Del Ⅰ Smad3-mangel forbedrer ø-baseret terapi for diabetes og diabetisk nyreskade ved at fremme celleproliferation via den E2F3-afhængige mekanisme

Abstrakt

1. Begrundelse

Dårlig celleproliferation er en af ​​de skadelige faktorer, der hindrer ø-celle-erstatningsterapi for patienter med diabetes. Smad3 er en vigtig transkriptionel faktor for TGF-signalering og har vist sig at fremme diabetes ved at hæmme celleproliferation. Derfor antager vi, at Smad3-mangelfulde øer kan være en ny celleerstatningsterapi til diabetes.

2. Metoder

Vi undersøgte denne hypotese i streptozocin-inducerede type-1 diabetiske mus og type-2 diabetiske db/db mus ved at transplantere henholdsvis Smad3 knockout (KO) og vildtype (WT) øer under nyrekapslen. Effekterne af Smad3KO versus WT-øerstatningsterapi på diabetes og diabetisk nyreskade blev undersøgt. Derudover blev RNA-seq anvendt til at identificere det nedstrøms målgen, der ligger til grund for Smad3-reguleret celleproliferation i Smad3KO-db/db versus Smad3WT-db/db museøer.

3. Resultater

Sammenlignet med Smad3WT-øterapi gav behandling med Smad3KO-øer en meget bedre terapeutisk effekt på både type-1 og type-2 diabetes ved at sænke serumniveauet af blodsukker og HbA1c betydeligt og beskytte mod diabetiske nyreskader ved at forhindre en stigning i serumkreatinin og udvikling af proteinuri, mesangial matrixudvidelse og fibrose. Disse var forbundet med en signifikant stigning i proliferation af transplanterede celler og blodinsulinniveauer, hvilket resulterede i forbedret glucoseintolerance. Mekanistisk afslørede RNA-seq, at sammenlignet med Smad3WT-db/db museøer, opregulerede deletion af Smad3 fra db/db museøer markant E2F3, en pivotal regulator af cellecyklus G1/S-indgang. Yderligere undersøgelser viste, at Smad3 kunne binde til promotoren af ​​E2F3 og dermed hæmme celleproliferation via en E2F3-afhængig mekanisme, da dæmpning af E2F3 ophævede den proliferative effekt på Smad3KO-celler.

4. Konklusion

Smad3-mangelfuld ø-erstatningsterapi kan markant forbedre både type-1 og type-2 diabetes og beskytte mod diabetisk nyreskade, som medieres af en ny mekanisme af E2F3-afhængig celleproliferation.

Nøgleord

Smad3, øtransplantation, diabetes, E2F3, cellecyklus.

Klik her for at fåCistanche fordele

Introduktion

type-1 og 2 diabetes mellitus (T1DM og T2DM). celle- eller øtransplantation er en attraktiv terapi og er blevet anvendt med succes hos patienter med T1DM. De øer eller celler, der bruges til transplantation, er normalt fra den dødelige donor eller inducerede pluripotente stamceller (iPSC) [1, 2]. Mere end 1500 tilfælde af klinisk ø-transplantation er blevet gennemført hos patienter med T1DM efter den veletablerede Edmonton-protokol [1]. Selvom omkring 50 procent af patienterne holder insulinuafhængighed i 5 år efter transplantationen, er engraftmentsvigt et almindeligt problem klinisk. En af de faktorer, der hindrer ø-transplantation, er den ekstremt lave proliferationsrate af de transplanterede ø-celler [3]. Derudover kan de farlige stimuli fra graft-mikromiljøet, såsom inflammation, immunallotransplantatafstødning og metabolisk stress, få transplanterede celler til at gennemgå apoptose og nekrose, hvilket resulterer i progressivt grafttab [1]. Derfor er forbedring af den transplanterede celleproliferation afgørende for succesen med øtransplantationsbaseret behandling af diabetes.

