DelⅡ: Dereplication-guidet isolation af nye phenylpropanoid-substituerede diglycosider fra Cistanche Salsa og deres hæmmende aktivitet på NO-produktion i makrofager
Mar 04, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
En 3-methylbutenylgruppe, en aglycon-understruktur, blev foreslået af COZY-korrelationerne af H-2 med H-1a og H-1b og HMBC-korrelationerne mellem H{{ 4}} og H-5 og de olefiniske carbonatomer ved kC 120,7 (C-2) og 136,4 (C-3). To sukkerdele blev etableret ved NMR-spektraanalyse og HPLC-spektraanalyse af syrehydrolysatet med MS-fragmentmønster. Den absolutte konfiguration af dem blev bestemt til at være D-glucose og L-rhamnose ved hjælp af HPLC-analyse af syrehydrolysatet [17]. Disse sukkerdele blev defineret som en -glucose og en a-rhamnose ved koblingskonstanter for de anomere protoner. 1H-1H COZY-spektret viste sekventielle korrelationer fra H-13 til H-63 og fra H-133 til H-633 (figur 4).
En nedskiftet glucoseproton ved kH 4,70 (H-43) foreslog en acylsubstituent på glucose. Fra HMBC-spektret bekræftede korrelationen mellem H-43 og C-9333 positionen af caffeoylsubstituenten. HMBC-korrelationerne mellem H-13 og C-1 (kC 64,5) og mellem H-33 (kH 3,68) og C-133 (kC 101,2) foreslog positionerne af hver substituent . I overensstemmelse hermed blev strukturen af 6 bestemt som 3-methylbutenyl-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D- glucose-pyranosid og kaldet cistansalside B.
Cistansalside C (12), et brunt amorft pulver, blev bestemt til at have en molekylformel C26H38O13 ved (plus)-HR-ESI-QTOF-MS, som viste en top ved m/z 581,2213 [M plus Na] plus (beregnet for for C26H38O13Na, 581,2205). En karakteristisk ion ved m/z 163 antydede, at der eksisterede en caffeoylsubstituent i strukturen. Fragmentionerne ved m/z 325 og m/z 471 antydede eksistensen af en rhamnoseenhed og en glucoseenhed.
Sammenligning af NMR-spektrene på 12 med dem på 6 viste, at de var ens bortset fra aglyconstrukturen. I NMR-spektrene på 12 blev der observeret to parafiniske carbonatomer ved kC 38.0 (C-2) og 24.4 (C-3) i stedet for to olefiniske carbonatomer ved kC 12{{16 }}.7 (C-2) og 136.4 (C-3) i aglyconen på 6. De germinale methylgrupper (kH 0.88) i aglyconen på 12 blev flyttet op ad feltet i forhold til H-4 og H-5 (kH 1,71 og 1,63) i aglyconen af 6 (tabel 2). Aglyconen af 12 blev foreslået at være en 3-methylbutylgruppe, hvilket blev bekræftet af 1H og COSY NMR-spektrene. Toppe af 3-methylbutylgruppen blev observeret ved 3,81 (1H, m, H-1a), 3,48 (1H, m, H-1b), 1,71 (1H, m) , H-3), 1,44 (2H, m, H-2) og 0,88 (H-4, 5).
To sukkerdele blev bekræftet af HPLC-analysen af syrehydrolysatet og NMR-spektraanalysen såvel som MS-fragmentmønsteret. De absolutte konfigurationer af sukkerarterne blev identificeret som D-glucose og L-rhamnose ved hjælp af HPLC-analyse af syrehydrolysatet [17]. En -glucosedel og en a-rhamnosedel blev bekræftet ved koblingskonstanter for de anomere protoner. 1H-1H COZY-spektret viste sekventielle korrelationer fra H-13 til H-53, fra H-133 til H-333 og fra H{{11} } til H-433 (figur 4).
