Del tre DsbA-L interagerer med VDAC1 i mitokondrionmedieret tubulær celleapoptose og bidrager til udviklingen af ​​akut nyresygdom

7. Generering af PT-VDAC1-KO-mus

For at undersøge VDAC1's rolle i AKI etablerede vi en musemodel med knockout af VDAC1 i nyrernes proksimale tubuli. Figur 7a viser avlsprotokol, der bruges til at generere PT-VDAC1-KO. RT-PCR blev brugt til at genotype PT-VDAC1-KO-musene; dette blev gjort ved at amplificere en 416-bp DNA-fragment floxet allel og et 370-bp DNA-fragment af Cre-genet (figur 7, b; bane 4 og 6). Vildtypemusene (PT-VDAC1-WT) manglede Cre-genet (figur 7, b, bane 2 og 3). Immunoblotanalyse indikerede, at ekspressionsniveauer af VDAC1 i nyrebarkene hos PTVDAC1-KO-musene var lavere end dem i PTVDAC1-WT-musene efter iskæmisk eller sham-behandling (figur 7 c og d). Dette blev yderligere verificeret ved den immunhistokemiske farvning af VDAC1 (figur 7e). Disse data bekræftede, at vi havde etableret en PT-VDAC1-KO-musemodel.

Figur 7. Oprettelse og karakteristika for PT-VDAC1-KO-musemodellen. (a, b) Avlsprotokollen for generering af PTVDAC1-KO-mus og PCR-detektion af genotypen af ​​vildtype- og floxede alleler af VDAC1- og PEPCK-Cre-allelen. (c) Immunblotanalyse af VDAC1 og b-tubulin ved hjælp af nyrekortikale væv fra PT-VDAC1-KO og PT-VDAC1-WT kuldkammeratmus efter IR-skade. (d) Analyse af gråtonebilledet mellem dem. (e) Immunhistokemisk farvning af VDAC1 i nyrekortikale væv fra vildtype- og VDAC1-mus efter IR-skade. Original forstørrelse x 400. Scar Bar: 100µM. Hvert eksperiment (c & e) blev gentaget 6 gange uafhængigt med lignende resultater. Envejs ANOVA blev brugt til sammenligning af flere grupper (d). # s<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1-WT with IR group.

Klik her for at kende fordelene ved Cistanche

8. I/R-induceret nyreskade, tubulær celleapoptose og mitokondriel skade blev forbedret i PTVDAC1-KO-mus

Kuldsøskende af PT-VDAC1-WT- og PT-VDAC1-KO-musene blev behandlet med iskæmi (28 min) efterfulgt af reperfusionsskade (48 timer). Vi tog derefter blodprøver og nyrevæv til yderligere undersøgelse. Vi fandt ud af, at PT-VDAC1-KO især undertrykte den I/R-inducerede stigning i niveauerne af BUN og kreatinin (figur 8 a og b). For det andet viste histologiske analyser og TUNEL-analyser yderligere, at PT-VDAC1-KO markant svækkede den I/R-inducerede vævsskade og nyrecelleapoptose (figur 8 c, d, f og g). For det tredje fandt EM-analyser, at PT-VDAC1-KO signifikant svækkede I/R-induceret mitokondriel skade (figur 8 e og h). Endelig bekræftede immunblotting, at PT-VDAC1-KO-musene viste reducerede niveauer af spaltet caspase-3, en lavere akkumulering af Bax i mitokondrierne og lavere hastigheder af Cyt-c-frigivelse i cytosolen (figur 8 I-o). Disse data indikerede, at VDAC1 også medierede den I/R-inducerede AKI.