Transformerende vækstfaktor-beta (TGF-) signalering spiller pleiotrope roller i mange biologiske processer. Signaltransduktionen initieres ved binding af TGF-liganden til dens type 2-receptor TGFBR2. Sidstnævnte rekrutterer og aktiverer type 1-receptor TGFBR1 ved phosphorylering. Aktiveret TGFBR1 phosphorylerer yderligere de receptorregulerede Smad-proteiner (R-Smads), Smad2 og Smad3. R-Smads danner et kompleks med Smad4, som translokerer ind i kernen for at transskriptionelt regulere målgener [4, 5]. Det er rapporteret, at pancreas-øen opretholder universelt aktiveret TGF-signalering som afsløret af et relativt højt niveau af phosphoryleret Smad2/3 under de fysiologiske forhold. Men som svar på insulinbehovet er TGF-signalaktiviteten nedsat, ledsaget af øget celleproliferation [6]. Derudover fremmer farmakologisk hæmning af TGF-signalering celleproliferation in vitro og in vivo [7, 8]. Endnu vigtigere er, at deletionen af ​​Smad3 resulterer i mere robust celleproliferation sammenlignet med deletionen af ​​Smad2 hos mus med delvis pancreatektomi, hvilket indikerer, at Smad3, men ikke Smad2, er den primære effektor nedstrøms for TGF-signalering til at regulere celleproliferation [6]. Senere undersøgelser viser, at Smad3 undertrykker celleproliferation ved at inducere ekspressionen af ​​cyclin-afhængige kinasehæmmere (CDKI'er), herunder p16, p21 og p57 [7, 8].

Vores seneste arbejde fandt også ud af, at sletningen af ​​Smad3 i db/db-mus (Smad3KO-db/db) forhindrer indtræden af ​​åbenlys diabetes uden fedme, hyperglykæmi, insulinresistens og glucoseintolerance. Interessant nok viser Smad3KO-db/db-mus ø-hyperplasi med signifikant øget celleproliferation og vedvarende hyperinsulinemi [9]. Dette indebærer, at Smad3 er sygdomsfremkaldende ved diabetes, og at målretning mod Smad3 i celler kan repræsentere en ny celle- eller ø-erstatningsterapi for diabetes. Dette blev undersøgt i denne undersøgelse ved at bruge Smad3 knockout (Smad3KO) øtransplantation i streptozocin (STZ)-inducerede type-1 diabetiske mus og i type-2 diabetiske db/db mus.

Cistanche kosttilskud

Resultater

1. Smad3KO-øtransplantation gav en bedre terapeutisk effekt på STZ-induceret type-1 diabetes

For at sammenligne den terapeutiske effekt af Smad3KO versus Smad3WT ø på diabetes, udførte vi først syngen ø-transplantation under nyrekapslen af ​​STZ-inducerede diabetiske mus, hvor hyperglykæmi er forårsaget af cellemangel. Diabetiske mus på dag 7 efter STZ-injektion blev transplanteret med 3 doser øer (50, 100 og 200 øer pr. mus), som var frisk isoleret fra Smad3WT- eller Smad3KO-mus. Både tilfældige blodsukkerniveauer (RBG) og fastende blodsukkerniveauer (FBG) blev overvåget ugentligt i 16 uger. Transplantationsdoserne blev udvalgt baseret på de tidligere resultater om, at transplantation af 300 øer er tilstrækkeligt til hurtigt at genoprette euglykæmi i celleudtømte mus [10]. Som vist i figur 1A til D udviklede de diabetiske mus med falsk operation vedvarende hyperglykæmi over 16 uger. Transplantation med en lav dosis (50 øer) af Smad3KO- eller WT-øer kunne ikke reducere både RBG- og FBG-niveauer. Diabetiske mus, der modtog 100 Smad3KO-øer, men ikke den samme dosis af Smad3WT-øer, genfandt dog gradvist den normale RBG og FBG svarende til dem, der modtog 200 Smad3KO- eller WT-øer. Vi fandt også, at den blodsukkersænkende effekt udelukkende tilskrives de transplanterede øer, da hyperglykæmi gentog sig straks, når den ø-bærende nyre blev fjernet fra 16 uger og fremefter (pil, figur 1A).

