Del Ⅰ Udvikling af en Europium Nanopartikler Lateral Flow Immunoassay til NGAL påvisning i urin og diagnose af akut nyreskade

Abstrakt

1. Baggrund

AKI er relateret til alvorlige uønskede resultater og dødelighed hos patienter med Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), så tidlig diagnose og intervention er bydende nødvendigt. Neutrofil gelatinase-associeret lipocalin (NGAL) er en af ​​de mest lovende biomarkører til påvisning af akut nyreskade (AKI), men de nuværende påvisningsmetoder er utilstrækkelige, så hurtigere, bekvemme og præcise metoder er nødvendige for at påvise NGAL til tidlig diagnose af AKI. Heri etablerede vi en hurtig, pålidelig og nøjagtig lateral flow immunoassay (LFIA) baseret på europium nanopartikler (EU-NPS) til påvisning af NGAL i humane urinprøver.

2. Metoder

Et dobbelt-antistof sandwich immunofluorescerende assay under anvendelse af europium-doterede nanopartikler blev anvendt, og NGAL monoklonale antistoffer (MAbs) konjugat som mærker blev genereret ved at optimere elektriske fusionsparametre. 83 urinprøver blev brugt til at evaluere den kliniske anvendelseseffektivitet af denne metode.

3. Resultater

Det kvantitative detektionsområde for NGAL i AKI var {{0}} ng/mL, og detektionssensibiliseringen var 0,36 ng/mL. Variationskoefficienten (CV) for intra-assay og inter-assay var henholdsvis 2.57-4.98 procent og 4.11-7.83 procent. I mellemtiden var korrelationskoefficienten mellem europium-nanopartikler-baserede laterale fluorescensimmunoassays (EU-NPS-LFIA) og ARCHITECT-analysatoren signifikant (R2=0.9829, n=83, p < 0,01).

4 konklusioner

Der er således etableret en hurtigere og lettere operation kvantitativ analyse af NGAL for AKI, som er meget vigtig og meningsfuld for diagnosticering af tidlig AKI, hvilket tyder på, at assayet kan give en tidlig advarsel om udfaldet af sygdommen.

Nøgleord

neutrofil gelatinase-associeret lipocalin (NGAL), monoklonalt antistof, lateral flow immunoassay, akut nyreskade (AKI),Cistanches effekter.

Klik her for at videhvad er fordelene ved Cistanche

Introduktion

Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) har spredt sig bredt på verdensplan med alvorlige katastrofer [1]. Akut nyreskade (AKI) har en højere morbiditet og dødelighed i almindelige komplikationer til kritiske sygdomme og talte omkring 5-7 procent af hospitalsindlagte patienter i verden[2].- Adskillige undersøgelser har evalueret udviklingen af ​​AKI som mere stærkt relateret til dårligere udfald og dødelighedsrater for COVID-19, hvilket beskriver forekomsten af ​​AKI, der varierer bredt fra 0,5 til 36,6 procent hos COVID-19 patienter[3]. Tidlig påvisning og præcise behandlinger af AKI kan implementere bedre forebyggende strategier og forhindre forringelse af nyrefunktionen og nyresvigt, hvilket effektivt begrænser progressionen af ​​COVID-19 hospitalsindlagte patienter[4]. Blandt dem er neutrofil gelatinase-associeret lipocalin (NGAL) blevet anerkendt som en af ​​de lovende biomarkørkandidater til påvisning af AKI. NGAL er et 25 kDa glycoprotein forbundet med gelatinase fra neutrofil og findes normalt på et lavere niveau i humant væv såsom mave, tyktarm og nyre, men dets ekspression er dramatisk øget i serum og urin, når nyren var med iskæmisk eller nefrotoksisk skade [5].