Positionen af substituenter blev bekræftet ved hjælp af HMBC-analysen. I HMBC-spektret er korrelationerne mellem H-13 og C-1 (kC 67,2), mellem H-33 (kH 3,68) og C-133 (kC 101,2) og mellem H-43 (kH 4,70) og C-9333 (kC 165,7) blev detekteret. Som følge heraf blev strukturen af 12 fastslået til at være 3-methylbutyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D-glucose-pyranosid og kaldet cistansalside C.
Cistansalside D (17), et amorft brunt pulver, blev bestemt til at have en molekylformel på C31H38O14 ved positiv mode højopløsnings-ESI-QTOF-MS, som viste en adduktion-top ved m/z 657,2147 [M plus Na] plus (beregnet for C31H38O14Na, 657,2154). Fragmentioner inklusive en [M plus H x Aglycone x Rha x Acetyl Glc] plus ion ved m/z 147, en [M plus H x Aglycone x Rha] plus ion ved m/z 351 og en [M plus H x Aglycone] plus ion ved m/z 497 blev også påvist. En karakteristisk ion ved m/z 147 antydede, at en coumaroylsubstituent var til stede i dens struktur. Fragmentionerne ved m/z 351 og m/z 497 antydede eksistensen af en rhamnoseenhed og en acetylsubstitueret glucoseenhed.
Cistansalside fracistanche urt
13C-NMR-spektret afslørede tilstedeværelsen af 31 carbonatomer. To anomere protoner ved kH 4,61 (1H, m, H-13) og 4,60 (1H, s, H{{10}}) blev observeret i 1H- og HSQC-spektrene . 1H-NMR-spektret indikerede tilstedeværelsen af en methylgruppe ved en 1,97 (3H, s, acetyl-CH3), en trans-olefin ved kH 7,55 (1H, d, J=15,9 Hz, H{{ 25}}) og 6,34 (1H, d, J=15,9 Hz, H-8333) og to para-substituerede benzenringe ved kH 7,53 (2H, d, J=6. 9 Hz, H-3333, 5333) og 6,79 (2H, d, J=6,9 Hz, H-2333, 6333)/kH 6,98 (2H, d, J {{5 0}},0 Hz, H-2, 6) og 6,65 (2H, d, J=8,0 Hz, H-3, 5) (tabel 2) . Fra HMBC NMR-spektret, korrelationerne mellem et carbonylcarbon ved kc 165,5 (C-9333) og H-8333 og mellem H-2333, 6333 og C-7333 (kc 145,4) foreslog en (E)-coumaroylgruppe. HMBC-korrelationen mellem en methylprotontop og et carbonylcarbon ved kc 169,0 bekræftede tilstedeværelsen af en acetylgruppe.
En 4-hydroxyphenylgruppe blev foreslået baseret på HMBC-korrelationerne mellem H-3, 5 og kvaternære aromatiske carbonatomer ved kC 155,6 (C-4) og 128,6 (C-1) . En hydroxyleret ethylgruppe blev bekræftet af COSY NMR-signalerne ved kH 2,66 (2H, t, J=6,1 Hz, H-7), 3,90 (1H, m, H-8a ) og 3,54 (IH, m, H-8b). HMBC-korrelationerne mellem H-7 og C-1 (kC 128,6) og C-2, 6 (kC 129,7) foreslog en 4-hydroxyphenylethylgruppe som en aglyconsubstruktur.
To sukkerdele, foreslået fra MS-fragmentmønster, blev genbekræftet ved HPLC-analyse af syrehydrolysatet og NMR-spektrene. D-glucose og L-rhamnose blev belyst ved hjælp af HPLC-analyse af syrehydrolysatet [17]. En -glucosedel og en a-rhamnosedel blev etableret ved koblingskonstanter for de anomere protoner. 1H-1H COZY-spektret viste sekventielle korrelationer fra H-13 til H-53 og fra H-133 til H-633 (figur 4).