Forringet glukosetolerance blev også udviklet hos de sham-opererede diabetiske mus, som blev signifikant lindret ved at transplantere den høje dosis (200) af Smad3KO- eller WT-øer og 100 Smad3KO-øer, men ikke ved den lave dosis på 50 Smad3KO- eller WT-øer og 100 Smad3WT-øer (figur 1E og G). Som forventet udviklede STZ-inducerede diabetiske mus ikke insulinresistens.

I modsætning hertil blev der observeret forlænget respons på insulin hos hyperglykæmiske mus med den falske operation eller ineffektiv terapi med 50 Smad3WT- eller KO-øer og 100 Smad3WT-øer (figur 1F og H). I overensstemmelse med den genvundne euglykæmi og forbedret glukoseintolerance, viste diabetiske mus, der fik 200 Smad3KO- eller WT-øer og 100 Smad3KO-øer, men ikke 50 Smad3KO- eller WT-øer og 100 Smad3WT-øer, nedsat blod-HbA1c-niveau ledsaget af øget HbA1c-niveau IFigur og J). Desuden forårsagede STZ-induceret diabetes væksthæmning, som delvist blev genvundet i mus transplanteret med 200 Smad3KO- eller WT-øer og 100 Smad3KO-øer (figur S1). Derudover udviklede STZ-inducerede diabetiske mus også diabetisk nefropati efter 16 uger som vist ved mesangial ekspansion, interstitiel fibrose, proteinuri og øget serumkreatinin (figur 2). Spændende nok resulterede behandling med 100 Smad3KO-øer, men ikke 100 Smad3WT-øer, i beskyttelse mod udvikling af diabetisk nyresygdom, selvom dette også var bemærkelsesværdigt hos diabetiske mus behandlet med den høje dosis på 200 Smad3KO- eller WT-øer (Figur 2). Disse resultater viser en bedre terapeutisk effekt af Smad3KO-øer på STZ-induceret diabetes og tyder på en reduktion på ca. 50 procent af de øer, der er nødvendige for at opnå kompetent glykæmisk kontrol og beskyttelse mod diabetisk nyreskade ved at bruge Smad3-deficient ø-erstatningsterapi til diabetes.

2. Smad3KO-øtransplantation gav en bedre terapeutisk effekt på type-2 diabetes i db/db-mus

Det er blevet rapporteret, at ø-transplantation forbedrer T2DM i en højfedt-diæt-fodret musemodel udfordret med en lav dosis STZ [11]. Vi undersøgte derefter, om transplantation af Smad3KO-øer også giver en bedre terapeutisk effekt på T2DM ved at behandle db/db-mus med 250 Smad3KO- eller WT-øer fra den prædiabetiske alder fra uge 4 til uge 12. Vi fandt, at transplantation med enten Smad3KO eller WT øer påvirkede ikke væksten af ​​recipient-db/db-mus (figur S2). Selvom db/db-mus, der modtog Smad3WT-ø-transplantation, viste et trendfald af RBG og FBG sammenlignet med de sham-opererede db/db-mus, viste db/db-mus transplanteret med den ækvivalente dosis af Smad3KO-øer et signifikant fald i RBG og FBG (figur 3A og B). Glucoseintolerance udviklet i db/db-mus blev signifikant forbedret af Smad3KO, men ikke Smad3WT-ø-transplantation, selvom insulinresistens ikke blev ændret (figur 3C-F). Sammenlignet med Smad3WT-ø-transplantation eller falsk operation udviste db/db-mus behandlet med Smad3KO-ø-transplantation også et signifikant fald i blodets HbA1c-niveauer, som blev ledsaget af en bemærkelsesværdig stigning i niveauet af blodinsulin (figur 3G og H). Ydermere svækkede behandling med 250 Smad3KO-øer den glomerulære mesangiale ekspansion betydeligt (figur 4). Men da der ikke blev påvist signifikante ændringer i serumkreatinin, proteinuri og nyrefibrose i db/db-mus i en alder af 12 uger, blev der ikke fundet tydelige ændringer i disse parametre i db/db-mus behandlet med Smad3KO eller WT-øer (figur 4). Samlet indikerer disse data igen, at transplantation af Smad3KO-øer giver en bedre behandling i forhold til Smad3WT-øer i type-2 diabetiske db/db-mus.