Figur 8. Svækkelse af IR-induceret nyreskade, tubulær celleapoptose, mitokondriebeskadigelse og ekspressionen af ​​Bax, Cyt-c og spaltet caspase3 i PT-VDAC1-KO-mus. De bilaterale nyrearterier af PT-VDAC1-KO og PT-VDAC1-WT kuldkammeratmus blev fastspændt i 28 minutter og derefter frigivet i 48 timer for at etablere en IR-model. (a) BUN. (b) Serumkreatinin. (c) Hæmatoxylin- og eosinfarvning. (d) Repræsentative sektioner af TUNEL-positive celler. (e) Elektronmikroskopdetektion af mitokondriemorfologi. (f) Rørformet skadescore. (g) Antallet af TUNEL-positive celler. (h) Mitokondrierskadescore. (i) Immunblotterne analyserer ekspressionen af ​​spaltet caspase3, VDAC1 og DsbA-L såvel som ekspressionen af ​​BAX og Cyt-c i mitokondrielle og cytosoliske fraktioner. b-tubulin og GAPDH blev anvendt som henholdsvis hel lysat eller cytosolisk ladningskontrol. COX IV blev brugt som en mitokondriebelastningskontrol. (j- p) Analyse af gråtonebilledet mellem dem. Original forstørrelse x 400. Scar Bar: 100µM i c & d 20µM i f.eks. Hvert eksperiment (c-e&i) blev gentaget 6 gange uafhængigt med lignende resultater. Envejs ANOVA blev brugt til sammenligning af flere grupper (a, b, f-h&j-p). # s<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-VDAC1 WT with IR group.

Cistanche tubulosa

9. Overekspressionen af ​​DsbA-L-forværret I/R-induceret nyreskade blev svækket i PT-VDAC1-KO-mus

af DsbA-L under iskæmisk skade. En uge før musemodellen af ​​IR blev etableret, injicerede vi halevenen på hver mus med DsbA-L-plasmidet (injektionen blev udført to gange i løbet af denne uge). Overekspressionen af ​​DsbA-L forværrede den IR-inducerede stigning i BUN- og kreatininekspression, nyreskade og nyreapoptose; disse virkninger blev svækket i PTVDAC1-KO-musene (figur 9 a-d, e og f). Immunoblotresultater indikerede yderligere, at overekspressionen af ​​DsbA-L forstærkede den IR-inducerede stigning i spaltet caspase-3, akkumuleringen af ​​Bax i mitokondrierne og frigivelsen af ​​Cyt-c til cytosolen; disse effekter blev reduceret i PT-VDAC1-KO-musene (figur 9 g og h-l). Samlet viste disse resultater yderligere, at VDAC1 medierede effekten af ​​DsbA-L under iskæmisk skade.

Figur 9. Overekspressionen af ​​DsbA-L-forværret I/R-induceret nyreskade blev svækket i PT-VDAC1-KO-mus. PT-VDAC1-KO- og PT-DsbA-L-WT-musene blev behandlet med eller uden DsbA-L-plasmid og etablerede derefter en IR-model. (a) BUN. (b) Serumkreatinin. (c) Hæmatoxylin- og eosinfarvning. (d) Repræsentative sektioner af TUNEL-positive celler. (e) Rørformet skadescore. (f) Antallet af TUNEL-positive celler. (g) Immunoblotterne analyserede ekspressionen af ​​spaltet caspase3, VDAC1 og DsbA-L såvel som ekspressionen af ​​BAX og Cyt-c i mitokondrielle og cytosoliske fraktioner. b-tubulin og GAPDH blev anvendt som henholdsvis hel lysat eller cytosolisk ladningskontrol. COX IV blev brugt som en mitokondriebelastningskontrol. (h- n) Analyse af gråtonebilledet mellem dem. Original forstørrelse x 400. Scar Bar: 100mM. Hvert eksperiment (c-e) blev gentaget 6 gange uafhængigt med lignende resultater. Envejs ANOVA blev brugt til sammenligning af flere grupper (a, b og f-n). # s<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. ^ P<0.05 versus IR group.* P<0.05 versus IR group.