Fra 1H-NMR-spektret foreslog skiftningen af H-23 (kH 4,69) og H-43 (kH 4,80) den acyl-substituerede position på glucose. Forbindelserne mellem glucose og to acylgrupper blev bekræftet af HMBC-korrelationerne mellem H-43 (kH 4,80) og C-9333 og mellem H-23 og carbonylcarbon i en acetylgruppe (kC 169,0 ). Positionerne for en aglycone og rhamnose blev givet af HMBC-korrelationerne mellem H-33 (kH 3,95) og C-1333 og mellem H-8 og C-13. Følgelig blev strukturen af 17 tildelt som 4-hydroxyphenylethyl-2-O-acetyl-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)- coumaroyl- -D-glucopyranosid og kaldet cistansalside D.
Cistansalside E (18) blev isoleret som et amorft brunt pulver. Dens molekylære formel blev bestemt til at være C31H38O14 ved 13C-NMR-data og den positive modus højopløsnings ESI-QTOF-MS-top ved m/z 657.2166 [M plus Na] plus (beregnet for C31H38O14Na, 657.2154). Derudover blev fragmentioner inklusive en caffeoylion ved m/z 163, en [M plus H x Aglycone x Rha] plus ion ved m/z 367 og en [M plus H x Aglycone]-ion ved m/z 513 også påvist. Fragmentionerne antydede eksistensen af en rhamnoseenhed og en acetylsubstitueret glucoseenhed.
1H-NMR-spektret antydede tilstedeværelsen af to anomere protoner ved kH 4,63 (1H, d, J=8,2 Hz, H-13) og 4,60 (1H, s, H-133 ) og to acyl-substituerede glucoseprotoner ved kH 4,71 (1H, dd, J=8.9, 8,2 Hz, H-23) og 4,81 (1H, dd, J=9.7 , 9,5 Hz, H-43). 1H- og HMBC-spektrene antydede eksistensen af en acetylgruppe ved kH 1,94 (3H, s, acetyl-CH3), en (E)-caffeoyldel ved kH 7,48 (1H, d, J=15},9 Hz, H-7333), 7,02 (1H, d, J=1,6 Hz, H-2333), 6,98 (1H, dd, J=8.1, 1,6 Hz, H-6333), 6,76 (1H,d, J=8,1 Hz, H-5333) og 6,21 (1H, d, J=15,9 Hz, H{ {67}}) og en mono-substitueret benzenring ved kH 7,29 (2H, m, H-3, 5), 7,21 (2H, m, H-2, 6) og 7,20 (1H, m, H-4) (tabel 2). En phenylmethylgruppe, en aglyconsubstruktur, blev foreslået af HMBC-korrelationerne mellem H-7 (2H, kH 2,80, m) og C-1 (kC 138,8) og mellem H-7 og C -2, 6 (kC 128,9) og COSY NMR-signalerne for H-7 med H-8a (1H, kH 3,99, m) og H-8b (1H, kH 3,63, m).
To sukkerdele blev bekræftet ved HPLC-analyse af syrehydrolysatet og NMR-spektraanalyse. De absolutte konfigurationer af sukkerarterne blev belyst ved hjælp af HPLC-analyse af syrehydrolysatet, som blev bekræftet til at være D-glucose og L-rhamnose [17]. En -glucosedel og en -rhamnosedel blev etableret ved koblingskonstanter for de anomere protoner. 1H-1H COZY-spektret viste sekventielle korrelationer fra H-13 til H-53, fra H-133 til H-233 og fra H{{11} } til H-333 (figur 4).
Fra HMBC-spektret er korrelationerne mellem H{{0}} og C-8 (kC 69,4), mellem H-23 og carbonylcarbon i en acetylgruppe (kC 169,1), mellem H-33 (kH 3,95) og C-133 (kC 102,0) og mellem H-43 (kH 4,81) og C-9333 (kC 165,6) bekræftede substituenternes position i Strukturen. Derfor blev strukturen af 18 bestemt til at være phenylethyl-2-O-acetyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D-glucopyranosid og kaldet cistansalside E.