3. Smad3-mangel fremmer celleproliferation i de podede øer i både STZ-inducerede diabetiske mus og db/db-mus.

Vi undersøgte derefter de potentielle mekanismer, hvorved transplantation af Smad3KO-øer giver en bedre terapeutisk effekt på både T1DM og T2DM. Vi undersøgte først cellemassen i de podede øer ved immunfarvning med insulin. I STZ-induceret diabetes lykkedes det ikke at påvise eksistensen af ​​insulin-positive celler under nyrekapslen hos mus podet med 50 Smad3KO- eller WT-øer i uge 16 efter transplantation, hvilket indikerer tab af celler. Uventet viste diabetiske mus, der modtog 100 Smad3WT-øer, kun nogle få dispergerede insulinproducerende celleklynger, men dette var stort set øget hos diabetiske mus behandlet med 100 Smad3KO-øer, hvilket resulterede i næsten en 17-fold stigning i cellemassen (figur 5A og B). Interessant nok udviste diabetiske mus givet en høj dosis på 200 Smad3KO- eller WT-øer en lignende cellemasse (figur 5A og B). Disse resultater var i overensstemmelse med den dosisafhængige effekt af ø-transplantation på hyperglykæmi som vist i figur 1A og B.

Vi undersøgte derefter, om den øgede cellemasse i Smad3KO-ø-transplantater er forbundet med øget celleproliferation. Tofarvet immunofluorescens viste, at musene, der blev behandlet med 100 Smad3WT-øer i uge 16 efter ø-transplantation, viste upåviselige eller sjældne PCNA plus insulin plus celler, som primært var øget hos dem, der modtog 100 Smad3KO-øer eller en høj dosis på 200 T Smad3KO eller W. øer (figur 5C og D). Vi undersøgte derefter, om Smad3 kontrollerer den tidlige celleproliferation i de transplanterede øer under progressive diabetiske forhold ved BrdU-mærkning på dag 7 efter ø-transplantation, når niveauerne af blodsukker forblev høje. BrdU-mærkning afslørede en 3-fold stigning i BrdU plus insulin plus celler i 100 Smad3KO-ø-transplantater sammenlignet med den samme dosis af Smad3WT-ø-transplantater (figur 5E og F). Dette fund indikerer, at Smad3-mangel i vid udstrækning fremmer celleproliferation gennem S-fase-cellecyklussen under hyperglykæmiske forhold, hvilket bidrager til en 17-foldig stigning i cellemassen som set ved uge 16 efter ø-transplantation (figur 5A og B) . Tilsammen tyder alle disse resultater på, at Smad3-mangel i vid udstrækning fremmer celleproliferation og derved genopretter euglykæmi i STZ-induceret type-1 diabetes.

Tilsvarende blev høje celleproliferative aktiviteter også påvist i Smad3KO-ø-transplantater i type-2 diabetiske db/db-mus som vist ved en 5-dobbelt stigning i cellemassen sammenlignet med dem med Smad3WT-ø-transplantater ved alder på uge 12 efter ø-transplantation (figur 6A og B), som var forbundet med en 2.5--fold stigning i insulin plus PCNA plus celler (figur 6C og D). Ved at bruge BrdU-mærkning opdagede vi også en 3-dobbelt stigning i insulin plus BrdU plus celler i Smad3KO ø-transplantater på dag 7 efter transplantation i 12-ugegamle db/db mus (Figur 6E og F). Dette fund bekræfter igen, at celler, der mangler Smad3, er resistente over for hyperglykæmi og forbliver meget proliferative for at opretholde cellemassen for at forbedre T2DM.

4. Smad3-mangel fremmer celleproliferation in vitro

Det er blevet rapporteret, at farmakologisk hæmning af TGFBR1 fremmer celleproliferation in vitro [7, 8]. Vi undersøgte derfor, om den genetiske deletion af Smad3 også fremmer celleproliferation ved at dyrke Smad3KO- og WT-øcellerne efterfulgt af BrdU-mærkning. Dobbelt immunfluorescens viste, at øceller, der manglede Smad3, udviste et signifikant højere niveau af BrdU-positive celler (5,7 procent) sammenlignet med Smad3WT-øceller (2,4 procent) (figur 7A og B). Den forøgede proliferation af Smad3KO-celler blev også demonstreret ved øget ekspression af PCNA som afsløret ved Western blot-analyse (figur 7C), hvilket bekræfter den centrale regulatoriske rolle for Smad3 i celleproliferation.