Lateral flow immunoassays (LFIA) er blevet betragtet som ønskede screeningsassays på grund af deres enkelhed, in-situ analyse og lette arbejde[6]. LFIA med fluorescerende mikropartikler er allerede blevet brugt til påvisning af forskellige mikrobielle patogener og adskillige inflammationsmarkører[7, 8]. Adskillige nye nanopartikler er generelt blevet anvendt for at forbedre følsomheden af ​​LFIA, herunder kulstofnanopartikler, kvanteprikker, fluorescerende farvestoffer, magnetiske nanomærker og europiumnanopartikler (EU-NPS)[9]. EU-NPS som bærere kan forbedre 100-fold følsomhedskontrasten med kolloide guldnanopartikler mærket i LFIA[10]. EU-NPS har en lang fluorescenslevetid og er også tilgængelig med en gennemsnitlig partikelstørrelse på 75-100 nm område, det store Stokes-skift, som normalt er over 200 nm, er befordrende for at undgå interferens af spredt lys forårsaget af måling af excitationslys. EU-NPS har et bredt excitationsbånd, så det er fordelagtigt at øge excitationsenergien, den skarpe emissionsspids, lav baggrund og høj opløsning, som for nylig blev brugt i sandwich-type immunoassays af medicinsk diagnostik[11].

Her etablerede vi en ny metode med EU-NPS som mærker af LFIA til hurtig, følsom og tidlig måling af NGAL i urinen baseret på to monoklonale antistoffer (MAbs) 1G1 og 2F4, som er opdaget af vores laboratorium. Metoden er et dobbelt-antistof sandwich immunofluorescerende assay, der anvender EU-NPS og MAbs konjugat som mærker. mAb 1G1 blev konjugeret med EU-NPS, og mAb 2F4 blev brugt til at fange EU-NPS-1G1-antigenkomplekset i T-linjen. Vores resultater viste, at EU-NPS-LFIA kunne bruges til tidlig NGAL-detektion i urin og tillade forbedring i behandlingen af ​​AKI-patienter.

Cistanche tubulosa

Metoder

1. Ekspression og oprensning af NGAL

Den humane NGAL-gensekvens fra Genbank (NP{{0}}.2) blev syntetiseret af Beijing Institute of Genomics (BGI) og tilføjede restriktionsenzymer HindIII og XhoI i begge ender. Plasmiderne blev fordøjet med HindIII og Xhol og derefter klonet ind i pSecTag2A-vektoren. De konstruerede plasmider blev sekventeret for at bekræfte uden mutation og derefter transformeret til kinesisk hamsterovarie (CHO) celler ved hjælp af LipofectamineTM2000. Efter 8 dage blev cellesupernatanten opsamlet efter filtrering af 0,45 μm filter. Det udtrykte NGAL-6×His-protein blev oprenset med nikkelnitrilotrieddikesyre (Ni-NTA)-søjlen, og de forskellige fraktioner blev opsamlet og bedømt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Bicinchoninsyre (BCA) Protein Quantification Kit målte koncentrationen af ​​protein.

Det oprensede rekombinante protein blev underkastet 12 procent SDS-PAGE og derefter adsorberet på en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran. Efter at membranen var blokeret i tris-buffer med 1 procent Tween-20 (TBST) opløsning indeholdende 5 procent skummetmælk ved stuetemperatur (RT) i 2 timer, inkuberet med HRP-konjugeret anti-6×His tag antistof (1:5000) i mørke i 1 time ved stuetemperatur, visualiseret med Benzidin efter vask med TBST og visualiseret med Bio-Rad Western blotting-detektionssystem (DNR Bio-Imaging Systems Ltd., Israel).

2. Generering og oprensning af MAb'er

I den første immunisering blev hun BALB/c mus (alder på 6 uger, i alt 10) immuniseret med 50 µg NGAL-6×His rekombinant protein emulgeret i lige store doser af komplet Freunds adjuvans og accessional immuniseret blev opnået med protein emulgeret i Freunds ufuldstændige adjuvans. To hypodermiske injektioner på ryggen af ​​mus og efterfølgende intraperitoneale injektioner fordelt på 21 dage. Serumprøverne blev opsamlet en uge efter den tredje injektion, og titeren af ​​antiserumet blev bestemt med et indirekte enzymbundet immunosorbent-assay (ELISA)[12]. Tre dage før fusion udførte mus boosterimmunisering med 50 µg NGAL-6×His fortyndet med 0,9 procent NaCl.

