DEL Ⅰ: Den inflammatoriske proces modulerer udtryk og lokalisering af WT1 i podocytter, der fører til nyreskade
Mar 23, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
MARIELA ARELLANO-RODRÍGUEZ, PABLO ZAPATA-BENAVIDES & ET AL.
Introduktion
Wilms tumor-1 gen(WTI) er et af de vigtigste gener, der er involveret i overlevelsen af podocytter og ineffektiv nyrefiltrering. Inflammatoriske processer fører tilnyrefiaskoog dette kan muligvis ske gennem modulering af WT1(Wilms tumor-1 gen). WT1(Wilms tumor-1 gen) koder for en transkriptionsfaktor, et zinkfingerprotein, der har fire store isoformer ved alternativ splejsning i exon 5(17AA±) og exon 9(KTS±)(1). KTS-isoformen har en højere affinitet for DNA, KTS plus co-lokaliserer med spliceosomproteiner i cytoplasmaet (2, 3).WT1(Wilms tumor-1 gen) spiller en afgørende rolle i embryogenese, primært i gonadale ognyreudvikling; hos voksne er dets ekspression begrænset til specialiserede viscerale celler inyre(podocytter) og er afgørende for vedligeholdelse og modulering af adskillige gener, såsom podocalyxin, nephrin(NPHS1) og transkriptionsfaktor med parret boks (4-6). Mutationer eller reduktion af WTl-ekspression kan føre til reduceret ekspression af nefrin og podocalyxin og er forbundet med nefropatier såsom glomerulosklerose(5, 7-10).
Nefrotisk syndrom er det hyppigste nyresyndrom i barndommen, dets histologiske klassificering er Minimal nefrotisk ændring, fokal segmental glomerulosklerose og diffus mesangial sklerose, og i henhold til omfanget af responsen på steroider er klassificeret som et følsomt og resistent nefrotisk syndrom (11) .
virkninger af cistanche: anti-inflammation
Mutation af WT1(Wilms tumor-1 gen) er almindeligt rapporteret hos børn med steroid-resistent nefrotisk syndrom, en sjælden sygdom, der påvirker 10-15 procent af patienter med nefrotisk syndrom(12,13). Omkring 80 procent af alle børn med sporadisk nefrotisk syndrom reagerer på steroidbehandling, men der blev ikke fundet mutationer i WT1(Wilms tumor-1 gen) i et stort kohortestudie(14).Reduktion i ekspression af steroid-resistent nefrotisk syndrom og i mindre grad hos patienter med steroid-sensitivt nefrotisk syndrom(15).I en murin model af systemisk inflammation induceret af lipopolysaccharide (LPS), 24 timer efter LPS-administration, WT1(Wilms tumor-1 gen) blev translokeret til cytoplasmaet og var forbundet med et fald i ekspressionen af nefrin, en nøglekomponent til opretholdelse af spaltemembranen i podocytter og essentiel for korrekt glomerulær filtration, hvilket viser WT1(Wilms tumor-1 gen) fungerer som en transkriptionel faktor til opregulering af nefrin-genet(16).
I A459 lungecancerceller behandlet med tumornekrosefaktor-alfa (TNFa), translokation af WT1(Wilms tumor-1 gen) protein til cytoplasma er blevet observeret, hvilket tyder på, at en inflammatorisk stimulus kan ændre dets intracellulære lokalisering og transkriptionelle funktion (17). Fosforylering kan spille en rolle i at modulere den transskriptionelle regulatoriske aktivitet af WT1(Wilms tumor-1 gen) gennem interferens med nuklear translokation, såvel som ved hæmning af WT1(Wilms tumor-1 gen) DNA-binding(18) ved cAMP-afhængig proteinkinase-medieret phosphorylering af Ser-365 og Ser-393 i zinkfingerdomænet (19).
Sepsis er et resultat af det systemiske inflammatoriske respons og er karakteriseret ved frigivelse af pro- og anti-inflammatoriske cytokiner induceret af infektion. Akut nyreskade er almindelig hos kritisk syge patienter i nærvær af akut inflammation og har en stærk forbindelse til udviklingen af kronisk nyreskade (20,21). Der er tegn på, at betændelse spiller en vigtig rolle ved skader på forskellige organer, bl.anyrer(22). I dette arbejde evaluerede vi effekten af pro-inflammatoriske cytokiner på moduleringen af WT1(Wilms tumor-1 gen) ekspression og dets translokation til cytoplasmaet.
