitrobenzoesyre)(DTNB), ammoniummolybdat og polyphenolstandarder blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Hydrogenperoxid (H2O2) blev købt fra Fluka (Basel, Schweiz). Aluminiumchlorid (AICl3), natriumcarbonat (NazCO3), ferrichlorid (FeCl3), kaliumpersulfat (K2S2Os), kaliumferricyanid (K3Fe(CN)6), svovlsyre og alle opløsningsmidler blev opnået fra Merck Life Science (Darmstadt, Tyskland) ). Ascorbinsyre og trichloreddikesyre (TCA) blev opnået fra Scharlau (Barcelona, Spanien).
3.2. Plantematerialer
E. fragilis (luftdele) blev indsamlet fra Dour Lagfifat, Oulad Teima, Taroudant, Marokko (breddegrad, 30 grader 24'0"N; længdegrad, 9 grader 12'36"W) i løbet af maj 2019. Det blev identificeret af professor Najat ELKHIATI, en botaniker fra vores institut, hvor en samling kuponprøver blev deponeret. Planten blev skyllet med destilleret vand, lufttørret, pulveriseret i en blender og opbevaret ved 49C indtil brug.
3.3.Eksperimentelt design
3.3.1.Udvalg af variabler
Mange parametre vides at have betydelige effekter på ekstraktion af phenolforbindelser, såsom typen opløsningsmiddel, opløsningsmiddelkoncentration, ekstraktionstid og ekstraktionstemperatur [59]. Forskellige opløsningsmidler såsom acetone, methanol og ethanol er velegnede til ekstraktion af forskellige phenoliske forbindelser [16], men ethanol blev valgt som opløsningsmiddel i denne undersøgelse på grund af dets spiselige sikkerhed og grønne fremstilling [60]. Derfor blev alle faktorer, inklusive ethanolkoncentrationen (X), ekstraktionstemperaturen (X2) og ekstraktionstiden (X3), valgt som variable.
3.3.2. BBD til ekstraktionsoptimering
En optimeringsprocedure blev udviklet ved hjælp af RSM til at bestemme virkningerne af ekstraktionsfaktorer og vælge de optimale eksperimentelle ekstraktionsbetingelser for E. fragilis phenolforbindelse. En tre-niveau, tre-faktor BBD blev foretaget for at undersøge virkningen af tre uafhængige faktorer, herunder X1 (ethanolkoncentration, procent), X, (ekstraktionstemperatur, grad) og X3 (ekstraktionstid, h) på TP- og TF-indhold af E, fragilis-ekstrakter [17]. Til optimeringsformål blev et samlet antal på 15 forsøg inklusive tre centerpunkter udført tilfældigt (tabel 1). Baseret på vores foreløbige enkeltfaktoreksperiment (data ikke vist) blev alle variable sat på tre niveauer (-1,0 og plus 1), med X,(40,60 og 80 procent ), X ,(25,42,5 og 60 grader) og X3(6, 15 og 24 timer)(tabel 1). Følgende andenordens polynomieligning (ligning (1)) blev brugt til at passe til svarvariablerne:
hvor Y er den forudsagte respons; o, ; jeg og ; er regressionskoefficienterne for henholdsvis skæringsled, lineære, kvadratiske og interaktionsled; og X;, og X; er de uafhængige variable (i ≠ j).
3.3.3. Ekstraktionsprocedure
Den pulveriserede prøve (10 g) blev ekstraheret ved macerationsmetode i en designet ethanolkoncentration (40-80 procent ;1:10, w/v), ved varierende temperaturer (25-60 grader) i forskellige perioder ({ {5}} h) på en orbital shaker inkubator (160 rpm). Gaze og Whatman filterpapir nr. 1 blev anvendt til at fjerne den uopløselige masse. Filtratet blev derefter tørret ved 40 grader under lavt tryk under anvendelse af R-3 Rotavapor(Büchi) for at give den rå ethanolekstrakt (CEE).
