Anden del DsbA-L interagerer med VDAC1 i mitokondrionmedieret tubulær celleapoptose og bidrager til udviklingen af ​​akut nyresygdom

Resultater

1. Iskæmisk skade inducerede ekspressionen af ​​DsbA-L i BUMPT-celler og nyrerne hos mus og patienter

For at undersøge, om iskæmisk skade inducerede ekspressionen af ​​DsbA-L, udtømte vi BUMPT-celler for ATP i 2 timer og tillod dem derefter at komme sig i en samlet periode på 4 timer. RT-qPCR og immunoblotting-resultater indikerede, at ekspressionen af ​​DsbA-L blev induceret ved I/R 2-0, nåede en top ved I/R 2-2 og derefter gradvist reduceret til niveauer set ved I/R 2-0 (Figur 1a, e og i). Immunfluorescensfarvning af DsbA-L bekræftede yderligere disse fund og indikerede, at DsbA-L overvejende udtrykkes i cytoplasmaet af BUMPT-celler (figur 1 m og n). Vi påviste yderligere ekspressionen af ​​DsbA-L i C57BL/6-mus behandlet med iskæmi (28 min) og reperfusionsskade (24 timer og 48 timer). RT-PCR og immunoblotting-resultater indikerede, at ekspressionen af ​​DsbA-L blev induceret i både cortex og ydre medulla af musens nyre efter 24 timers reperfusion og nåede en top 48 timer efter reperfusion (figur 1b, c, f, g) , j og k). Disse resultater blev yderligere bekræftet af den immunhistokemiske farvning af DsbAL (figur 1 o og p). Til sidst undersøgte vi, om ekspressionsniveauerne af DsbA-L blev induceret hos patienter med AKI forårsaget af iskæmi. Disse resultater indikerede, at niveauerne af DsbA-L-mRNA og protein var bemærkelsesværdigt øget hos patienter med AKI forårsaget af iskæmi sammenlignet med MCD-patienter (figur 1. d, h og l). Disse resultater blev yderligere valideret ved immunofluorescensfarvning af DsbA-L (figur 1. q og r).

Figur 1. DsbA-L blev induceret af I/R i BUMPT-celler og nyrer hos mus og patienter. I/R-modellen i BUMPT-celler blev induceret af 10 mM antimycin A og 1,5 mM calciumionophor i 2 timer og genvundet i 0, 2 og 4 timer. I/R-musemodel blev induceret af bilateral nyreiskæmi i 28 minutter og reperfusion i 24 og 48 timer. Nyrebiopsiprøver blev indsamlet fra I/R-inducerede AKI-patienter og Minimal Change Disease (MCD)-patienter. (ad) RT-qPCR-påvisning af DsbA-L-ekspression i BUMPT-celler, mus nyrekortikalt væv og ud af medulla- og nyrepatienter med eller uden I/R-tilstand. (e-h) Immunoblotanalyse af DsbA-L og b-tubulin i BUMPT-celler under I/R-model i BUMPT-celler, kortikalt væv, ud af medulla- og nyrepatienter. (i-l) Densitometrianalyse af DsbA-L og b-tubulin proteinekspression. (m, o og q) Immunfluorescens og immunhistokemisk farvning af DsbA-L i BUMPT-celler og nyrer fra henholdsvis mus og patienter med eller uden I/R-tilstand. (n, p og r) Kvantificeringsanalyse af DsbA-L-farvning. Original forstørrelse x 400. Scar Bar: 10µM i m100µM i o og q. Hvert eksperiment (e-h, m, o og q) blev gentaget 6 gange uafhængigt med lignende resultater. To-halede Student t-test blev brugt til to gruppe sammenligninger. (a-d, i-l, n, p og r). # s<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group.

