Del Ⅱ Smad3-mangel forbedrer ø-baseret terapi for diabetes og diabetisk nyreskade ved at fremme celleproliferation via den E2F3-afhængige mekanisme

Metoder

1. Dyr

Smad3-null (Smad3KO) musene er en venlig gave fra Prof. Chuxia Deng og vedligeholdt i heterozygoter (Smad3 plus /- ) i C57BL/6 baggrund [20]. Smad3KO-mus blev genereret ved krydsning af Smad3 plus/- mus. db/db-musene med mutation af Lepr (leptinreceptor) i C57BLKS-baggrund blev købt fra Animal Experimental Center ved det kinesiske universitet i Hong Kong (CUHK). Alle dyr blev holdt i en specifik patogenfri (SPF) facilitet med fri adgang til mad og vand i en dag/nat-cyklus på 12/12 timer. Alle dyremanipulationer i denne undersøgelse blev udført efter reglerne fra og godkendt af CUHK's Ethics Committee of Animal Experimenter med Ref. Nej. 18-177-MIS.

2. Streptozocin (STZ)-induceret diabetisk musemodel

C57BL/6-hanmus i en alder af 8-10 uger blev intraperitonealt injiceret med 50 mg/kg/dag STZ dagligt i 5 sammenhængende dage. 5 dage efter den endelige STZ-injektion blev mus med en stabil tilfældig blodglucose på mere end 16 mM i 2 på hinanden følgende dage betragtet som den vellykkede etablering af diabetes og brugt som modtagermus til ø-transplantation.

3. Ø-isolering, transplantation og vurdering af diabetisk fænotype

Øer blev isoleret fra han- eller hun-Smad3 knockout (KO) eller vildtype (WT) mus i en alder af 8-10 uger som tidligere beskrevet [21]. For at udføre ø-transplantationen blev angivet, at adskillige øer blev transplanteret under nyrekapslen af ​​han-db/db-mus i en alder af uge 4 eller STZ-inducerede diabetiske mus på dag 7 efter den sidste STZ-injektion efter protokollen beskrevet af Szot et al. 22]. Kort fortalt blev modtagermusen bedøvet med anæstesi Combo (1,5 procent ketamin og 0,15 procent xylazin, 6 μL/g kropsvægt). Efter bevidsthedstabet blev der lavet et snit på 1 cm på huden, der dækkede venstre nyre. Træk forsigtigt nyren ud og hold den fugtig med sterilt saltvand under operationen. Med en 25G nål laver du en lille ridse på kapslen for at skabe et hak. Det angivne antal øer blev leveret til nyrekapslen med en PE50-slange. Trods alt blev øerne transplanteret, forsegle nicket ved kauterisering med lav varme. Udskift nyren og luk bughinden med suturer. Forsegl huden med hæfteklammer. 100 μL Penicillin-streptomycinopløsning (Gibco, kat nr. 15140122, USA) blev injiceret intraperitonealt for at forhindre infektion. 100 μL Tegmic blev injiceret intramuskulært for at lindre smerten. Dyret blev anbragt i et varmt miljø indtil fuld restitution. Den samme operationsprocedure blev også udført i falske kontrolmus, men uden ø-infusion. Både tilfældige og 6 timers fastende blodsukkerniveauer (RBG og FBG) i halespidsblodet blev kontrolleret ugentligt med en bærbar glukosemåler (Roche, ACCU-CHEK® Performa). Insulinresistenstesten (IPITT), glucosetolerancetesten (IPGTT), niveauer af HbA1c og seruminsulin blev målt som tidligere beskrevet [9].

Klik her for at fåCistanche-fordele

4. Total urinprotein og serumkreatinin

24 timers urin blev opsamlet i et metabolisk bur. 24 timers total urinprotein blev beregnet ved at multiplicere urinvolumenet og urinproteinkoncentrationen, som blev kvantificeret ved hjælp af Quick Start Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, kat # 5000201, USA). Serumkreatinin blev bestemt med kreatininkvantificeringskittet (Stanbio Laboratory, kat nr. 0430-120, USA).

5. Histopatologi

Renale histopatologiske ændringer blev undersøgt i paraformaldehyd-fikserede, paraffin-indlejrede sektioner (4 µm) med Periodic Acid-Schiff's (PAS) reagens som tidligere beskrevet [23]. Mesangial matrixudvidelse blev scoret ved hjælp af det kvantitative billedprogram (Image-Pro Plus 7.0, Media Cybernetics) som tidligere beskrevet [23].