3.4. Fraktionering af CEE opnået under optimale forhold
CEE opnået under optimale betingelser blev solubiliseret i destilleret vand (100 ml), og væske-væske-ekstraktion blev udført med forskellige opløsningsmidler med stigende polaritet for at give hexanfraktion (HF, 3 x 100 ml), dichlormethanfraktion (DMF, 3 x 100 ml), ethylacetatfraktion (EAF.3×100 ml), en vandmættet n-butanolfraktion (WBF, 3×100 ml),
og den resterende vandfraktion (WF). Disse fraktioner blev derefter filtreret og tørret som beskrevet ovenfor, og ekstraktionsudbyttet blev registreret ifølge ligning (2):
Were Wo og W er vægten af tørrede CEE/fraktioner og begyndelsesvægten af E. fragilis-pulver; henholdsvis.
3.5. Fytokemisk Analyse
De spektrofotometriske teknikker, der bruges til at evaluere det fytokemiske indhold af E. fragilis-ekstrakter, er beskrevet detaljeret i de supplerende materialer [61,62].
3.6. Biologiske aktiviteter
Nærmere oplysninger om antioxidant [43,63-67] og antiglykeringsaktivitet [68-70] test in vitro blev givet i de supplerende materialer.
3.7.RP-HPLC Analyse af EAF
Analyse af phenoliske forbindelser i EAF blev udført med Agilent 1100(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) udstyret med en ZORBAX Eclipse SB-C18 omvendt-fase analytisk kolonne på 100×4 mm og 3,5 um partikelstørrelse [71]. Søjletemperaturen blev holdt konstant på 48 grader. Isokratisk eluering med acetonitril, 0,1 procent eddikesyre i vand (12:88, v/v) som mobil fase og 1 ml/min flowhastighed sikrede god adskillelse af polyphenoler i E.fragilis' EAF. Det injicerede volumen var 10 μL, og kromatogrammer blev målt ved 330 nm. Retentionstiderne for phenolforbindelser i EAF blev sammenlignet med dem for rent tilgængelige standarder for at identificere dem.
3.8. Molekylær docking
AutoDock Tools (ADT) version 1.5.6 blev brugt til at udføre en molekylær docking-undersøgelse. SDF-format af alle forbindelser blev opnået fra PubChem-databasen og derefter konverteret til 3Dpdb-fil ved hjælp af Open Babel GUI (version 2.4.1). Krystalstrukturerne af BSA(PDB ID:4ORO) og RAGE(PDB ID:4LP5) blev indsamlet fra RCSB Protein Data Bank (PDB). Kort fortalt blev proteinerne først forberedt til docking ved (i) at fjerne alle heteroatomer og vandmolekyler, (i) tilføje polære hydrogenatomer og (ii) tildele Kollman-ladninger. Gitterkassens dimension blev sat til x{{10}},y=126,z=126 og x=80,y=80.Z{{ 15}} med gittermidten ×=8.415,y=21.626,z=106.57 andx=37.98,y=-43.581 ,z=9.371 med en gitterafstand på 0,375A skabt omkring bindingsstedet for henholdsvis BSA og RAGE. Dockingsoftwaren blev kørt 100 gange ved hjælp af Lamarckian Genetic Algorithm (LGA) for at finde den bedste bindingsposition. Liganden med den laveste bindingsenergiscore blev valgt til yderligere undersøgelse. Discovery Studio-softwareversion 2020 (BIOVIA, San Diego, CA, USA) blev brugt til at visualisere docking-resultater.
