Del Ⅰ Effekterne af kostprotein- og fiberniveauer på vækstpræstation, gigtforekomst, tarmmikrobielle samfund og immunregulering i gæslingers tarmnyreakse

Abstrakt

Den nuværende undersøgelse evaluerede virkningerne af kostprotein- og fiberniveauer på vækstpræstation, gigtforekomst, tarmmikrobielle samfund og immunregulering i gæslingers tarm-nyreakse. Et fuldstændigt randomiseret 2 £ 3 faktorielt design blev vedtaget med 2 CP-niveauer (180 [18CP] og 220 [22CP] g/kg) og 3 råfibre (CF)-niveauer (30 [lav CF], 50 [midt-CF], og 70 [høj CF] g/kg). Diæterne med høj CP eller lav CF disponerede gæslinger for gigt. De højproteindiæter forværrede nyrefunktionen; serumkoncentrationer af UA og Cr samt XOD-aktivitet hos 9-daggamle gæslinger, der blev fodret med 22 procent CP-diæter, blev signifikant øget. Selvom CF-niveauer fra 3 til 7 procent ikke direkte påvirkede nyrernes sundhed, kan stigende CF-niveauer accelerere stigningen af ​​probiotika i blindtarmen hos gæslinger og tilbageholde ondsindede bakterier, hvilket lindre tarmdysbiosen forårsaget af kost med højt proteinindhold. En analyse af den cecale mikrobiota via 16Sr RNA-sekventering afslørede, at forekomsten af ​​Enterococcus i 22CP-gruppen var højere end i 18CP-gruppen, men faldt med stigende CF-niveauer på d 9. Forekomsten af ​​Lactobacillus steg med stigende CF-niveauer. Derudover indikerede højere serum-LPS og proinflammatoriske cytokinkoncentrationer og opregulerede mRNA-ekspressionsniveauer i cecal-, tonsil- og nyrevæv, at højproteindiæter kunne aktivere TLR4/MyD88/NFkB-vejen og inducere både tarm- og nyrebetændelse hos unge gæslinger. Serum LPS-koncentrationer på d 9 viste sig at falde med stigende CF, selvom ændring af diæt-CF-niveauer ikke direkte påvirkede serumimmunindekset for gæslinger. Som konklusion udøvede den høje CP-diæt en negativ effekt på gigtforekomst, mikrobielle samfund og immunregulering i tarm-nyre-aksen hos gæslinger, mens passende øgede kostfiberniveauer hjalp med at opretholde tarmbalance og reducerede serum-LPS-koncentration. Vi foreslår en diæt på 18 procent CP parret med 5 procent CF som den optimale kombination til gæslingefoder.

Nøgleord

råfibre, protein, gæslingegigt, tarmmikrobielle samfund, tarm-nyre akse,Cistanches fordele.

Klik her for at videhvad er virkningerne af Cistanche på nyrerne

Introduktion

Gæs, som er planteædende, er afhængige af kostfibre for at udføre normale aktiviteter. Moderate råfiberniveauer (CF) i diæter er kendt for at øge sygdomsresistens og fremme vækst hos fjerkræ ved at modulere tarmens mikroøkologiske balance og forbedre immunforsvaret (Jha og Mishra, 2021) Wils-Plotz et al. (2013). rapporterede, at inklusion af diæt-pektin opregulerede IL- 12-ekspression i ileal slimhinde og øgede interferon-g-produktion i cecal-mandler. Adskillige undersøgelser har indikeret, at en diæt med lav CF reducerer mikrobiel diversitet såvel som den relative overflod af gavnlig mikrobiota i gæs ceca på d 70 og derved negativt påvirker vækstpræstation, næringsstofudnyttelse og tarmslimhindeimmunitet hos disse gæs (Li et al., 2017; Li et al., 2018a). Diætisk CF kan hjælpe med at opretholde tarmbarrierefunktionen ved at styrke slimhindens struktur og funktion, samt ved at øge populationen og mangfoldigheden af ​​kommensale bakterier i mave-tarmkanalen. Endnu vigtigere er det, at unge fugle angiveligt er mere følsomme over for ændringer i kostens næringsstoffer og tarmmikrobielle samfund end voksne (Gao et al., 2017). Undersøgelser af effekten af ​​diætiske CF-niveauer på tarmmikrobiota og sygdomsresistens hos gæslinger er imidlertid sparsomme.