De fleste af trans-cinnamoyl-substituenterne blev isomeriseret til cis-isoformen in vitro. Lys er blevet rapporteret at omdanne trans-kanelsyrederivater til cis-isoformer [18,19]. Ligevægten af trans-cis-omdannelsen af cinnamoylsubstituenterne blev observeret at opretholde ca. 70 procent af isolaterne i trans-isoformen. For olefinprotonerne i cis-formen topper ved ca. 6,90 ppm(d, J=12~13 Hz, H-7333) og 5,80 ppm (d, J=12~13 Hz, H-8333) kunne tildeles i 1H-NMR-spektrene, hvorimod toppe ved ca. 7,55 ppm (d, J=15,8 Hz, H-7333) og 6,40 ppm (d, J { {28}}.8 Hz, H-8333) blev observeret for transformation [20]. I 1H-NMR-spektret af trans-cis-blandinger blev toppe for to olefiniske protoner (H-7333 og H-8333) observeret i forholdet 7:3 (trans:cis). 13C-NMR-toppe af cis-formen svarede til dem for transformationen.
Effektive ingredienser fra cistanche: acteosider
Alle isolater blev testet for deres hæmmende virkning på LPS-induceret NO-produktion i RAW
Alle isolaterne blev testet for deres inhiberende virkninger på LPS-induceret NO-produktion i RAW 264.7-celler. Dexamethason blev brugt som en positiv kontrol, og dens IC50 var 7.0 uM. Af de testede forbindelser, forbindelser 5 (IC50 42,7 o 6,6 uM), 11 (IC50 37,3 o 2,2 uM), 13 (IC50 40.{{2{{ 24}}}} o 4.0 uM) og 18(IC50 27.9 o 0.8 uM) viste moderat hæmmende aktiviteter på inducerbar NO-syntase, mens de andre forbindelser var inaktive i denne analyse (IC50 værdier > 100 uM). For at verificere, om disse forbindelser havde cytotoksicitet, blev cellelevedygtighed målt under anvendelse af MTT-assay. Som et resultat udviste ingen af dem signifikant cytotoksicitet (Supplerende figur S6-1). Disse fire forbindelser blev udvalgt til at evaluere for deres inhiberende aktivitet mod NF-λB-vejen i LPS-stimulerede RAW 264.7-celler. Stimulering af RAW 264.7-celler med LPS inducerede phosphoryleringen af I入B og NF-入B (p65) efter 0,5 times inkubation. Fosforyleringen af NF-入B (p65) blev signifikant reduceret ved forbehandling med forbindelser 11, 13 og 18 som vist ved western blot-analyse (figur 5). Derfor kan forbindelser 11, 13 og 18 udøve anti-inflammatoriske virkninger via inhibering af NF-入B i makrofager.
Figur 5.Virkning af fire forbindelser på phosphorylering af I入B og NF-入B (p65) i LPS-stimulerede RAW 264.7-celler. (A) Western blots blev udført i LPS og prøvebehandlede RAW 264.7-celler; (B, C) Immunoblot-signalerne blev kvantificeret ved hjælp af Molecular Analyst/PC densitometri software (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Densitometriske analyse af phosphorylerede isoformer er rapporteret. NF-入 B i RAW 264.7 celle blev normaliseret til indholdet af -actin.
3. Materialer og Metoder
3.1. Generelt eksperiment Procedure
Optiske rotationer blev målt med et Jasco P-2000 digitalt polarimeter (Jasco, Tokyo, Japan). UV-spektre blev optaget på et Chirascan plus Circular Dichroism-spektrometer (Chirascan, APL, UK). IR-spektre blev optaget ved hjælp af Jasco FT/IR-4200-spektrofotometer. Højopløsnings elektrospray-ioniseringsquadrupol-time-of-flight massespektrometri (HR-ESI-qTOF-MS) blev udført på en Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS udstyret med Agilent 1260 Infinity-serien (Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, CA, USA), og den anvendte søjle var en Jasco SFCpak Crest C18T-5 søjle (id 150 4.6 mm, 5 um). MassHunter Workstation Software blev brugt til dataindsamling.