Klik her for at kende fordelene ved Cistanche

2. IR-induceret nyreskade, tubulær celle apoptose og mitokondriel skade blev svækket i PT-DsbA-LKO mus

Kuldkammeraterne af PT-DsbA-L-WT og PT-DsbA-L-KO mus blev behandlet med eller uden iskæmi (28 min) og reperfusionsskade (24 timer og 48 timer). Efter denne behandling fik vi blodprøver og prøver af nyrevæv til yderligere undersøgelse. Funktionelt var I/R-induceret forringelse af nyrefunktionen karakteriseret ved stigende niveauer af blodurinstofnitrogen (BUN) og kreatinin i PT-DsbA-L-WT-musene; denne effekt var signifikant svækket i PT-DsbA-L-KO-musene (figur 2a og b). Histologi- og TUNEL-analyser bekræftede også, at I/R-inducerede bemærkelsesværdig vævsskade og apoptose i PT-DsbA-L-WT-musene, selvom dette blev forbedret i PT-DsbA-L-KO-musene (figur 2c,d,f, og g). Interessant nok indikerede elektronmikroskopi (EM) analyser, at PT-DsbA-L-KO mus viste markant svækkelse af den I/R-inducerede mitokondrielle skade (figur 2 e og h). Immunblotting bekræftede yderligere, at PT-DsbA-LKO-mus også udtrykte lavere niveauer af spaltet caspase-3, lavere akkumuleringshastigheder af Bax i mitokondrierne og reducerede niveauer af cytokrom c (Cyt-c) frigivelse i cytosolen (Figur 2) I-o). RT-qPCR-analyseresultater viste, at PT-DsbA-L-KO reverserede reduktionen af ​​NRF1 og PCG-1a forårsaget af I/R (figur 2 p og q), hvilket yderligere blev bekræftet af immunoblotting-analysen ( Figur 2 r- t). Disse data viste, at DsbA-L spillede en central rolle i I/R-induceret AKI.

Figur 2. Svækkelse af IR-induceret nyreskade, tubulær celleapoptose, mitokondriebeskadigelse og ekspressionen af ​​Bax, Cytc og spaltet caspase3 i PT-DsbA-L-KO mus. De bilaterale nyrearterier af PT-DsbA-L-KO og PT-DsbA-L-WT kuldkammerater blev fastspændt i 28 minutter og derefter frigivet i 48 timer for at etablere en IR-model. (a) BUN (b) Serumkreatinin (c) Hæmatoxylin- og eosinfarvning. (d) Repræsentative sektioner af TUNEL-positive celler. (e) Elektronmikroskopdetektion af mitokondriemorfologi. (f) Score for rørskader. (g) Antallet af TUNEL-positive celler. (h) Mitokondrierskadescore. (i) Immunoblotanalysen af ​​ekspressionen af ​​spaltet caspase3 og DsbA-L og ekspressionen af ​​BAX og Cyt-c i mitokondrielle og cytosoliske fraktioner. b-tubulin og GAPDH blev anvendt som henholdsvis hel lysat eller cytosolisk ladningskontrol. COX IV blev brugt som en mitokondriebelastningskontrol. (j- o) Analyse af gråtonebilledet mellem dem. (p og q) RT-qPCR-detektion af ekspressionen af ​​NRF1 og PCG-1a. (r) Immunoblotanalysen af ​​ekspressionen af ​​NRF1 og PCG-1a. (s og t) Analyse af gråtonebilledet mellem dem. Original forstørrelse x 400 eller x6000. Scar Bar: 100 µM i c&d 20 µM i f.eks. Hvert eksperiment (ce, I og r) blev gentaget 6 gange uafhængigt med lignende resultater. Envejs ANOVA blev brugt til sammenligning af flere grupper. (a, b,f- h, jo, pq&s- t). # s<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-DsbA-L-WT with IR group.