De isolerede immunmus miltceller og SP2/0 myelomceller blandes i et forhold på 3:1 for at fusionere i et platinelektrode LF498-3 fusionskammer (BEX Co., Ltd, Japan) som beskrevet i litteraturen[13]. Kort fortalt blev den blandede celle vasket to gange med 10 mL elektrofusionsbuffer (0,3 M mannitol, 0,1 mM CaCl2, 0,1 mM MgCl2, pH 7.2), og resuspenderet i en koncentration på 2 × 107 celler/ml. Fusionen blev fuldført under anvendelse af en vekselstrømspænding på 50 V ved 0,8 MHz i 20 s, en jævnstrøms pulsspænding på 450 V af 2 gentagelser i 0,5 s, og post-fusion var 50 V ved 0,8 MHz for 7 sek. Til sidst blev den elektrisk behandlede cellesuspension flyttet fra fusionskammeret ind i 4,5 ml forvarmet RPMI 1640 (20 procent føtalt bovint serum) i 30 minutter ved 37 grader, derefter dyrket i 96-brøndsplader og inkuberet med 5 procent CO2 ved 37 grader. Efter 24 timer blev hypoxanthin-aminopterin-thymidin (HAT) suppleret til hver brønd. Cellekultursupernatanterne blev screenet ved ELISA efter 9 dages fusion, og det beregnede antal hybridomkloner var. BALB/c-musene, som var injiceret med paraffinolie i forvejen, blev podet med 1 x 106 NGAL-hybridomaceller, ascites blev oprenset med Protein A-søjle.

3. Identifikation af MAbs

Immunoglobulinunderklasserne af antistoffer blev analyseret ved anvendelse af antistofunderklasseidentifikationskittet. Den indirekte ELISA screenede de specifikke MAb'er ved at bruge oprenset rekombinant NGAL{{0}}×His-protein og PCT- 6×His-protein. Interaktionen mellem antigen og antistoffer blev bestemt med BIAcore T200-systemet (GE Healthcare, Stockholm, Sverige) i HBS-EP-buffer (0,005 procent overfladeaktivt stof P20, 10 mM Hepes, pH 7,4, 3 mM EDTA, 150 mM NaCI). NGAL-antigenet blev adsorberet på CM5-biosensorchips og nåede 400-480 responsenheder (RU) af et aminkoblingskit. Antistofferne (2F4 og 1G1) blev fortyndet i HBS-EP-buffer, blev langsomt ført over chippen med 50 µL/min i henholdsvis 5 minutter, og efterfølgende blev HBS-EP-buffer injiceret over chippen for at overvåge dissociationsfasen i 4 minutter . Sensorchipsene blev regenereret med glycinopløsning (pH 3,0) efter dissociationsfasen. For hver analyt passeret over chippen, kunne de specifikke responser fra antigenflowkanalen trække ikke-specifikke responser fra kontrolflowkanalen. De tilpassede mætningsbindingskurver blev plottet baseret på koncentrationer af analyt til ligevægtsbindingsreaktioner for at beregne KD.