Cistanche tillæg

10. Svækkelsen af ​​I/R-induceret nyreskade i PTDsbA-L-KO mus blev reduceret ved overekspression af VDAC1

For yderligere at bekræfte, om DsbA-L-medieret tubulær skade var afhængig af VDAC1, blev kuldsvensmusene fra PTDsbA-L-WT og PT-DsbA-L-KO mus først udsat for I/R-behandling og derefter injiceret via halevenen med VDAC1-overekspressionsplasmidet. Den I/R-inducerede stigning i BUN- og kreatininniveauer blev forbedret i PT-DsbA-L-KO-musene; denne effekt blev imidlertid forhindret af overekspression af VDAC1 (figur 10 a og b). HE- og TUNEL-farvning viste, at de relative omfang af IR-induceret nyrevævsskade og nyrecelle-apoptose blev reduceret i PT-DsbAL-KO-mus, og at disse effekter blev blokeret af overekspression af VDAC1 (figur 10 c-f). Immunblotting viste, at PT-DsbA-L-KO-musene havde lavere niveauer af spaltet caspase-3, lavere niveauer af Bax-akkumulering i mitokondrierne og lavere hastigheder af Cyt-c-frigivelse i cytosolen; disse virkninger blev imidlertid elimineret ved overekspression af VDAC1 (figur 10 g-m). Disse data understøttede det faktum, at DsbA-L fremmede iskæmisk skade på en måde, der var afhængig af VDAC1.

Figur 10. PT-DsbA-L-KO-forbedret IR-induceret nyreskade hos mus blev formindsket ved overekspression af VDAC1. PT-DsbA-L-KO- og PT-DsbA-L-WT-musene blev behandlet med eller uden VDAC1-plasmid og etablerede derefter en IR-model. (a) BUN. (b) Serumkreatinin. (c) Hæmatoxylin- og eosinfarvning. (d) Repræsentative sektioner af TUNEL-positive celler. (e) Rørformet skadescore. (f) Antallet af TUNEL-positive celler. (g) Immunoblotterne analyserede ekspressionen af ​​spaltet caspase3, VDAC1 og DsbA-L såvel som ekspressionen af ​​BAX og Cyt-c i mitokondrielle og cytosoliske fraktioner. b-tubulin og GAPDH blev anvendt som henholdsvis hel lysat eller cytosolisk ladningskontrol. COX IV blev brugt som en mitokondriebelastningskontrol. (hm) Analyse af gråtonebilledet mellem dem. Original forstørrelse x 400. Scar Bar: 100mM. Hvert eksperiment (c, d og g) blev gentaget 6 gange uafhængigt med lignende resultater. Envejs ANOVA blev brugt til sammenligning af flere grupper (a, b, e, f og h-m). # s<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus IR group.

Herba Cistanche

11. CLP-induceret nyreskade blev svækket i PT-DsbA-LKO eller PT-VDAC1-KO mus

Sepsis-induceret AKI er en anden almindelig årsag til AKI i klinisk praksis. Kuldbørn af PT-DsbA-L eller VDAC-WT og PT-DsbA-L eller VDAC1-KO blev udsat for CLP-modellen og derefter aflivet 18 timer efter operationen. Resultater indikerede, at PT-DsbA-L eller VDAC1- KO-mus markant reducerede de CLP-inducerede stigninger i BUN- og kreatininniveauer og de øgede niveauer af nyrevævsskade og nyrecelleapoptose (figur S1 og S2 af-f) ). Immunblotting bekræftede, at PTDsbA-L- eller VDAC1-KO-mus også viste reducerede niveauer af spaltet caspase-3, lavere niveauer af Bax-akkumulering i mitokondrierne og lavere hastigheder af Cyt-c-frigivelse i cytosolen (figurer) S1 og S2 g-n). Samlet viste disse data, at både DsbA-L og VDAC1 medierede progressionen af ​​septisk AKI.