Vækstpræstation hos fugle er mindre følsom over for ændringer i proteinniveauer end over for ændringer i kostens energi i foder for at tilfredsstille deres oprindelige volitante natur (Shi et al., 2006). Det er blevet rapporteret, at der ikke blev observeret nogen signifikant forskel i vægtøgning hos gæs med diætproteinniveauer i området fra 16 til 22 procent, hvilket virker for generelt i omfang (Summers et al., 1986). Omvendt har koncentrationerne af kostprotein en stærk effekt på tarmflorabalancen og sygdomsresistens hos fjerkræ (Lee et al., 2020). Visceral gigt, som hovedsageligt forekommer hos fugle, er en stofskiftesygdom forårsaget af nedsat nyrefunktion, efterfulgt af en ophobning af uratkrystaller i forskellige organer (Zhang et al., 2018). En tidligere undersøgelse af vores viste, at kost med højt proteinindhold var impliceret i nyreskade og tarmmikrobiota dysbiose forbundet med gigt hos gæslinger (Xi et al., 2020a). Resultaterne af denne undersøgelse viste, at sammenlignet med gæslinger, der blev fodret med 16 og 18 procent råprotein (CP), fik gæslinger, der blev fodret med 22 procent CP-diæter, tarm-epitelcelleskade og cecal mikrobiota dysbiose, hvilket førte til nyreskade eller endda gæslingegigt. Mave-tarmkanalens mikrobiota og dens metabolitter ser ud til at spille en central rolle i at styrke immuniteten af ​​tarm-nyre-aksen hos fjerkræ (De Cesare et al., 2019; Xi et al., 2020b). At identificere et passende ernæringsprogram, som fokuserer på virkningerne af diæt-CF- og CP-niveauer, kan således hjælpe med at minimere forekomsten af ​​gigt og forbedre immuniteten ved at opretholde tarmens mikroøkologiske balance og forbedre den relative immunregulering hos gæslinger.

Det intestinale mikrobiom udøver en dybtgående effekt på tarmens immunregulering, som påvirker den systemiske immunitet og bidrager til immunbalancen. Ændringer i kostens sammensætning, herunder CP- og CF-niveauerne, påvirker sammensætningen og metaboliske aktiviteter af mikrobiota, der tilpasser sig tarmmiljøet (Liu et al., 2014). Hos fjerkræ kan enhver forstyrrelse af mikrobiomet inducere en ubalance i systemisk immunitet, hvilket bidrager til et fald i sygdomsresistens. I en tidligere undersøgelse af vores fandt vi, at tarmmikrobiota dysbiose øgede risikoen for visceral gigt hos gæslinger ved at øge inflammation såvel som translokation af tarm-afledt lipopolysaccharid (LPS) i tarm-nyre-aksen. I denne komplekse kaskade aktiverer LPS-ligering den nukleare faktor, kappa-let-kæde-enhancer af den aktiverede B-celle (NF-kB) vej og produktionen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner, såsom interleukin 1b (IL1b) og tumornekrosefaktor a (TNFa), hvilket fremmer udviklingen af ​​immunologisk tolerance i både tarm og nyre hos gæslinger (Xi et al., 2019). Denne undersøgelse fokuserede på at undersøge de mikrobielle samfund, der bor i blindtarmen hos gæslinger fodret med forskellige niveauer af diætisk CP og CF, og målte ændringer i gigtforekomsten ved at analysere immunreguleringen og inflammatoriske reaktioner induceret i tarm-nyre-aksen.

Standardiseret Cistanche

Materialer og metoder

1. Etisk godkendelse

Undersøgelsen blev godkendt af forskningsudvalget for Jiangsu Academy of Agricultural Sciences og udført i henhold til reglerne for administrationen af ​​anliggender vedrørende forsøgsdyr (bekendtgørelse nr. 63 fra Jiangsu Academy of Agricultural Science den 8. juli 2014). Alle eksperimenter blev udført af ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) retningslinjer.