cistanche tubulosa fordel: antit-cncer og anti-svulst
Materialer og metoder
Dyremodel. BALB/c hunmus (8-10 uger gamle) blev opnået fra Harland Mexico (Mexico City, Mexico). Musene blev holdt i bur under kontrolleret stuetemperatur, fugtighed og lys (12/12 timer lys-mørke cyklus) med vand og mad ad libitum.LPS af Escherichia coli O111:B4 (Sigma Aldrich, Toluca, Mexico City, Mexico) og en enkelt injektion af LPS blev administreret i en dosis på 8 mg/kg intraperitonealt (16); saltvandsopløsningen blev anvendt til ubehandlede kontrolmus. Musene blev aflivet med en intraperitoneal injektion af 200 mg/kg natriumpentobarbital-opløsning ved 12, 24, 36, 48 og 72 timer, med n=5 på hvert tidspunkt, og derefternyrevæv og blod blev opsamlet. Urinen blev opsamlet før aflivning af dyrene.
To mus tilnyreeksplantater blev injiceret med 1 mg/kg LPS hver 2. dag for at inducere kronisknyre skadesom en positiv kontrol (21). Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med forudgående godkendelse fra Institutional Animal Care and Use Committee på Det Biologiske Fakultet (CEIBA-2016-034).
Nyreeksplantater. Franyreaf BALB/c-mus blev vævsskiver 250-300 um tykke fremstillet med en Krumdieck-vævsskærer (Alabama Research and Development, Munford, AL, USA) ved 4 grader med konstant strøm af buffer af Krebs Henseleit-bicarbonat (KB) der blev beluftet med 5 procent CO2. Skiverne blev høstet i KB buffer ved 4 graders grader.Nyreeksplantater blev udpladet i 12-brøndsplader med Dulbeccos modificerede Eagle's medium/F12-medium suppleret med 10 procent føtalt bovint serum og 5 procent antibiotikum-svampemiddel og inkuberet ved 37 grader C, med 5 procent CO og omrørt ved 25°C. rpm. Eksplantaterne blev behandlet med 10 ng/ml TNFa (R& D Systems, Minneapolis, MN, USA), 20 ng/ml interleukin 1 (IL1; R & D Systems) og 100 ng/ml LPS og analyseret ved 6, 12 og 24 timer senere.
Urinprotein. Urinprøver blev opsamlet på hvert tidspunkt ovenfor. Proteinkoncentrationen blev målt ved hjælp af DC Protein Assay-kittet (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), og albuminuri blev evalueret ved anvendelse af natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese og baseret på båndstørrelsen af bovint serumalbumin (16).
Pro-inflammatoriske cytokiner. Niveauer af IL6, IL1 og TNFa blev målt under anvendelse af sandwich-enzym-koblede immunosorbent assay-kits (PeproTech, Mexico City, Mexico).
Kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR). Total RNA blev isoleret fra nyrevæv under anvendelse af Trizolw Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i overensstemmelse med producentens instruktioner. Enkeltstrenget cDNA blev syntetiseret ved revers transkription under anvendelse af High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i overensstemmelse med producentens instruktioner. Realtids-PCR blev udført under anvendelse af 7500 Real-Time PCR-systemet (Applied Biosystems) med TaqMan-genekspressionsassays. Sammenlignende realtids-PCR-assays blev udført for hver prøve i tre eksemplarer. Primerne til WT1(Wilms tumor-1 gen) var fremadrettet:5-TCTGCGG AGCCCAATACAG-3'; omvendt:5-CACATCCTGAATGCCTCT GAAGA-3';og probe FAM:5-CACCGTGCGTGTGTATT-3'NFQ;protokollen blev udført i 95 grader i 10 minutter og 40 cyklusser ved 94 grader i 30 s og 64 grader C i 30'erne. Det relative udtryk for WT1(Wilms tumor-1 gen) gen blev beregnet ved hjælp af ligningen 2-AACT(23) med glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) gen (Applied Biosystems), der blev brugt til normalisering.