12. VAN-induceret nyreskade blev svækket i PT-DsbAL-KO eller PT-VDAC1-KO mus

Vancomycin (VAN)-induceret AKI er også en vigtig model for AKI. Kuldkammeraterne af PT-DsbA-L eller VDAC1-WT og PT-DsbA-L eller VDAC1-KO blev injiceret intraperitonealt med VAN (600 mg/kg) i 7 på hinanden følgende dage. Resultaterne indikerede, at PT-DsbA-L- eller VDAC1-KO-mus markant reducerede den VAN-inducerede stigning i BUN- og kreatininniveauer, nyrevævsskade og nyrecelleapoptose (figur S3 og S4 an-f). Immunoblot-analyser bekræftede yderligere, at PTDsbA-L- eller VDAC1-KO-mus også viste reducerede niveauer af spaltet caspase-3, en lavere grad af Bax-akkumulering i mitokondrierne og lavere hastigheder af Cyt-c-frigivelse i cytosol (figur S3 og S4 g-m). Sammenfattende viste disse data, at både DsbA-L og VDAC1 medierede VAN-induceret AKI.

Cistanche ekstrakt

13. DsbA-L-medieret I/R-induceret HK-2-celle-apoptose var forbundet med VDAC1

Ovenstående resultat viste, at DsbA-L var involveret i BUMPT-cellernes apoptose, men funktionen af ​​DsbA i humane renale tubulære celler forbliver uklar. DsbA-L siRNA blev transficeret ind i HK2-celler og derefter udsat for ATP-depletering i 2 timer og restitution i 2 timer. Immunoblotresultaterne viste, at DsbA-L siRNA markant forbedrede I/R-induceret stigning i spaltet caspase-3 og VDAC1-ekspression, den øgede akkumulering af Bax i mitokondrierne og den øgede produktion af Cyt-c i cytosolen ( Figur S5 an- h). Dataene antydede også, at DsbA-L's rolle i HK2-celleapoptose var relateret til VDAC1 under I/R-behandling.

14. DsbA-L-medieret I/R-induceret HK-2-cellers apoptose er afhængig af VDAC1

For yderligere at verificere, om DsbA-L's rolle i HK2-celleapoptose er afhængig af VDAC1. Først blev HK2-celler co-transficeret med DsbA-L siRNA plus med eller uden VDAC1-plasmid og derefter udsat for ATP-depletering i 2 timer og restitution i 2 timer. Immunoblotresultaterne indikerede, at DsbA-L siRNA markant svækkede I/R-induceret stigning i spaltet caspase-3 og VDAC1-ekspression, den øgede akkumulering af Bax i mitokondrierne og den øgede produktion af Cyt-c i cytosolen, denne effekt blev vendt ved overekspression af VDAC1-plasmid (figur S6a-h). For det andet blev HK2-celler co-transficeret med VDAC1 siRNA plus med eller uden DsbA-L-plasmid og derefter eksponeret for I(2 timer)/R(2 timer). Immunoblot-resultaterne viste, at VDAC1 siRNA især forbedrede I/R-induceret stigning i spaltet caspase-3 og VDAC1-ekspression, den øgede akkumulering af Bax i mitokondrierne og den øgede produktion af Cyt-c i cytosolen, denne effekt blev ikke forstærket af overekspression af DsbA-L-plasmid (figur S7a-h). Dataene bekræftede klart, at VDAC1 medierede pro-apoptose-rollen af ​​DsbA-L i HK-2-celler under I/R-behandling.

Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h og Dongshan Zhang a,b *

en afdeling for akutmedicin, Folkerepublikken Kina

b Emergency Medicine and Difficult Diseases Institute, Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan 410011, Folkerepublikken Kina

c Oftalmologisk afdeling, Folkerepublikken Kina

d Urinkirurgisk afdeling, Folkerepublikken Kina

e Department of Chest Surgery, Folkerepublikken Kina

f Department of General Surgery, Second Xiangya Hospital, Folkerepublikken Kina

g Institut for Folkesundhed, Central South University, Changsha, Hunan, Folkerepublikken Kina

h Department of Endocrinology, Shenzhen People's Hospital, The Second Clinical Medical College ved Jinan University, The First Affiliated Hospital of Southern University of Science and Technology, Shenzhen, Folkerepublikken Kina

1 Xiaozhou Li og Jian Pan bidrog ligeligt til denne undersøgelse