5. RNA-seq identificerer E2F3 som et Smad3-målgen, der regulerer celleproliferation

For at afdække nedstrømsmekanismen for Smad3 til regulering af celleproliferation udførte vi RNA-seq i øer isoleret fra db/m eller db/db mus med eller uden deletion af Smad3-genet inklusive Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT -db/m og Smad3KO-db/m mus som tidligere beskrevet [9]. Pathway berigelse analyse blev udført blandt de differentielt udtrykte gener (DEGs) mellem Smad3WT og Smad3KO øer i db/m eller db/db baggrund. I den genetiske baggrund af db/db resulterede Smad3KO i væsentlige ændringer i cellecyklusrelaterede gener eller veje som afsløret af GO- og KEGG-analyse (figur 8A og figur S3). I betragtning af de individuelle gener afslørede RNA-seq-analyse en stigning i ekspressionen af ​​gener, der involverer cyclin, cyclin-afhængige kinaser (CDK'er) og celledelingscyklus (CDC) proteinfamilie i Smad3KO-db/db øer sammenlignet med Smad3WT-db /db-øer, som blev yderligere valideret i dyrkede Smad3KO-ø-celler ved RT-PCR (figur S4 A og C). I modsætning hertil forårsagede Smad3KO i den genetiske baggrund af db/m ingen bemærkelsesværdig indflydelse på cellecyklusrelaterede gener eller veje (figur S3B og C). Det er rapporteret, at TGF-/Smad3-signalering negativt regulerer cellecyklussen ved at inducere de cyclinafhængige kinaseinhibitorgener (CDKI'er) [7, 8, 12]. Overraskende nok blev ingen af ​​disse CDKI-geners ekspression undertrykt i Smad3KO-db/db-øer in vivo og dyrkede Smad3KO-øceller som afsløret af henholdsvis RNA-seq og RT-PCR (figur S4B og C). I modsætning hertil blev ekspressionsniveauerne af flere CDKI-gener som p16, p18 og p57 endda opreguleret i dyrkede Smad3KO-øceller (figur S4C). Dette indebærer, at der findes en alternativ mekanisme i Smad3-reguleret celleproliferation.

Vi analyserede således Smad3-bindingspotentialet for promotorsekvenserne af 224 DEG i cellecyklussens GO-term med ECR-browsersoftwaren (figur 8A). Blandt dem fik et gen ved navn E2F3 vores opmærksomhed, da det er en nøgle- og terminal eksekutør, der regulerer G1/S-indgang i cellecyklussen [13, 14]. Vi fandt et potentielt Smad3-bindingssted i promotoren af ​​muse-E2F3-locuset, som også er konserveret i mennesker (figur 8B).

Cistanche tubulosa

For at undersøge, om E2F3 er afgørende for Smad3-reguleret celleproliferation, undersøgte vi sammenhængen mellem E2F3 og Smad3 i øer. I overensstemmelse med RNA-seq påviste immunhistokemi, at ekspressionen af ​​E2F3 stort set var reduceret i øerne i Smad3WT-db/db-mus, men steg kraftigt i Smad3KO-db/db-mus (figur 8C). Ydermere blev øget E2F3-ekspression også observeret i dyrkede Smad3KO-øceller på både RNA- og proteinniveauer (figur 8 DF). I modsætning hertil ophævede adenovirus-medieret tavshed af E2F3 den proliferative aktivitet af celler (insulin^plusBrdU^plus) i Smad3KO-øceller (figur 9), hvilket afslører en væsentlig rolle for E2F3 i Smad3-reguleret celleproliferation.