behandle nyresygdom cistanche ekstrakt
Ekspression af nephrin-mRNA blev bestemt med 3 ug cDNA og følgende primere: Fremad: 5'-CCCCAACATCG ACTTCACTT-3'og omvendt:5'-GGCAGGACATCCATGTAGAG-3'ved 94 grader i 30 s,60 gradgrad i 30 s og 72 grader i 30 s i 30 cyklusser(372 bp)(16). Til ekspression af GAPDH var primere, der blev brugt: Fremad:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3',revers:5'- TCCACCACCC TGTTGCTGTA-3', med følgende reaktionsbetingelser: 94 grader i 40 s, 60 grader i 30 s og 72 grader i 40 s i 35 cyklusser (452 bp). Udtryk for WT1(Wilms tumor-1 gen): Fremad 5'-CACATGAGAGAAACGCCCCTTCATGTG-3', baglæns 5'-TTTGAGCTGGTCTGAACGAGAAA-3'ved 94 grader i 40 sekunder, 64 grader i 30 sekunder og 72 grader i 30 sekunder i 35 cyklusser).(160 bp). Udtrykket af WT1(Wilms tumor-1 gen) isoformer KTS±og 17 AA±(F2-R2-primere til at detektere 17 AA plus /-og F3-R3 til at detektere KTS plus /-splejsningsisoformer) blev udført ved konventionel PCR ifølge Oji et al.(24). Bestemmelsen af ekspressionen af -actin blev udført ifølge Lauxet al. (25). Produkterne blev observeret under anvendelse af 10% polyacrylamidgelelektroforese for KTS±isoformen og en 2% agarosegel for 17AA±isoformen.
Immunfluorescens. Detnyrerfra LPS-behandlede mus og kontroller blev fikseret i 10 procent formalin og behandlet til hæmatoxylin- og eosinfarvning, immunhistokemi og immunfluorescens.
For at bestemme placeringen af WT1(Wilms tumor-1 gen) hos mus behandlet med LPS blev der anvendt {{0}}um-tykke snit af nyrevæv monteret på objektglas. Prøverne blev afvokset, permeabiliseret med Triton X-100 [0,1 procent Triton med 1 procent natriumcitrat i phosphatbufret saltvand (PBS)] og vasket tre gange med PBS. Vævene blev blokeret med 20 procent føtalt bovint serum i PBS i 30 minutter og inkuberet ved 4 grader natten over med monoklonalt antistof mod WT1(Wilms tumor-1 gen) sc{{0}}(F-6)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)fortyndet 1:100 i 10 procent føtalt bovint serum i PBS. Efter vask med PBS blev tilstedeværelsen af bundet antistof identificeret ved farvning med gede-anti-muse IgG Texas Red sc-2979(Santa Cruz Biotechnology). Objektglassene blev modfarvet med 4',6-diamidino-2-phenylindol. Til sidst blev objektglassene monteret og kvalitativt undersøgt ved hjælp af et Olympus BX61W1 konfokalmikroskop med et 40 × vandnedsænkningsobjektiv og Fluoview 4.0a software (Olympus, Tokyo, Japan).
Immunhistokemi. For at bestemme phosphoryleret (p)-WT1(Wilms tumor-1 gen) i podocytter fra LPS-behandlede mus, polyklonale antistoffer mod p-WT1(Wilms tumor-1 gen) Serin 393,sc-12933 og 363,sc-12934-R(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) blev brugt. Objektglas indeholdende 4-μm sektioner af nyrevæv blev afvokset og permeabiliseret Immunhistokemi blev udført under anvendelse af Universal Quick Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) i henhold til producentens protokol. Objektglassene blev undersøgt ved hjælp af et lysmikroskop med et 100× olie-immersionsobjektiv (Primo Star, Carl Zeiss, GmbH, Tyskland) .
Western blot. Totalt protein blev isoleret med 200 µl lysisbuffer (1 procent Triton, 150 mM NaCI, 25 mM Tris-HCl pH 7,6), og koncentrationen blev målt under anvendelse af et DC Protein Assay-kit (Bio-Rad). Protein (50 ug) blev separeret under anvendelse af 12 procent natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese og analyseret ved western blotting med WT1(Wilms tumor-1 gen) [F6] antistof sc-7585(Santa Cruz Bioteknologi). Prøver blev normaliseret under anvendelse af anti-GAPDH (AB2302; Sigma, San Louis, MO, USA). Proteiner blev visualiseret ved hjælp af et Lumi-Light Western Blotting-system sc-2048(Santa Cruz Biotechnology).
fordel ved cistanche: beskytte nyrerne
Resultater
Induktion afnyreskadei BALB/c-mus af LPS. Det er veletableret, at podocytskade er forbundet med øget proteinuri. Albumin og totalt protein i urinen blev bestemt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese og DC Protein Assay Kit (Bio-Rad). En signifikant stigning (p=0.001) af urinalbumin blev observeret 12 timer efter LPS-behandling, med en maksimal stigning ved 24 timer (215,87±1,41 ug/ml) sammenlignet med kontrollen (15,53) ±5,0 ug/ml） (Figur 1A). Koncentrationen af totalt urinprotein blev observeret at toppe ved 36 timer (26,02±2,43 mg/ml) og var signifikant højere sammenlignet med kontrollen (p=0.01) som vist i figur 1. Nyreskaden induceret af LPS blev analyseret ved histologi 24 timer efter behandling blev fokal glomerulonefritis observeret i nyrevæv, hvor den største skade blev fundet efter 36 timer, hvilket øgede størrelsen af glomerulus, med mesangial 48 timer efter, en gradvis genopretning af glomerulus, blev det observeret indtil 72 timer, som vist i figur 1C.