Cistanche tubulosa

3. DsbA-L-medieret I/R-induceret apoptose i BUMPT-celler

For yderligere at undersøge, om DsbA-L medierer apoptose i BUMPT-celler induceret af I/R, transficerede vi BUMPT-celler med DsbA-L siRNA og udtømte derefter disse celler fra ATP i 2 timer; cellerne fik derefter lov til at komme sig i 2 timer. FCM-analyser fandt, at DsbA-L siRNA signifikant svækkede I/R-induceret apoptose i BUMPT-celler (figur 3a). Immunoblotting-analyser bekræftede yderligere, at DsbA-L siRNA især undertrykte den I/R-inducerede stigning i spaltet caspase-3-ekspression, den øgede akkumulering af Bax i mitokondrierne og den øgede frigivelse af Cyt-c til cytosolen (figur 3 b-h). RT-qPCR-analyseresultater viste, at I/R undertrykte ekspressionen af ​​NRF1 og PCG-1a, som blev reverseret af DsbA-L siRNA'et (figur 3 i og j). Immunoblotting-resultaterne var i overensstemmelse med resultaterne af RT-qPCR (figur 3 km). I modsætning hertil øgede DsbA-L-plasmidet I/R-induceret apoptose i BUMPT-celler, øgede ekspressionen af ​​spaltet caspase-3, øgede akkumuleringen af ​​Bax og øgede frigivelsen af ​​Cyt-c til cytosolen (figur 3 o- u). RT-qPCR-analyseresultater indikerede, at I/R undertrykte ekspressionen af ​​NRF1 og PCG-1a, som blev forstærket af DsbA-L-plasmidet (figur 3 v og w). Immunoblotting-resultaterne bekræftede yderligere resultaterne af RT-qPCR (figur 3 x-z). Disse data bekræftede yderligere, at DsbA-L-medierede processen med apoptose såvel som mitokondriel dysfunktion under iskæmisk skade.

Figur 3. DsbA-L-medierede den IR-inducerede ekspression af spaltet caspase3, BAX og Cyt-c i BUMPT-celler. Plasmidet og siRNA af DsbA-L blev transficeret ind i BUMPT-celler og derefter udsat for ATP-depletering i 2 timer og restitution i 2 timer. (a&n) Flowcytometrianalyse af BUMPT-cellers apoptose. (b&o) Immunoblotterne analyserede ekspressionen af ​​spaltet caspase3 og DsbA-L og ekspressionen af ​​BAX og Cyt-c i mitokondrielle og cytosoliske fraktioner. b-tubulin og GAPDH blev anvendt som henholdsvis hel lysat eller cytosolisk ladningskontrol. COX IV blev brugt som en mitokondriebelastningskontrol. (c- h, og q- u) Analyse af gråtonebilledet mellem dem. (i,j og v, w) RT-qPCR detekterer ekspressionen af ​​NRF1 og PCG-1a. (k og x) Immunoblotanalysen af ​​ekspressionen af ​​NRF1 og PCG-1a. (l, m og y,z) Analyse af gråtonebilledet mellem dem. Hvert eksperiment (a, b, k, n, o og x) blev gentaget 6 gange uafhængigt med lignende resultater. Envejs ANOVA blev brugt til sammenligning af flere grupper. (c-j,c-m, p-w & y, z). # s<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus scramble with the saline group. * P<0.05 versus scramble with IR group.

Cistanche tillæg

4. DsbA-L interagerede med VDAC1 i BUMPT-celler, der havde været udsat for ATP-depletering såvel som i nyrerne hos mus og patienter med AKI

Tidligere resultater tydede på, at spændingsafhængig anionkanal-1 (VDAC1), et vigtigt protein i den ydre mitokondriemembran, er involveret i celleapoptose36 Vores nylige undersøgelse rapporterede, at DsbA-L også udtrykkes i mitokondrierne. Derfor antog vi, at DsbA-L interagerede med VDAC1 for at regulere progressionen af ​​AKI. Resultater af immunpræcipitation (IP) viste, at anti-VDAC1-antistoffet trak både VDAC1- og DsbA-L-proteiner ned, mens anti-DsbA-L præcipiterede både DsbA-L og VDAC1 i hele lysater af kontrol- og I/R-grupper af BUMPT-celler, og musenyrer og patienternes nyrer (figur 4a). Ydermere blev mitokondrielle lysater af BUMPT-celler musenyrer og patienternes nyrer også brugt til co-IP af DsbA-L og VDAC1; resultaterne var i overensstemmelse med resultaterne for hele lysatet (figur 4b). Strukturen af ​​DsbA-L indeholder et nukleotidbindende domæne/ATPase-domæne (aminosyrer 1-51), et aminoterminalt domæne (NTD), en spiralformet region til dimerisering (aminosyrer 56-178) og et carboxylterminalt domæne (CTD; aminosyrer 185-216) (figur 4c). Baseret på strukturen af ​​VDAC1 indikerede softwareforudsigelse, at det N-terminale domæne (aminosyre 1 til 25) af VDAC1 kan interagere med DsbA-L (figur 4d). For at afklare, hvilke domæner af VDAC1 der kan interagere med DsbA-L, konstruerede vi tre plasmider for HA-VDAC1 med aminosyrer 1- 75, aminosyrer 76-1098 og det fulde gen (fig. 4e). Anti-HA-antistoffet præcipiterede DsbA-L i grupper med VDAC1 med aminosyrer 1-75 og det fulde gen, men ikke med VDAC1 og plasmidet med aminosyrer 76-1098. Dette indikerede, at DsbA-L interagerede med regionen af ​​VDAC1, der indeholder aminosyrer 1-75 (figur 4f). For yderligere at undersøge, hvilke specifikke regioner af VDAC1, der interagerede med DsbA-L, transficerede vi BUMPT-celler med HA-tagget af VDAC1-plasmider med D9-13, 22-27, D39-45, {{59 }}, D9-13, 22-27, 39-45, 55-57. IP-resultater viste, at anti-HA-antistoffet kun præcipiterede DsbA-L med D39-45- og 55-57-plasmiderne og ikke D9-13- og 22-27-plasmiderne (se figur 4g) ). Dette viste yderligere, at DsbA-L interagerede med aminosyrerne 9-13 og 22-27 af VDAC1. Figur 4g viser en model, der viser, hvordan DsbA-L interagerer med aminosyrer 9-13 og 22-27 af VDAC1 (figur 4g). Samlet indikerer disse data, at DsbA-L interagerer med aminosyrerne 9-13 og 22-27 i VDAC1.