For yderligere at bekræfte den forudsagte binding af Smad3 i E2F3-promotoren udførte vi kromatinimmunpræcipitation (ChIP) i isolerede museøer (figur 10A). Specificiteten af ​​Smad3-antistoffet anvendt til ChIP blev oprindeligt valideret ved immunpræcipitation i museøer (figur 10B). ChIP PCR bekræftede bindingen af ​​Smad3 til E2F3-promotoren som anti-Smad3-antistoffet, men ingen ikke-specifik IgG-isotype udfældede med succes kromatinfragmentet svarende til E2F3-promotoren (figur 10C). Kvantitativ RT-PCR afslørede en 6-dobbelt berigelse af E2F3-promotorsekvensen i ChIP-assayet med Smad3-antistoffet sammenlignet med IgG-isotypen (figur 10D), hvilket viser, at Smad3 kan binde til promotorregionen af ​​E2F3-genomisk locus .

For at validere den funktionelle betydning af Smad3-binding på E2F3-promotoren konstruerede vi en luciferase-reportervektor drevet af en muse-E2F3-promotor, der huser Smad3-bindingsstedet eller dets mutantform (figur 10E). Dual-luciferase-assay i HEK293T-celler afslørede en robust transkription af luciferase drevet af den klonede E2F3-promotor, som blev signifikant hæmmet ved at overudtrykke Smad3. Imidlertid ophævede mutation af Smad3-bindingsstedet den inhiberende virkning af Smad3 (figur 10F). Disse resultater gav direkte bevis for Smad3's undertrykkende rolle i E2F3-transkription ved at binde til dets promotor.

I denne undersøgelse viste vi, at transplantation af Smad-3-mangelfulde øer gav en bedre terapeutisk effekt på diabetes og diabetisk nyreskade i STZ-inducerede diabetiske mus og db/db-mus. Ved STZ-induceret diabetes resulterede transplantation af 100 Smad3KO, men ikke 100 Smad3WT-øer i en 17-dobling i cellemasse, hvilket var forbundet med en signifikant stigning i blodinsulinniveauer og dermed forbedret glukoseintolerance og genvundet euglykæmi, hvilket resulterede i i beskyttelse mod diabetisk nyreskade.

Lignende resultater blev også fundet i T2DM i db/db-mus, hvor transplantation med 250 Smad3KO-øer, men ikke den samme dosis af Smad3WT-øer, også øgede en 5-fold cellemasse og gav en bedre glykæmisk kontrol. Disse resultater tyder på, at Smad3-mangel er resistent over for diabetiske mikromiljøer og i høj grad fremmer udvidelsen af ​​podede ø-celler og insulinproduktion for at udvise bedre glykæmisk kontrol. Interessant nok fandt vi også ud af, at behandling med 100 Smad3KO-øer kunne producere en tilsvarende glykæmisk kontrol som brugen af ​​200 Smad3WT- eller KO-øer ved STZ-induceret diabetes. Denne observation tyder på, at Smad3-mangel i vid udstrækning kan reducere (mindst 50 procent) antallet af øer, der kræves for en vellykket etablering af insulinuafhængighed i ø-celle-erstatningsterapi for T1DM. Disse resultater er i tråd med den tidligere rapport om, at forbehandling af øerne med SB-431542, en hæmmer af TGFBR1, fremmer cellernes spredning og funktion efter transplantation [15]. Men da Smad2 også spiller en væsentlig rolle i den glukose-stimulerede frigivelse af insulin i celler [16], kan målretning mod Smad3, men ikke opstrøms TGFBR1 i øer (celler), være mere gunstig til celleerstatningsbehandling af diabetes. Smad3-manglende ø-transplantation kan således repræsentere en ny behandling for både T1DM og T2DM klinisk. Derudover kunne behandling med Smad3KO-øer også beskytte mod diabetisk nyreskade ved 16 ugers T1DM, selvom dette ikke er dybtgående ved T2DM på grund af den minimale diabetiske nyreskade, der forekommer hos db/db-mus i en alder af uge 12.