Oprensede anti-NGAL MAb'er blev analyseret i 12% SDS-PAGE under ikke-reducerende betingelser og reducerende betingelser. Kort fortalt blev prøven blandet med 5 x ikke-reducerende buffer eller 5 x proteinpåfyldningsbuffer og påført 12 procent SDS-PAGE. Specificiteten af ​​anti-NGAL MAb'er blev bestemt ved Western Blot. NGAL-proteinerne blev fremstillet til 12 procent SDS-PAGE, derefter adsorberet på en PVDF-membran, der blev aktiveret ved iblødsætning i methanol i 15 s og derefter udsat for elektroforesebetingelserne ved 100 V i 2 timer. Efter blokering i Tris-HCl-buffer med 1 procent Tween-20-opløsning (TBST) indeholdende 5 procent skummetmælk ved stuetemperatur i 2 timer, blev membranen inkuberet med muse anti-NGAL MAbs som de primære antistoffer ved 4 grader. Den næste dag blev membranen vasket med TBST og inkuberet med anti-muse-konjugeret HRP IgG i mørke i 1,5 time ved stuetemperatur. Endelig blev membranen visualiseret ved Western blot-detektionssystem med forstærket kemiluminescens (ECL).

4. Konkurrerende enzymbundne immunosorbentanalyser (ELISA)

To MAb'er blev testet for evnen til at genkende unikke epitoper på NGAL ved cELISA. MAb blev konjugeret med HRP ved anvendelse af HRP Antibody Labeling Kit (Shanghai YSRIBIO industrial co., LTD), hvis arbejdskoncentration blev testet gennem direkte ELISA. {{0}}brønds mikrotiterplader blev coatet med 2 µg/ml NGAL-antigen natten over ved 4 grader, derefter blev umærket MAb (0,2 µg/brønd, 2 µg/brønd) kompetitivt bundet med det optimale fortyndingsforhold på HRP mærket MAb og inkuberet i 1 time ved 37 grader. Den enzymatiske reaktion optrådte med hydrogenperoxid af substratet 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) og stoppede med 2 M svovlsyre til alle brønde. Absorbansen (OD450 nm) blev bestemt med en Bio-Rad mikropladelæser (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Blokeringseffekterne af MAbs blev beregnet ved at bruge følgende ligning: 100×[1-OD_{450 nm}af (HRP-MAb plus MAb)/OD450 nm af HRP-MAb]. To MAb'er genkendte forskellige epitoper, hvis der blev observeret blokerende virkninger hos mere end 40 procent.

Cistanche ekstrakt

5. Konjugering af EU-NPS

De anti-NGAL monoklonale antistoffer 1G1 og 2F4 blev kovalent konjugeret til EU-NPS med standardproceduren fra Bangs Laboratories. Kort fortalt blev 100 µL EUNPS føjet til 900 µL 0.05 M MES (pH 7.{{ 32}}) og spredt ved ultralyd, vibreret i 15 minutter ved stuetemperatur i nærværelse af {{40}},08 M ​​N-hydroxysulfosuccinimid (NHS) og 0,05 M 1-({{19 }}Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC). Den aktiverede EUNPS blev vasket med koblingsbuffer (0,05 mM H3BO3, 0,04 mM Na2B4O7, pH 7,5) og omsat med 0,3 mg antistof i 2,5 timer ved stuetemperatur. Den europiumkonjugerede forbindelse blev inkuberet i 1000 µL blokerende buffer (10 procent BSA, 20 procent tween-20, 0,05 M Tris-HCl) i 1 time, tilsat til 1000 µL stamopløsninger (10 procent BSA, 20 procent trehalose, 20 procent tween-20, 0,05 M Tris-HCl) for at opbevare ved 4 grader .

6. Udviklingen af ​​LFIA

LFIA-strimlerne bestod af en nitrocellulosemembran, konjugatpude, prøvepude og absorberende pude. Glasfibermembranerne blev gennemblødt i den blokerende buffer (20 procent trehalose, 10 procent BSA, 20 procent tween-20, 0,05 M Tris, 3,2 mM EDTA.Na2, pH 8,6) i 1,5 time. Koncentrationen af ​​1 mg/ml MAbs (2F4 eller 1G1) blev coatet på testlinjen (TL) af nitrocellulosemembran, og gede-anti-muse-IgG 1 mg/ml blev coatet på den samme NC-membran i en afstand af 4 mm til fra en kvalitetskontrollinje (CL), blev dispenserinstrumentets sprayvolumen indstillet til 1 µL/cm. Membranen og glasfibermåtten blev tørret i 48 timer ved 45 grader, før de blev testet. De forskellige EU-NPS-1G1- og EU-NPS-2F4-konjugatpartikler blev coatet på konjugatpuden, og fluorescenssignalet blev målt med en immunfluorescensanalysator (Guangzhou Labsim Biotech Co., Ltd).