6. Immunhistokemi

Ø-bærende nyre eller bugspytkirtel blev fikseret i 4 procent paraformaldehyd, indlejret i paraffin og sektioneret ved 4 μm. Efter rehydrering blev sektionerne behandlet med mikrobølgemedieret antigenudvinding i 0.01 M citrat (pH 6.0) i 10 minutter og blokering i 5 procent BSA i 1 time . Primær antistofinkubation blev udført natten over ved 4 grader. Til fluorescerende farvning blev et fluorescerende sekundært antistof påført ved stuetemperatur (RT) i 1 time. For DAB-medieret termogenese blev et yderligere trin med 3 procent H2O2-blokering i 15 minutter inkluderet før antigenudvindingen. Efter primær antistofinkubation blev HRP-konjugeret polymer (Envision plus System, Dako, USA) tilsat. Til farvning af E2F3 blev antigenudvinding udført i EDTA-Tris-opløsning (pH 9,0). Antistoffer anvendt i immunhistokemi blev beskrevet detaljeret i tabel S2. Det farvningspositive område blev kvantificeret med Image J-software (v1.47, NIH, USA).

Cistanche ekstrakt

7. Måling af podet cellemasse i den ø-bærende nyre

Et indeks for gennemsnitlig celleareal pr. sektion blev brugt til semikvantitativt at kvantificere cellemassen i ø-transplantatet. Kort fortalt blev den ø-bærende nyre (paraffin-indlejret) sektioneret successivt ved 4 μm langs den sagittale akse. Kontinuerlige snit med 160 μm intervaller blev fluorescerende immunfarvet for insulin. Mindst 6 sektioner med insulin-positiv farvning blev anvendt til beregning af celleareal pr. sektion i hver mus. Det insulin-positive celleområde i hver sektion blev kvantificeret med Image J-software (v1.47, NIH, USA). Indekset for det gennemsnitlige celleareal pr. sektion i hver mus blev beregnet ved at dividere det totale insulin-positive areal i alle sektioner med antallet af insulin-positive sektioner.

8. Primær kultur af ø-celler

De isolerede øer blev dissocieret i enkeltceller og podet i 96-brøndpladen i 200 μL RPMI 1640 (Gibco, USA) plus 10 procent FBS (Gibco, USA) plus 1 procent Penicillin-streptomycin (Gibco, USA) suppleret med 20 mM glucose. Ø-celler blev dyrket i den angivne tid i en inkubator sat til 37 grader, 5 procent CO2 og 100 procent fugtighed. Til adenovirus-medieret knockdown af E2F3 blev dissocierede ø-celler dyrket i et medium, der indeholdt adenovirus, der overudtrykker kort hårnåle-RNA (shRNA) rettet mod muse E2F3 (shE2F3) eller kontrol ikke-specifikt shRNA (vist) ved en titer på 10 pfu pr. celle i 2 dage efterfulgt af medium udskiftning. Stamsekvensen af ​​shE2F3-dupleksen var 5'-CATCCATGCTCTATTCTGT-3'. Dispergerede celler fra 50 øer blev podet pr. brønd til immunfarvning og RT-PCR, og 100 øer pr. brønd til Western blot, som blev udført som tidligere beskrevet [9].

9. In vivo og in vitro BrdU-mærkning

For at udføre in vivo BrdU-mærkning blev musene intraperitonealt injiceret med 50 mg/kg/dag BrdU (i PBS) i 7 dage fra den 2. dag efter ø-transplantation og aflivet 2 timer efter den sidste injektion. Til in vitro BrdU-mærkning blev de dispergerede øceller dyrket i 48 timer efterfulgt af udskiftning med frisk medium indeholdende 10 μM BrdU og dyrket i yderligere 24 timer. Fluorescerende immunfarvning mod BrdU i vævet og dyrkede celler blev udført som tidligere beskrevet [9].

Cistanche pulver

10. RNA-Sekv

Øer blev isoleret fra Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT-db/m og Smad3KO-db/m mus. For hver genotype blev øer fra mere end 5 mus samlet til RNA-isolering. RNA blev fremstillet med miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Tyskland). RNA-seq og downstream-dataanalysen blev beskrevet tidligere [9]. Ekspressionsniveauet af et givet gen blev præsenteret som fragmenter pr. kilobase af transkript pr. million kortlagte læsninger (FPKM). Differentielt udtrykt gen (DEG) blev defineret som større end eller lig med 2 ganges varians af FPKM mellem to grupper. Opregulerede og nedregulerede DEG'er blev kombineret og brugt til Gene Ontology (GO) og Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway-berigelsesanalyse med online DAVID bioinformatikressourcer (v6.8) med standardindstillinger. GOTERM_BP_DIRECT-underkategorien blev brugt til GO-analyse.