1D (1H og 13C) og 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) NMR-spektre blev opnået med en Jeol LA 300 (Jeol, Tokyo, Japan), Bruker AVANCE-400, Bruker AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 og Bruker AVANCE 800 HD-spektrometre koblet med en kryoprobe (Bruker, Ettlingen, Tyskland). DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, i Cistanche Andover, MA, USA) blev anvendt som NMR-opløsningsmiddel og referencetoppe (kH 2,50 og kC 39,5). Søjlekromatografi (CC) blev udført under anvendelse af Sephadex LH-20 (25–100 um; Pharmacia, Uppsala, Sverige) eller Kieselgel 60 silicagel (40–63 um, 230–400 mesh, art. 9385; Merck, Darmstadt , Tyskland). Tyndtlagskromatografi (TLC) blev udført på præ-coatede Kieselgel 60 silicagel F254 plader (Art. 5715; Merck). Pletter på TLC blev detekteret under anvendelse af en UV-lampe ved 254 nm og 365 nm (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, Frankrig). Mellemtryksvæskekromatografi (MPLC) blev udført på en RediSep 120 g silica-flash-søjle (Isco, Lincoln, NE, USA) og Kiesegel 60 silicagel (40-63 um, 230-400 mesh, art. 9385; Merck) under anvendelse af en Combiflash ledsager (Isco). Højtryksvæskekromatografisystemet (HPLC) var en Gilson HPLC udstyret med en Gilson 321-pumpe og UV.VIS 151-detektor (Gilson, Middleton, WI, USA), ved brug af semi-præparative ODS-søjler (Luna 5 um C18 (2) 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, Tyskland; Inno C18 kolonne 120 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Korea). Det analytiske RP-HPLC-system var et Waters 2695-alliancesystem med en 996 Photodiode Array (PDA)-detektor (Waters Corp, Milford, MA, USA), og den anvendte søjle var en Hypersil™ BDS C18-søjle (130 Å, id 150: 4,6) mm, 5 um, Thermo Scientific™). Myresyre blev købt fra Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Seoul, Korea). HPLC-kvalitet opløsningsmidler blev købt fra Fisher Scientific Korea Ltd. (Seoul, Korea). H2SO4, Na2CO3 og førsteklasses opløsningsmidler til ekstraktion, fraktionering og isolering blev købt fra Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Seoul, Korea). L- og D-cystein-methylesterhydrochlorid og o-tolylisothiocyanat blev købt fra Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan).
3.2. Plante Materiale
Hele planter afCistanche salsa, som blev indsamlet fra Shinjang Uyghur, blev importeret gennem Daerim Pharmaceutical Wholesale Company (Cheongju, Korea). De blev identificeret af Prof. Dr. Jehyun Lee (Dongguk Universitet, Seoul, Korea). Kuponprøven (SNUPH2016-03) blev deponeret i Herbarium of Medicinal Plant Garden, College of Pharmacy, Seoul National University.
3.3. Udvinding og Isolation
De tørrede hele planter afCistanche salsa(5,7 kg) blev hakket og ekstraheret tre gange med MeOH (20 L) ved stuetemperatur med sonikering i 99 min. Efter fjernelse af opløsningsmidlet i vakuum blev den rå ekstrakt (1,35 kg) suspenderet i H2O (5 L) og derefter delt med EtOAc (5 L). EtOAc-remanensen (55,3 g) blev adskilt i 16 fraktioner (E01-16) på silicagelkromatografi under eluering med CHCl3/MeOH (50:1-0:1, trin-gradientsystem).