7. Urinprøvetagning og patienter

I alt 83 humane urinprøver fra AKI-patienter blev høstet fra det tilknyttede hospital ved Jilin Medical University. De etiske retningslinjer blev nøje overholdt i eksperimentet og blev leveret af det tilknyttede hospital ved Jilin Medical University (nr.2018-LW029). Alle forsøgspersoner modtog mundtligt og skriftligt informeret samtykke på kinesisk til undersøgelse af urinprøver. Alle eksperimenter blev udført i henhold til Helsinki-deklarationens etiske principper. Gennemsnitsalderen for patienter 62 år varierede fra 20 til 80 år, som ikke var inficeret med COVID-19, og AKI-stadie 1-3 blev klassificeret i henhold til AKI-kriterier for nyresygdomsforbedrende globale resultater[14]. Urinprøver blev indsamlet til NGAL-analyse op til 12 timer før AKI blev diagnosticeret og med hyppige intervaller efter operationen på forskellige tidspunkter (12, 24, 48 timer). For at minimere potentielle forstyrrende faktorer blev urinprøver analyseret hurtigt på det klinisk kemiske laboratorium, inklusive urinbiokemi (samlede proteinkoncentrationer < 1 g/dL, urinstof < 12 g/dL, glucose < 1 g/dL, Urin Kreatinin < 1 g/dL , albumin < 2,5 g/dL, pH 4.5-9.0) og udført i duplikater. Inden for 30 minutter efter prøveopsamling blev de centrifugeret ved 3000 rpm ved 4 grader i 15 minutter. Mindst 100 µL supernatant blev dispenseret i sterile beholdere og opbevaret ved -80 grad til yderligere analyser for at undgå gentagne fryse-tø-cyklusser.

Målingen af ​​NGAL-niveauer blev udført under anvendelse af et ARCHITECT urin NGAL-reagenssæt (Lisnamuck, Longford, Co. Longford, Irland) under anvendelse af et ikke-konkurrerende sandwichformat med kemiluminescerende signaldetektion. Urin-NGAL blev genkendt af et antifungalt antistof, som var kovalent bundet til paramagnetiske partikler i mikropartikelreagens, og konjugatet af et andet anti-NGAL-antistof forbundet med acridinium. Efter producentens instruktioner blev kalibreringsassayet udført i området 0- 1500 ng/mL, og koncentrationen af ​​NGAL blev målt.

8. Klinisk prøvetestning og analyse

De serielle koncentrationer af NGAL-standardantigen (10, 50, 100, 200, 400, 800, 1500, 2000 og 3000 ng/ml) blev fremstillet ved at bruge FBS til at styrke specifikke reaktioner af biokonjugat, hver koncentration udførte tre replikater. Efter at de kliniske prøver var blevet tilføjet til prøvepuderne, blev resultaterne af fluorescensintensiteten på T-linjen (HT) og C-linjen (HC) registreret af læseren. Kvantitativ påvisning blev afsluttet med HT/HC-forholdet for effektivt at eliminere forskelle mellem strimler (T og C) og matematisk prøvestandardmatrixeffekter[15]. Standardkurven blev plottet mod hver koncentration af NGAL og HT/HC-forhold.

9. Statistisk analyse

Passing-Bablok-regressionsanalysen og BlandAltman-plot blev udført ved variansanalyse (ANOVA) af MedCalc og SPSS 17.0 software. Alle data blev vist som middelværdier med standardafvigelse (middel ± SD).