Mekanistisk fandt vi, at Smad3 fungerer ved at undertrykke E2F3 for at hæmme celleproliferation. Dette understøttes af beviserne for, at E2F3-promotoren indeholder et funktionelt Smad3-bindingssted som bekræftet af ChIP- og luciferasereporter-assay. Ø-celler, der manglede Smad3, viste øget proliferation i en E2F3-afhængig mekanisme, da knockdown af E2F3 afskaffede denne pro-proliferative aktivitet. E2F3 tilhører E2F-familien og er en kritisk komponent i Rb-E2F-maskineriet, der styrer G1/S-cellecyklusindtastning [13]. E2F'er er de transkriptionelle faktorer og endelige eksekvere til at regulere gener, der orkestrerer cellecyklusfremskridt [14]. Overekspression af E2F3 har vist sig at fremme celleproliferation i øer fra gnavere og mennesker [17]. Resultaterne af, at Smad3 transkriptionelt målretter mod E2F3 for at undertrykke cellecyklussen i celler, giver en ny reguleringsmekanisme for celleproliferation. Afbrydelse af Smad3 i ø-celler fremmer således E2F3--afhængig celleproliferation som vist ved en markant stigning i insulinproducerende PCNA plus- eller BrdU plus-celler, hvilket tyder på, at behandling med en subterapeutisk dosis af Smad3KO-øer er tilstrækkelig til at udvide cellen masse og hæmmer både T1DM i STZ-inducerede mus og T2DM i db/db mus.

Herba CistancheogCistanche ekstrakt

Det er rapporteret, at TGF-signalering spiller en kritisk rolle i pancreas-ø-celleudvikling og funktion, standser cellecyklussen og forårsager celleapoptose ved at inducere CDKI'er [7, 8, 18]. Til vores overraskelse afslørede både in vivo og in vitro eksperimenter, at transkriptionen af ​​CDKI'er ikke blev ændret eller endda opreguleret i Smad3KO øer (figur S4). Denne uoverensstemmelse kan tilskrives de forskellige eksperimentelle forhold. Resultaterne i den aktuelle undersøgelse blev afledt af Smad3KO-mus (øer). De tidligere studier er dog baseret på den farmakologiske hæmning af TGFBR1, som skal påvirke hele TGF-signaleringen [7, 8]. Desuden brugte vi øprøver fra unge voksne mus (alder på 8-10 uger), mens øer fra relativt gamle dyr eller dødelige donorer fra ældre mennesker blev brugt i tidligere undersøgelser [7, 8]. Da ø-celler viser aldersassocieret ophobning af CDKI'er [19], kan CDKI'er i gamle celler være mere følsomme over for TGF-signaleringshæmning.

Der var flere begrænsninger i denne undersøgelse. Først undersøges effektiviteten af ​​ø-transplantation i den STZ-inducerede diabetiske musemodel uden autoimmun reaktion. Derfor bør fordelen ved Smad3KO frem for Smad3WT ø-terapi til diabetes også verificeres i en autentisk T1DM-model i fremtiden. For det andet er resultaterne fra denne undersøgelse baseret på hel-øen, men ikke cellespecifik Smad3KO-celleterapi. Det er uklart, om andre celletyper end celler i øen ville udføre en Smad3-afhængig rolle for at modulere celleproliferation ved intercellulære krydstale-veje. Yderligere undersøgelser med cellespecifik Smad3KO er derfor berettiget. Ydermere skal resultater fra denne undersøgelse verificeres i prøver af humane øer for at bevise deres kliniske betydning.

Referencer

1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Klinisk pancreas-ø-transplantation. Nat Rev Endocrinol. 2017; 13: 268-77.

2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Menneskelig pluripotent stamcelledifferentiering til funktionelle pancreasceller til diabetesbehandlinger: Innovationer, udfordringer og fremtidige retninger. J Biol Eng. 2017; 11:21.

3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S, et al. Histologisk graftvurdering efter klinisk ø-transplantation. Transplantation. 2009; 88: 1286-93.

4. Lan HY. Forskellige roller af TGF-beta/Smads i nyrefibrose og inflammation. Int J Biol Sci. 2011; 7: 1056-67.

5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. TGF-beta/Smad-signalering ved nyrefibrose. Front Physiol. 2015; 6:82.