11. Immunpræcipitation

For at udføre immunpræcipitation i museøer blev ca. 500 frisk-isolerede øer lyseret i 500 ml RIPA-buffer. Et kanin-anti-Smad3-antistof (2 ug) eller kanin-IgG-isotype blev tilsat og inkuberet ved 4 grader natten over med forsigtig rotation. Derefter blev 20 μL protein A agarose perler (Beyotime, kat # P2051, Kina) tilsat og inkuberet i 2 timer ved 4 grader. Efter kraftig vask med frisk RIPA-buffer blev det bundne protein frigivet ved denaturering i 1xSDS-belastningsbuffer og underkastet Western blot-analyse. For at undgå påvirkningen af ​​tung IgG-kæde blev et let kæde-specifikt muse-anti-kanin-IgG (HRP-konjugeret, Abmart, kat# M21006, Kina) brugt til at genkende det præcipiterede Smad3-protein.

12. Chromatin immunpræcipitation-ChIP

For at udføre ChIP i museøer blev omkring 2000 øer indsamlet fra 8-10 uger gamle C57BL/6-mus og brugt som ét ChIP-præparat. De frisk isolerede øer blev stimuleret med 10 ng/ml TGF- 1 (Gibco, USA) i 15 minutter i RPMI 1640 plus 1 procent FBS plus 1 procent penicillin-streptomycin. ChIP blev udført med SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (CST, USA) efter den anbefalede instruktion. Antistoffer og primere, der anvendes i ChIP-assayet, er beskrevet detaljeret i tabel S1 og S2.

Standardiseret Cistanche

13. Dual-luciferase reporter assay

Muse E2F3-promotor (-1000 til plus 451 bp) blev klonet ind i pGL3-basisvektoren (pGL3-E2F3.Pro). Sideløbende blev punktmutation af Smad3-bindingsstedet udført for at generere pGL3- E2F3.Pro. Mut. For at udføre dual-luciferase reporter-assayet blev HEK293T-celler podet i 24-brøndpladen med en tæthed på 5 x 104 celler/brønd. Den næste dag blev celler transficeret med 500 ng pGL3-Basic eller pGL3-E2F3.pro eller pGL3-E2F3.pro.mut kombineret med pcDNA3.1-Smad3, som overudtrykker muse-Smad3 eller ej (som angivet i figur 10F) ved phosphatcalciummetoden. pEGFP-Cl vektoren blev suppleret for at balancere transfektionsdosen i hver behandling. 10 ng pGL4.73.huc/SV40 vektor, der udtrykker renilla luciferase, blev inkluderet i hver behandling for at normalisere transfektionseffektiviteten. 6 timer efter transfektion blev mediet skiftet efterfulgt af inkubation i yderligere 48 timer. Cellerne blev lyseret, og luciferaseaktivitet blev bestemt med Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, USA) og kvantificeret i et luminometer (VICTORTM X4 2030 Multilabel Reader, PerkinElmer, USA). Den transkriptionelle aktivitet af den klonede E2F3-promotor blev præsenteret som værdiforholdet mellem ildflue-luciferase og renilla-luciferase. Hver behandling blev udført i tre eksemplarer.

14. Statistik

Data blev præsenteret som middelværdi ± SD og analyseret med SPSS-software (16.0). Normaliteten af ​​dataene blev kontrolleret ved One-Sample Kolmogorov-Smirnov-testen. Homogeniteten af ​​varianser mellem grupper blev testet af Levene-statistikken. Til sammenligning mellem de to grupper blev Elevens t-test brugt. Til sammenligning mellem flere grupper blev envejs ANOVA med en LSD-test brugt, hvis en lige stor varians blev antaget. For den lige varians, der ikke blev antaget, blev en alternativ Welch-teststatistik brugt efterfulgt af flere sammenligninger med Tamhanes T2-test. P < 0.05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Cistanche kosttilskud

Konklusioner

Smad3-mangel forbedrer i høj grad ø-erstatningsterapi for både T1DM og T2DM og beskytter mod diabetisk nyreskade. Forbedret E2F3-afhængig celleproliferation kan være en nøglemekanisme i Smad3KO-øterapi i både T1DM og T2DM. Således kan Smad3KO-celleerstatningsterapi være en bedre terapeutisk strategi for diabetes klinisk.

Referencer

1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Klinisk pancreas-ø-transplantation. Nat Rev Endocrinol. 2017; 13: 268-77.

2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Menneskelig pluripotent stamcelledifferentiering til funktionelle pancreasceller til diabetesbehandlinger: Innovationer, udfordringer og fremtidige retninger. J Biol Eng. 2017; 11:21.