2. Eksperimentelt design

Denne undersøgelse blev udført fra den 2. til den 17. november, 2020, på Forsøgsdyrscentret ved Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, Kina). I alt 1,620 en dag gamle Taizhou-gæs (Anser domestica, 100 procent ,), leveret af Tianzhijiao Breeding Geese Limited Company (Chuzhou, Kina), blev tilfældigt tildelt til 6 forsøgsgrupper. Hver behandling havde 6 replikater, og hver replikat indeholdt 45 fugle. Et fuldstændigt randomiseret 2 £ 3 faktorielt design blev brugt til eksperimentet. Seks diæter med 2 CP-niveauer og tre CF-niveauer blev fremstillet (tabel 1). De 2 CP-niveauer var 180 (18CP) og 220 (22CP) g/kg, og de tre CF-niveauer var 30 (lav CF), 50 (midt-CF) og 70 (høj CF) g/kg. Alle gæslinger blev opdrættet i et termostatisk hus med rustfri stålbure af identisk størrelse (1,20 £ 1,00 £ 0,50 m3, 9 gæslinger pr. bur, belægningstæthed: 7,5 fugle/m2), som blev placeret 0,50 m over jorden. Gæslingerne blev fodret under standard forvaltningsbetingelser med pelletfoder og ad libitum vand. Antallet af hængende foderautomater og nippeldrikkere i hvert bur var tilstrækkeligt gennem hele undersøgelsen. Omgivelsestemperaturen blev holdt på 30 grader fra d 0 til 3, 29 grader fra d 4 til 6, 28 grader fra d 7 til 9 og 26 grader fra d 10 indtil slutningen af ​​eksperimentet. Den relative luftfugtighed i hele den 21-d forsøgsperiode var cirka 60 procent. Lyskilderne (hvidt lys, 400 −760 nm) blev udlignet til en belysningsstyrke på 15 § 0,3 lux på fuglehovedniveau, med et lysskema på 22 timers lys fra d 0 til 3, 18 timers lys fra d 4 til 14 og 16 timers lys fra d 15 til 21 på en 24- timers cyklus.

The basal diet was formulated to meet or exceed National Research Council (NRC, 1994) nutrient requirements for growing geese. The composition of experimental diets is presented (Table 1). Dietary samples (>1 procent frisk foder) tilfældigt erhvervet fra 5 steder blev blandet til analyse. CP og CF blev målt i henhold til GB/T6432 (kinesisk national standard: bestemmelse af råprotein i foder) og GB/T6434 (kinesisk national standard: bestemmelse af råfibre i foder).

ADFI og BW (levende vægt) af gæslinger blev registreret ved hjælp af en elektronisk vægt (YP60001, Hengji, Shanghai, Kina) før fodring under testen, og ADG og foderkonverteringsforhold (FCR) blev beregnet ved afslutningen af ​​eksperimentet. Derudover blev den kumulative morbiditet af gigt af alle replikater (hver replikat indeholdt 45 fugle) blandt forskellige behandlinger summeret efter forsøgsperioden. Selektionsstandarden for gigt blev defineret som en gæsling, der udviser grove nyrelæsioner og en serumurinsyrekoncentration (UA) over marginalværdien af ​​uratovermætning (han, 416 mmol/L og hun, 357 mmol/L). De typiske fremherskende grove læsioner i nyrerne er blege, plettede og hævede, og nyretubuli og urinledere er udspilede med overskydende urater (Xi et al., 2020a).