Figur 4. Interaktion mellem DsbA-L og VDAC1 i BUMPT-celler med eller uden ATP-depletering og nyrerne fra nyre-I/R-mus og patienter. (a&b n=3 pr. gruppe) Hele eller mitokondrielle lysatet blev ekstraheret til reciprok co-immunudfældning af DsbA-L og VDAC1 i BUMPT-celler behandlet med ATP-depletering og restitution og nyrerne fra I/R-inducerede AKI-mus og patienter. (cn=3 pr. gruppe) De funktionelle domæner og struktur af DsbA-L. (dn=3 pr. gruppe) Forudsigelsesmodellen for DsbA-L og VDAC1 interaktion. (e- gn=3 pr. gruppe) Anti-HA-immunpræcipitater blev analyseret for HA og derefter påvist for DsbA-L ved hjælp af immunblotting.

Herba Cistanche

5. Co-lokalisering af DsbA-L eller VDAC1 i mitokondrierne, og co-lokalisering af DsbA-L og VDAC1 i (i) BUMPT-celler, der er udtømt for ATP og (ii) nyrerne hos mus og patienter

For at bekræfte vores IP-resultater udførte vi en co-lokaliseringsanalyse. Immunofluorescens konfokal mikroskopi viste, at DsbA-L eller VDAC1 var lokaliseret til mitokondrierne af BUMPT-celler og nyrerne hos både sham-mus og MCD-patienter, og at denne effekt blev yderligere forstærket i BUMPT-celler, der var blevet udtømt for ATP, og i nyrerne hos mus og patienter med AKI (figur 5 a, b, d, e, g og h). Interessant nok bekræftede immunfluorescens-konfokalmikroskopi, at co-lokaliseringssignalet for DsbA-L og VDAC1 i BUMPT-celler og nyrerne fra falske mus og MCD-patienter var relativt svagt. Imidlertid var co-lokaliseringssignalet markant øget i BUMPT-celler, der var blevet udtømt for ATP, og i nyrerne hos mus og patienter med AKI (figur 5 c, f og i). Samlet giver disse data yderligere bevis for at understøtte interaktionen mellem DsbA-L og VDAC1 i mitokondrierne.

Figur 5. Kolokalisering af DsbA-L og VDAC1 i mitokondrierne af BUMPT-celler og nyrer fra AKI-mus og patienter. (a, d&g n=4 pr. gruppe) Lokalisering af DsbA-L i mitokondrierne i BUMPT-celler med eller uden ATP-depletering og restitution, nyrerne af musemodeller i sham- og I/R-grupperne samt MCD og I/R patienter. (b, e&h n=4 pr. gruppe) Lokalisering af VDAC1 i mitokondrierne i BUMPT-celler med eller uden ATP-depletering og restitution, nyrerne af musemodeller i sham- og I/R-grupperne samt MCD og I/ R. (c, f&i n=4 pr. gruppe) Samlokaliseringen af ​​DsbA-L og VDAC1 i mitokondrierne i BUMPT-celler med eller uden ATP-udtømning og restitution, nyrerne af mus model i sham- og I/R-grupperne samt MCD- og I/R-patienter.