3.9. Statistisk analyse
Design-Expert software version 119 (Stat-Ease Inc. og Minneapolis, MN, USA) blev brugt til at udføre RSM. Dataanalyse blev udført ved en-vejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Duncans post-hoc test ved brug af SPSS 26.0(IBM Co., USA);p<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" pearson="" correlation="" analysis="" was="" conducted="" to="" investigate="" correlations="" between="" variables="" and="" their="" significance.="" all="" graphics="" were="" constructed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0="" software="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" all="" experiments="" were="" conducted="" in="" triplicate="" and="" presented="" as="" mean="" values="" ±standard="" deviation="">
4 konklusioner
RSM med en BBD blev anvendt til at indstille de optimerede parametre for ekstraktion af de bioaktive forbindelser fra den marokkanske lægeurt E. fragilis. Den optimale ethanolkoncentration, ekstraktionstemperatur og ekstraktionstid blev forudsagt for maksimum
ekstraktionsudbyttet af phenolforbindelser og viste sig at være henholdsvis 61,93 procent, 44,43 grader C og 15,84 timer. CEE opnået under optimale ekstraktionsforhold og dets forskellige fraktioner blev analyseret for deres TP- og TF-indhold samt deresantioxidantog antiglykerende aktiviteter. EAF-fraktionen viser det højeste TP- og TF-indhold og de stærkeste antioxidantaktiviteter sammenlignet med andre fraktioner. Evalueringen af flere biomarkører såsom UV-vis absorptionsspektrum, specifik AGEs fluorescens, carbonylindhold og fri thiolgruppe viste også den største beskyttende effekt af EAF mod glycation medieret af glucose. Ydermere blev der observeret et signifikant positivt forhold mellem phenolforbindelsernes antioxidantkapacitet og deres antiglykeringsaktiviteter. Dette indikerer, at phenolforbindelser kan være de vigtigste fremherskende komponenter, der er ansvarlige for både antioxidant- og antiglykeringsaktiviteter. De bioaktive forbindelser i EAF blev karakteriseret ved RP-HPLC-analyse, og et samlet antal på seks forbindelser blev identificeret. I silico molekylær docking-analyse viste også en effektiv interaktion mellem quercetin og gallussyre med henholdsvis BSA og RAGE som målproteiner. Samlet tyder denne undersøgelse på, at E.fragilis kan være en potentiel kilde til naturlige bioaktive forbindelser med kraftige antioxidant- og antiglykeringsaktiviteter og bør anvendes til behandling og forebyggelse af aldring og glycation-associerede komplikationer. Yderligere undersøgelser af isolering af bioaktive forbindelser og farmakologisk screening (dvs. cytotoksicitetsundersøgelse) skal udføres for at udforske fytokemien og virkningsmekanismerne af farmakologiske egenskaber af E. fragilis.
Referencer
1. Martins, N.; Barros, L.; Santos-Buelga, C.; Silva, S.; Henriques, M.; Ferreira, ICFR afkog, infusion og hydroalkoholisk ekstrakt af dyrket timian: Antioxidant og antibakterielle aktiviteter og phenolisk karakterisering. Food Chem. 2015, 167, 131-137. [CrossRef]
2. Deetae, P.; Parichanon, P.; Trakunleewatthana, P.; Chanseetis, C.; Lertsiri, S. Antioxidant- og anti-glykeringsegenskaber af thailandske urtete i sammenligning med konventionelle teer. Food Chem. 2012, 133, 953-959. [CrossRef]
3. Yao, Q.; Liang, Y.; Shao, Y.; Bian, W.; Fu, H.; Xu, J.; Sui, L.; Yao, B.; Li, M. Advanced Glycation Slutproduktkoncentrationer i follikulær væske fra kvinder, der gennemgår IVF/ICSI med en GnRH-agonistprotokol. Reprod. Biomed. Online 2018, 36, 20–25. [CrossRef] [PubMed]
4. Grimm, S.; Ott, C.; Hörlacher, M.; Weber, D.; Höhn, A.; Grune, T. Advanced-Glycation-End-Product-Induced Formation of Immunoproteasomes: Involvering of RAGE og Jak2/STAT1. Biochem. J. 2012, 448, 127-139. [CrossRef]
5. Meenatchi, P.; Purushothaman, A.; Manneemegalai, S. Antioxidant, antiglycation og insulinotrofiske egenskaber af Coccinia Grandis (L.) in vitro: Mulig rolle i forebyggelse af diabetiske komplikationer. J. Tradit. Komplement. Med. 2017, 7, 54-64. [CrossRef] [PubMed]
6. Nakagawa, T.; Yokozawa, T.; Terasawa, K.; Shu, S.; Juneja, LR Beskyttende aktivitet af grøn te mod frie radikaler- og glukosemedieret proteinskader. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 2418-2422. [CrossRef] [PubMed]