Herba Cistanche

3. Serummetabolitmåling

Seksogtredive gæslinger (n=6 gæslinger/behandling) blev tilfældigt udvalgt til øjeblikkelig blodopsamling (5 ml/gåsling), efter halshugning, via blodopsamlingsrør uden antikoagulant på henholdsvis d 9 og 18. Alle blodprøver blev inkuberet ved 37 grader i 2 timer efter opsamling og centrifugeret ved 1,5 {{10}}0 £ g i 15 min. Opnåede sera blev opbevaret i 0,6 ml Eppendorf-rør ved 80 grader indtil videre analyse. Serum-UA-niveauer blev bestemt ved anvendelse af phosphowolframsyrekolorimetri. Koncentrationer af kreatinin (Cr) og urinstofnitrogen (UN) samt xanthinoxidase (XOD) aktivitet blev bestemt via enzymatisk kolorimetri under anvendelse af et mikropladespektrofotometer (Promega Corporation, Madison, WI). Disse sæt blev leveret af Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina); koderne var C012 (UA), C011-2 (Cr), C013-2 (UN) og A002 (XOD). Serum-IgM-, IgA- og IgG-koncentrationer i forsøgsgæssene blev målt under anvendelse af gåseimmunoglobulin ELISA-sæt købt fra Shanghai J&I Biotechnology Co., Ltd (Shanghai, Kina). Serum cirkulerende immunkomplekser (CIC), IL-1b og TNF-a-koncentration blev bestemt ved hjælp af et kommercielt gåse-ELISA-kit (Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kina). Aktiviteten af ​​diaminoxidase (DAO) blev målt via enzymatisk kolorimetri under anvendelse af en automatisk biokemisk analysator (Hitachi, Tokyo, Japan). Serum-LPS blev målt under anvendelse af det traditionelle Limulus-assay (Limulus Assay Biotechnology Company Ltd., Xiamen, Kina). Detektionsintervallerne for LPS i Limulus-assayet varierede fra 0,015 til 0,6 EU/mL. Alle materialer, der blev brugt til at indsamle blod og måle endotoksiner, var pyrogenfri. Alle assays blev udført i overensstemmelse med producentens instruktioner. Serumprøver blev testet i tre eksemplarer. Intra- og interassay-variationskoefficienter for assayene var<10% and <15%, respectively.

4. Histomorfologisk observation

Ceca (længde {{0}} cm) af 36 gæslinger (n=6 gæslinger/behandling) blev opsamlet efter blodprøvetagning d 9 og 18 til histologisk analyse. Prøver indsamlet fra gæslinger blev fikseret i 4 procent paraformaldehyd, indlejret i paraffin og sektioneret (skivetykkelse: 3 mm; 4 skiver pr. gæsling). Patologiske ændringer i blindtarmen (ca. 7 cm distalt for den pyloriske sphincter) blev undersøgt under et lysmikroskop (OLYMPUS, Tokyo, Japan) efter hæmatoxylin og eosin (HE) farvning. Villus højde og krypt dybde af blindtarmen blev målt ved hjælp af ImageJ software (version 1.8.0; National Institutes of Health, Bethesda, MD). Otte målinger af forskellige intakte villi pr. skive blev registreret (8 målinger i 3 på hinanden følgende synsfelter). Statistiske analyser af histologiske målinger blev udført baseret på et gennemsnit på 32 målinger pr. gæsling (4 skiver pr. gæsling og 8 målinger pr. skive). Bægercelletæthed blev beregnet som bægercelleantallet divideret med den tilsvarende villuslængde, som derefter blev beregnet som gennemsnit og udtrykt som pokalcelleantallet pr. 100 mm villuslængde.

Cistanche tubulosa

5. 16S rRNA-sekventering af blindtarmsindholdet

Blindtarmens indhold af gæslinger (6 gæslinger/ behandling £ 6 grupper £ prøvetagning to gange=72 gæslinger) blev opsamlet på d 9 og d 18 i 2 mL sterile, indvendigt gevindskårne kryogene hætteglas og straks opbevaret i flydende nitrogen til 16S rDNA-analyse . DNA fra prøver af blindtarmsindhold blev ekstraheret ved hjælp af et MicroElute Genomic DNA Kit (D3096-01, Omega Biotek Inc., Norcross, GA) efter producentens instruktioner. Blankprøver bestående af ubrugte podninger blev behandlet gennem DNA-ekstraktion, og de blev kontrolleret for ikke at producere 16S amplikon. Total DNA blev elueret i 50 ml elueringsbuffer under anvendelse af en modificeret procedure beskrevet af producenten (QIAGEN, Düsseldorf, Tyskland) og opbevaret ved 80 grader.