3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S, et al. Histologisk graftvurdering efter klinisk ø-transplantation. Transplantation. 2009; 88: 1286-93.

4. Lan HY. Forskellige roller af TGF-beta/Smads i nyrefibrose og inflammation. Int J Biol Sci. 2011; 7: 1056-67.

5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. TGF-beta/Smad-signalering ved nyrefibrose. Front Physiol. 2015; 6:82.

6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K, et al. Et smad-signalnetværk regulerer ø-celleproliferation. Diabetes. 2014; 63: 224-36.

7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. Inhibering af TGF-beta-signalering fremmer human pancreatisk beta-celle-replikation. Diabetes. 2016; 65: 1208-18.

8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanic V, et al. Kombineret hæmning af DYRK1A-, SMAD- og Trithorax-baner synergerer for at inducere robust replikation i voksne menneskelige betaceller. Celle Metab. 2019; 29: 638-52 e5.

9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH, et al. Smad3-mangel fremmer beta-celleproliferation og funktion i db/db-mus via gendannelse af Pax6-ekspression. Teranostik. 2021; 11: 2845-59.

10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. En metode til murin ø-isolering og subkapsulær nyretransplantation. J Vis Exp. 2011.

11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH, et al. Islet-transplantation forbedrer insulinfølsomheden i en murin model af type 2-diabetes. Endokrine. 2021; 72: 660-71.

12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. Induktion af p16ink4a og p19ARF af TGFbeta1 bidrager til vækststop og senescensrespons i muse-keratinocytter. Mol Carcinog. 2009; 48: 181-6.

13. Dyer MA, Cepko CL. Regulering af spredning under retinal udvikling. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 333-42.

14. Dyson N. Reguleringen af ​​E2F af pRB-familieproteiner. Genes Dev. 1998; 12: 2245-62.

15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J, et al. Forbigående undertrykkelse af TGFbeta-receptorsignalering letter transplantation af menneskelige øer. Endokrinologi. 2016; 157: 1348-56.

16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. SMAD2-afbrydelse i muse pancreas beta-celler fører til ø-hyperplasi og forringet insulinsekretion på grund af svækkelsen af ​​ATP-følsom K plus-kanalaktivitet. Diabetologia. 2014; 57: 157-66.

17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salmon P, et al. Overekspression af E2F3 fremmer spredningen af ​​funktionelle humane beta-celler uden induktion af apoptose. Cellecyklus. 2013; 12: 2691-702.

18. Zhang Y, Alexander PB, Wang XF. TGF-beta familiesignalering i kontrol af celleproliferation og overlevelse. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017; 9.

19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. Diabetes mellitus--fremskridt og udfordringer i human beta-celleproliferation. Nat Rev Endocrinol. 2015; 11: 201-12.

20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H, et al. Målrettet afbrydelse af SMAD3 resulterer i nedsat slimhindeimmunitet og formindsket T-cellerespons på TGF-beta. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.

21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. En protokol for ø-isolering fra musebukspytkirtlen. Nat Protoc. 2009; 4: 1649-52.

22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Transplantation af bugspytkirteløer i nyrekapslen hos diabetiske mus. J Vis Exp. 2007: 404.

23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q, et al. Sletning af Smad3 forhindrer nyrefibrose og betændelse ved type 2 diabetisk nefropati. Metabolisme. 2020; 103: 154013.

Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 og Hui-Yao Lan2,7

1 Forskningscenter for integreret medicin og afdeling for nefrologi, tilknyttet hospital for traditionel kinesisk medicin ved Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Kina.

2. Institut for Medicin og Terapeutik og Li Ka Shing Institute of Health Sciences, det kinesiske universitet i Hong Kong, Hong Kong, 999077, Kina.

3. Guangdong-Hong Kong Fælles Laboratorium for Immunologiske og Genetiske Nyresygdomme, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou, Guangdong, 510080, Kina.

4. State Key Laboratory of Bioelectronics, Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials and Devices, School of Biological Sciences & Medical Engineering, Southeast University, Nanjing, Kina.

5. Nøglelaboratorium for forebyggelse og behandling af kronisk nyresygdom i Zhanjiang City, Institute of Nephrology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Zhanjiang, Guangdong, 524001, Kina.

6. National Traditional Chinese Medicine Clinical Research Base, tilknyttet Traditional Chinese Medicine Hospital ved Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Kina.

7. CUHK-Guangdong Provincial People's Hospital Fælles Forskningslaboratorium for immunologiske og genetiske nyresygdomme, det kinesiske universitet i Hong Kong, Hong Kong, 999077, Kina.