6. VDAC1-medieret BUMPT-cellers apoptose forårsaget af iskæmi-reperfusion

Dernæst forsøgte vi at bestemme, om VDAC1 var involveret i processen med I/R-induceret apoptose i BUMPT-celler. Immunoblotting-resultater indikerede, at VDAC1-ekspression blev induceret ved I/R 2-0 og nåede et toppunkt ved I/R 2-2, før det derefter gradvist blev reduceret til niveauerne set ved I/R 2-0 ( Figur 6 a og b). FCM-analyse viste, at I/R inducerede apoptose i BUMPT-celler; denne effekt blev dæmpet ved påføring af VDAC1 siRNA (figur 6c). Immunoblotting-resultater bekræftede yderligere, at VDAC1-siRNA markant forbedrede den I/R-inducerede stigning i spaltet caspase-3-ekspression, den øgede akkumulering af Bax i mitokondrierne og den øgede frigivelse af Cyt-c til cytosolen (Figur 6d- k). I modsætning hertil blev de ovennævnte ændringer forstærket af overekspressionen af ​​VDAC1-plasmidet (figur 6 l-s). Tilsammen viste disse data, at VDAC1-medierede I/R-induceret apoptose i BUMPT-celler.

Figur 6. IR-induceret ekspression af spaltet caspase3, BAX og Cyt-c i BUMPT-celler blev medieret af VDAC1. siRNA'et eller plasmidet af VDAC1 blev transficeret ind i BUMPT-celler og derefter udsat for ATP-depletering i 2 timer og restitution i 2 timer. (a) Immunoblotanalyse af VDAC1 og b-tubulin i BUMPT-celler. (b) Analyse af gråtonebilledet mellem dem (c) Flowcytometrianalyse af BUMPT-cellers apoptose. (d) Immunoblotterne analyserede ekspressionen af ​​spaltet caspase3, VDAC1 og DsbA-L og ekspressionen af ​​BAX og Cyt-c i mitokondrielle og cytosoliske fraktioner. b-tubulin og GAPDH blev anvendt som henholdsvis hel lysat eller cytosolisk ladningskontrol. COX IV blev brugt som en mitokondriebelastningskontrol. (ek) Analyse af gråtonebilledet mellem dem. (i) Flowcytometrianalyse af BUMPT-cellers apoptose. (m) Immunoblotterne analyserer ekspressionen af ​​spaltet caspase3, VDAC1 og DsbAL og ekspressionen af ​​BAX og Cyt-c i mitokondrielle og cytosoliske fraktioner. b-tubulin og GAPDH blev anvendt som henholdsvis hel lysat eller cytosolisk ladningskontrol. COX IV blev brugt som en mitokondriebelastningskontrol. (ns) Analyse af gråtonebilledet mellem dem. Hvert eksperiment (a, c, d, l & m) blev gentaget 6 gange uafhængigt med lignende resultater. To-halede Student t-test blev brugt til to gruppe sammenligninger. (b), Envejs ANOVA blev brugt til sammenligning af flere grupper. (e- k og n- s). # s<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group.# P<0.05 versus scramble with the saline group. * P<0.05 versus scramble with IR group.

Cistanche ekstrakt

Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h og Dongshan Zhang a,b *

en afdeling for akutmedicin, Folkerepublikken Kina

b Emergency Medicine and Difficult Diseases Institute, Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan 410011, Folkerepublikken Kina

c Oftalmologisk afdeling, Folkerepublikken Kina

d Urinkirurgisk afdeling, Folkerepublikken Kina

e Department of Chest Surgery, Folkerepublikken Kina

f Department of General Surgery, Second Xiangya Hospital, Folkerepublikken Kina

g Institut for Folkesundhed, Central South University, Changsha, Hunan, Folkerepublikken Kina

h Department of Endocrinology, Shenzhen People's Hospital, The Second Clinical Medical College of Jinan University, The First Affiliated Hospital of Southern University of Science and Technology, Shenzhen, Folkerepublikken Kina

1 Xiaozhou Li og Jian Pan bidrog ligeligt til denne undersøgelse