Cistanche piller

Referencer

1. Zheng X, Zhao Y, Yang L: Acute Kidney Injury in COVID-19: The Chinese Experience. Seminarer i nefrologi 2020, 40(5):430–442.

2. Mandelbaum T, Scott D, Lee J, Mark R, Malhotra A, Waikar S, Howell M, Talmor D: Udfald af kritisk syge patienter med akut nyreskade ved brug af Acute Kidney Injury Network kriterierne. Critical care medicine 2011, 39(12): 2659–2664.

3. Al-Hwiesh A, Mohammed A, Elnokeety M, Al-Hwiesh A, Al-Audah N, Esam S, Abdul-Rahman I: Succesfuld behandling af tre patienter med akut nyreskade sekundært til COVID-19 ved peritonealdialyse : Caserapport og litteraturgennemgang. Peritonealdialyse international 2020, 40(5):496–498.

4. Shabaka A, Rovirosa-Bigot S, Guerrero Márquez C, Alonso Riaño M, Fernández-Juárez G: Akut nyreskade og nefrotisk syndrom sekundært til COVID-19-associeret fokal segmentel glomerulosklerose. Nefrologia 2021.

5. Gabbard W, Milbrandt E, Kellum J: NGAL: et spirende værktøj til at forudsige sværhedsgraden af ​​AKI påvises let ved et klinisk assay. Kritisk pleje 2010, 14(4): 318.

6. Zuk R, Ginsberg V, Houts T, Rabbie J, Merrick H, Ullman E, Fischer M, Sizto C, Stiso S, Litman D: Enzymimmunokromatografi – en kvantitativ immunoassay, der ikke kræver nogen instrumentering. Clinical chemistry 1985, 31(7): 1144-1150.

7. Juntunen E, Myyryläinen T, Salminen T, Soukka T, Pettersson K: Ydelse af fluorescerende europium(III) nanopartikler og kolloide guldreportere i lateral flow bioaffinitetsassay. Analytisk biokemi 2012, 428(1):31–38.

8. Swanson C, D'Andrea A: Lateral flow assay med nær-infrarød farvestof til multipleks detektion. Klinisk kemi 2013, 59(4):641–648.

9. Chen Y, Fu Q, Xie J, Wang H, Tang Y: Udvikling af et højfølsomt kvanteprikbaseret fluorescerende quenching lateral flow assay til påvisning af zearalenon. Analytisk bioanalytisk kemi 2019, 411(10): 2169–2175.

10. Zhang F, Zou M, Chen Y, Li J, Wang Y, Qi X, Xue Q: Lanthanid-mærkede immunokromatografiske strimler til hurtig påvisning af Pantoea stewartii subsp. Stewart. Biosensors bioelectronics 2014, 51:29–35.

11. Nankoberanyi S, Mbogo G, LeClair N, Conrad M, Tumwebaze P, Tukwasibwe S, Kamya M, Tappero J, Nsobya S, Rosenthal P: Validering af ligase-detektionsreaktionen fluorescerende mikrosfære-assay til påvisning af Plasmodium-falciparum-resistens, der medierer polymorphismeresistens. i Uganda. Malaria Journal 2014, 13:95.

12. Xu H, Dong Y, Guo J, Jiang X, Liu J, Xu S, Wang H: Monoklonal antistofproduktion og udvikling af en indirekte konkurrerende enzym-koblet immunosorbent-assay til screening af T-2-toksin i mælk. Toxicon 2018, 156:1–6.

Moli Yin1, Yuanwang Nie2, Hao Liu2, Lei Liu1, Lu Tang1, Yuan Dong2, Chuanmin Hu1 og Huiyan Wang1

1 Jilin Collaborative Innovation Center for Antibody Engineering, Jilin Medical University, 132013 Jilin, PR Kina.

2 Academy of Laboratory, Jilin Medical University, 132013 Jilin, PR Kina.