Figur 1. Effekt af systemisk inflammation på nyren.Koncentrationer af urinalbumin (A) og urinprotein (B) som markører for nyreskade hos mus behandlet med lipopolysaccharid. C: Et repræsentativt billede af renal histologi af mus (hæmatoxylin og eosin-farvning) på forskellige tidspunkter (12,24,36,48 og 72 timer) efter lipopolysaccharid-injektion, med sammenligning af en model for kronisk inflammation, forstørrelse 100×. Betydeligt forskellig ved: *n<><0,0]><0.00>
Produktion af de pro-inflammatoriske cytokiner TNFa og IL1 i serum fra LPS-behandlede mus. For at bekræfte, at nyreskade blev induceret af LPS, blev pro-inflammatoriske cytokinniveauer målt ved enzymbundet immunosorbent-assay. En stigning i TNFa og I1 blev observeret efter 12 timer (3,6±0,9 ng/ml, 11,9±5ng/ml) og op til 36 timer (4,44±0,1 ng/ml,18 ±0,9 ng/ml hhv.) af behandling med LPS, begyndende at falde derefter (figur 2A og B). IL6-ekspression blev øget ved 12 timer (49,5 ng/ml) og 36 timer (23,5 ng/ml) efter behandling, hvilket var signifikant højere end kontrollen (figur 2C).
Figur 2. Tidsforløb for niveauer af pro-inflammatoriske cytokiner tumornekrosefaktor-alfa(TNFa).(A), interleukin 1 (LL1)(B) og IL6(C) i serum fra mus efter intraperitoneal administration af lipopolysaccharid. Signifikant forskellig ved: *p Mindre end eller lig med 0.05,**p Mindre end eller lig med 0,01 og ***p Mindre end eller lig med 0,001 .
WTI-genekspression i nyrevæv fra LPS-behandlede mus. For at besvare vores centrale spørgsmål om WT1(Wilms tumor-1 gen) blev moduleret af den inflammatoriske proces, og dette havde nyrevirkninger, den totale ekspression af WT1(Wilms tumor-1 gen)-genet blev bestemt i nyreprøver fra mus med systemisk inflammation på forskellige tidspunkter i inflammationsforløbet. WT1(Wilms tumor-1 gen) mRNA var lavere på alle tidspunkter analyseret i forhold til kontrollen, med den laveste relative ekspression ved 36 timer og den højeste ved 12 timer efter induktion af systemisk inflammation som vist i figur 3A. Derudover blev det bestemt, om behandlingen med LP'er induceret modifikation af ekspressionen af isoformens exon5(17 AA±) og KTS±af WTI ved PCR. Dataene viste, at der ikke var nogen deregulering af ekspressionen af disse isoformer, da den samme adfærd blev observeret som kontrolgruppen uden behandling gennem hele den systemiske inflammatoriske proces induceret af LPS (figur 3B). WT1-protein blev vist ved western blotting at falde gennem hele den inflammatoriske proces med en let genopretning 36 timer efter behandling, men mængden af WT1 var mindre end mængden af den ubehandlede kontrol (figur 3C og D).
Figur 3. Effekt af lipopolysaccharid(LPS) på Wilms'tumor I (WT1)-genekspression i nyrevæv fra mus med systemisk inflammation.A: Relativ ekspression af WTI mRNA.B: Relativ ekspression af isoformerne KTS±og 17IAA±af WT1.C: Niveauer af WTI-protein ved immunoblotting efter LPS-behandling og D: Densitet af immunoblotting for WT1. Signifikant forskellig ved:**p Mindre end eller lig med 0.01 og ***p Mindre end eller lig med 0,001,
Fosforylering og lokalisering af WTI i nyrebiopsier af LPS-behandlede mus. En vigtig begivenhed i den post-translationelle modulering af WTI-protein er phosphoryleringen af aminosyre 393, som inducerer forskydningen af proteinet til cytoplasmaet. Fosforylering og lokalisering af WT1 i nyreprøver fra mus behandlet med LPS blev bestemt. Fosforylering af WT1 blev analyseret ved histokemi, hvilket indikerer tilstedeværelsen af phosphoryleret WT1 i cytoplasmaet af cellerne i sektioner af nyrevæv, der startede 12 timer efter induktionen af systemisk inflammation og blev opretholdt indtil 72 timer. WT1 blev phosphoryleret ved aminosyrer 3393 og 3393. som vist i figur 4A. Placeringen af WT1-proteinet blev analyseret ved immunfluorescens. Placeringen af WT1 i podocytter i nyreprøver fra LPS-behandlede mus var hovedsageligt cytoplasmatisk, hvorimod placeringen i podocytterne fra kontrolprøverne var uklar (figur 4B).