Ved at bruge det samlede DNA fra prøver som en skabelon og 16S rDNA-primere (343F - 50 - TACGGRAGGCAGCAG -30; 798R - 50 - AGGGTATCTAATCCT-30), amplificerede vi V3−V4-regionen af ​​bakteriel 16S rRNA. Alle reaktioner blev udført i en 25 ml (total volumen) blanding indeholdende 25 ng genomisk DNA-ekstrakt, 12,5 ml PCR Premix, 2,5 ml af hver primer og vand af PCR-kvalitet for at justere volumenet. PCR-produkter blev normaliseret ved hjælp af en AxyPrep Mag PCR Normalizer (Axygen Biosciences, Union City, CA), som gjorde det muligt at springe kvantificeringstrinnet over, uanset det PCR-volumen, der blev indsendt til sekventering. Amplicon-puljer blev forberedt til sekventering under anvendelse af AMPure XT-perler (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA; udført af OebioTech Co., Ltd, Shanghai, Kina). Størrelsen og mængden af ​​amplikonbiblioteket blev vurderet ved hjælp af henholdsvis LabChip GX (Perkin Elmer, Waltham, MA) og et Kapa Library Quantification Kit for Illumina (Kapa Biosciences, Woburn, MA). PhiX Control-biblioteket (v3) (Illumina) blev kombineret med amplicon-biblioteket (forventet til 30 procent). Biblioteket blev grupperet med en tæthed på ca. 570 K/mm2. Bibliotekerne blev sekventeret på 300PE MiSeq-kørsler, hvor det ene bibliotek blev sekventeret med begge protokoller ved hjælp af standard Illumina-sekventeringsprimere, hvilket eliminerede behovet for en tredje (eller fjerde) indekslæsning. Aflæsningerne blev filtreret ved hjælp af kvantitativ indsigt i mikrobiel økologi (QIIME;) kvalitetsfiltre. CDHIT-pipelinen blev brugt til at vælge operationelle taksonomiske enheder (OTU'er) ved at udarbejde en OTU-tabel. Sekvenser med 97 procent lighed blev tildelt til OTU'er. Repræsentative sekvenser blev valgt for hver OTU, og taksonomiske data blev derefter tildelt hver repræsentativ sekvens ved hjælp af Ribosomal Database Project (RDP) klassifikator. GenBank-adgangsnummeret for disse OTU-nukleotidsekvenser er SAMN21014082. For at estimere alfa-diversitet blev OTU-tabellen rarificeret, og følgende 4 metrics blev beregnet: Chao1-metrikken til at estimere rigdom; den observerede artsmetrik som et antal unikke OTU'er fundet i prøven; Shannon-indekset; og Simpson-indekset.

6. Realtids PCR

ings (n {{0}} gæslinger/behandling) blev opsamlet på d 9 og 18 til real-time PCR (RT-PCR) analyse. Total RNA blev ekstraheret fra vævene ved hjælp af TRIzol-reagens (Life Technologies, Grand Island, NY) og revers transskriberet ved hjælp af et Reverse Transcription Levels-kit (TaKaRa, Dalian, Kina) i henhold til producentens protokol. b-actin blev anvendt som en invariant kontrol. Primere blev designet ved hjælp af Primer Premier 5.0-softwaren, og deres sekvenser er angivet (tabel 2). RT-PCR blev udført under anvendelse af SYBR Premix Ex Taq (Roche, Basel, Schweiz). Alle RT-PCR'er blev udført i tre eksemplarer. De relative ekspressionsniveauer af målgener blev bestemt under anvendelse af de 2 DDCt-metoder.

7. Dataanalyse

Eksperimentelle data afledt af 6 replikater pr. behandling blev analyseret under anvendelse af IBM SPSS Statistics 16-programmet (IBM Corporation, Somers, NY). Hvert replikat blev betragtet som en eksperimentel enhed, og den anvendte statistiske procedure var en multivariat variansanalyse under anvendelse af den generelle lineære modelprocedure (GLM). Når signifikante forskelle blev bestemt, blev behandlingsmidlerne separeret og sammenlignet under anvendelse af Duncans multiple-range-test. En tosidet test blev betragtet som statistisk signifikant ved et sandsynlighedsniveau på mindre end 5 procent (P < 0.05).

Yumeng Xi *, Yuanpi Huang,y Yue Li *, Yunmao Huang #, Junshu Yan * og Zhendan Shi *.

* Nøglelaboratorium for afgrøde- og dyreintegreret landbrug i Ministeriet for Landbrug og Landdistrikter, Husdyrbrugsinstituttet, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, Kina;

# College of Animal Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510000, Kina.