6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K, et al. Et smad-signalnetværk regulerer ø-celleproliferation. Diabetes. 2014; 63: 224-36.

7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. Inhibering af TGF-beta-signalering fremmer human pancreatisk beta-celle-replikation. Diabetes. 2016; 65: 1208-18.

8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanic V, et al. Kombineret hæmning af DYRK1A-, SMAD- og Trithorax-baner synergerer for at inducere robust replikation i voksne menneskelige betaceller. Celle Metab. 2019; 29: 638-52 e5.

9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH, et al. Smad3-mangel fremmer beta-celleproliferation og funktion i db/db-mus via gendannelse af Pax6-ekspression. Teranostik. 2021; 11: 2845-59.

10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. En metode til murin ø-isolering og subkapsulær nyretransplantation. J Vis Exp. 2011.

11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH, et al. Islet-transplantation forbedrer insulinfølsomheden i en murin model af type 2-diabetes. Endokrine. 2021; 72: 660-71.

12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. Induktion af p16ink4a og p19ARF af TGFbeta1 bidrager til vækststop og senescensrespons i muse-keratinocytter. Mol Carcinog. 2009; 48: 181-6.

13. Dyer MA, Cepko CL. Regulering af spredning under retinal udvikling. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 333-42.

14. Dyson N. Reguleringen af ​​E2F af pRB-familieproteiner. Genes Dev. 1998; 12: 2245-62.

15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J, et al. Forbigående undertrykkelse af TGFbeta-receptorsignalering letter transplantation af menneskelige øer. Endokrinologi. 2016; 157: 1348-56.

16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. SMAD2-afbrydelse i muse pancreas beta-celler fører til ø-hyperplasi og forringet insulinsekretion på grund af svækkelsen af ​​ATP-følsom K plus-kanalaktivitet. Diabetologia. 2014; 57: 157-66.

17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salmon P, et al. Overekspression af E2F3 fremmer spredningen af ​​funktionelle humane beta-celler uden induktion af apoptose. Cellecyklus. 2013; 12: 2691-702.

18. Zhang Y, Alexander PB, Wang XF. TGF-beta familiesignalering i kontrol af celleproliferation og overlevelse. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017; 9.

19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. Diabetes mellitus--fremskridt og udfordringer i human beta-celleproliferation. Nat Rev Endocrinol. 2015; 11: 201-12.

20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H, et al. Målrettet afbrydelse af SMAD3 resulterer i nedsat slimhindeimmunitet og formindsket T-cellerespons på TGF-beta. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.

21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. En protokol for ø-isolering fra musebukspytkirtlen. Nat Protoc. 2009; 4: 1649-52.

22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Transplantation af bugspytkirteløer i nyrekapslen hos diabetiske mus. J Vis Exp. 2007: 404.

23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q, et al. Sletning af Smad3 forhindrer nyrefibrose og betændelse ved type 2 diabetisk nefropati. Metabolisme. 2020; 103: 154013.

Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 og Hui-Yao Lan2,7

1 Forskningscenter for integreret medicin og afdeling for nefrologi, tilknyttet hospital for traditionel kinesisk medicin ved Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Kina.

2. Institut for Medicin og Terapeutik og Li Ka Shing Institute of Health Sciences, det kinesiske universitet i Hong Kong, Hong Kong, 999077, Kina.

3. Guangdong-Hong Kong Fælles Laboratorium for Immunologiske og Genetiske Nyresygdomme, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou, Guangdong, 510080, Kina.

4. State Key Laboratory of Bioelectronics, Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials and Devices, School of Biological Sciences & Medical Engineering, Southeast University, Nanjing, Kina.

5. Nøglelaboratorium for forebyggelse og behandling af kronisk nyresygdom i Zhanjiang City, Institute of Nephrology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang, Guangdong, 524001, Kina.

6. National Traditional Chinese Medicine Clinical Research Base, tilknyttet Traditional Chinese Medicine Hospital ved Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Kina.

7. CUHK-Guangdong Provincial People's Hospital Fælles Forskningslaboratorium for immunologiske og genetiske nyresygdomme, det kinesiske universitet i Hong Kong, Hong Kong, 999077, Kina.