Figur 4. Fosforylering og lokalisering af Wilms'tumor I (WTI) i nyreprøver fra lipopolysaccharid-behandlede mus.A: Immunhistokemisk farvning for phosphoryleret (p)-WTI, der viser en stigning i phosphoryleret ved serin 393 og 363 startende 12 timer efter LPS-administration (forstørrelse 100× på lysmikroskopet). B: Lokalisering af WTI ved immunfluorescens i nyren; eksempler, der viser mindre nuklear lokalisering af WT1(kvadrater) 36 timer efter administration af lipopolysaccharid (forstørrelse 40× på det konfokale mikroskop).DAP1:4,6-Diamidino-2-phenylindol.
Modulering af ekspressionen af WTI og nephrin i nyrer fra LPS-behandlede mus. WT1 placering i cellen påvirker dens biologiske aktivitet. Det er blevet rapporteret, at cytoplasmatisk WT1 ikke udøver transkriptionel aktivitet; af denne grund blev ekspressionen af WT1 og nephrin mRNA analyseret ved PCR i nyreprøver fra mus behandlet med LPS (figur 5A). PCR indikerede et fald i nephrin mRNA fra 24 til 48 timer med en stigning efter 72 timer (figur 5B). ), mens ekspressionen af WTI mRNA steg efter 12 timer og derefter faldt i løbet af de kritiske timer med inflammation og nyreskade (24 og 36 timer) og (figur 5B).
Figur 5. Analyse af nephrin (NPHS1) og Wilms'tumor 1(WT1)mRNA-ekspression.A: I analysen af mRNA-ekspression faldt NPHSI og WTI 24, 36 og 48 timer efter induktion af systemisk inflammation ved brug af lipopolysaccharid. B: Kvantificering af båndene vist i A ved densitometri og normaliseret ved ekspression til glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase.
Nyreeksplantater behandlet med TNFa og IL1 modulerer ekspressionen af WTI og nephrin. For at bestemme, om cytokinerne modulerer ekspressionen af WT1, blev nyreeksplantater dyrket og behandlet med cytokinerne TNFa og IL1 i 6, 12 og 24 timer for at analysere ekspressionen af WT1 og nephrin ved PCR. Nephrin-mRNA-ekspression faldt, og WTI-mRNA-ekspression steg efter 24 timer i nyreeksplantater behandlet med TNFa og ILlb (figur 6).
Figur 6. Analyse af ekspressionen af nephrin (NPHS1) og Wilms'tumor 1 (WT1)mRNA i nyreeksplantater.A: mRNA-ekspressionsniveauer af NPHSi og WTI på forskellige tidspunkter i nyreeksplantater udsat for 10 ng/ml tumornekrosefaktor-alfa (TNF) og 20 nglml interleukin 16 (IL16)B: Relativ ekspression opnået ved hjælp af densitometrisk analyse af signalprodukt. Båndene blev kvantificeret ved normalisering til glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase.
Lokalisering af WTI i nyreeksplantater ved immunfluorescens. For at bestemme, om TNFa og IL var ansvarlige for ændringen i lokalisering af WT1-proteinet, blev musenyreeksplantater behandlet med TNFa og L1 og LPS i 24 timer. I eksplantater behandlet med ILlb og LPS var en kerne/cytoplasmatisk lokalisering af WTl-protein tydelig, og i eksplantater behandlet med TNFa blev der observeret cytoplasmatisk lokalisering af WT1-protein; i mellemtiden blev der i ubehandlede kontroller primært observeret nuklear lokalisering af WT1 (figur 7).
Figur 7. Lokalisering af Wilms'tumor 1(WTI)-proteinet ved immunfluorescens under anvendelse af Red TX (WT1) og 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI)(kerne) i podocytter fra behandlede nyreeksplantater med l0 ng/ml tumornekrosefaktor-alfa (TNFa),20 ng/ml interleukin 16(L1B) og lipopolysaccharid (LPS).Reduceret nuklear lokalisering af WT'er vist i eksplantater behandlet med TNFa sammenlignet med nuklear/cytoplasmatisk lokalisering af WTI under IL1- og LPS-behandlinger. Forstørrelse, 40×.