E08 (611,7 mg) blev underkastet silicagel mellemtryksvæskekromatografi (25 g) og elueret med CHCl3/MeOH (18:1–0:1, trin-gradientsystem) og gav 11 fraktioner (E08a-k). Fra E08g blev forbindelser 13 (0,7 mg) og 18 (0,6 mg) oprenset ved anvendelse af en Luna 5 um HPLC-søjle og isokratisk eluering med 28 procent aq. MeCN. HPLC-rensning (Hypersil GOLD, 25 procent vandig MeCN) af E08h (138,5 mg) gav forbindelser 7 (10,6 mg), 8 (17,2 mg), 14 (13,4 mg) og 17 (4,9 mg).
E09 (1,15 g) blev yderligere oprenset på en silica-MPLC-søjle (20 g) under eluering med CHCl3/MeOH (10:1-0:1, trin- gradientsystem) for at give 11 underfraktioner (E09a-k). E09e (398,7 mg) blev udsat for Sephadex LH-20 (MeOH) og gav otte underfraktioner (E09e1-8). E09e6 blev efterfølgende oprenset under anvendelse af en Hypersil GOLD HPLC-søjle (22% vandig MeCN) for at give forbindelse 11 (0,4 mg). Fra E09e7 blev forbindelse 5 (0,6 mg) oprenset ved isokratisk eluering fra en Luna 5 um HPLC-søjle med 40% aq. MeOH.
E10 (1,20 g) blev adskilt i ni fraktioner (E10ai) på Sephadex LH-20-søjle under eluering med MeOH. Fra El0g (147,5 mg), blev forbindelser 4 (13,4 mg), 9 (8,0 mg) og 15 (5,0 mg) isoleret ved HPLC-separation (Inno, 23 procent vandig MeCN). Fraktion E10h (470,0 mg) blev oprenset på en Hypersil GOLD-søjle ved isokratisk eluering (40% vandig MeOH) for at give forbindelser 1 (3,8 mg), 10 (42,1 mg) og 16 (3,0 mg).
E11 (2,96 g) blev udsat for Sephadex LH-20 under eluering med MeOH for at give ni fraktioner (Ella-i). E11e blev adskilt af Sep-Pak C18 patron, der eluerede trinvist med 10 procent, 20 procent, 30 procent, 50 procent og 100 procent aq. MeOH for at give syv fraktioner (E11e1-7), efterfulgt af Luna 5 um HPLC (28 procent vandig MeCN) for at give forbindelser 3 (3,4 mg), 6 (1,4 mg) og 12 (1,2 mg).
E12 (19,0 g) blev underkastet silica MPLC (120 g) under anvendelse af et CHCl3/MeOH trin-gradientsystem til opnåelse af seks fraktioner (18:1–0:1 E12a-f). E12f blev kromatograferet på en Sephadex LH-20-søjle (MeOH), hvilket gav syv fraktioner (E12f1-7). HPLC-oprensning (Hypersil GOLD, 25 procent aq. MeCN) af E12f7 tilvejebragte forbindelse 2 (3,3 mg). Alle opløsningsmidler anvendt til HPLC var 0,05 procent myresyrebuffer. Den almindelige strømningshastighed for HPLC- og MPLC-kromatografi var henholdsvis 3 og 40 ml/min.
3.4.Karakterisering
Cistansalside A (5): brunt amorft pulver; [ |20 x33,7 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 332 (3,18); IR (ren) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) og 13C-NMR (200 MHz) data, se tabel 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 645,2146 (beregnet for C30H38O14Na, 645,2154).
Cistansalside B (6): brunt amorft pulver; [ |20 x72,9 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 333 (3,32); IR (ren) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; 1H-NMR (500 MHz) og 13C-NMR (125 MHz) data, se tabel 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 579,2054 (beregnet for C26H36O13Na, 579,2048).
Cistansalside C (12): brunt amorft pulver; [ |20 x61,6 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 337 (3,25); IR (ren) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) og 13C-NMR (200 MHz) data, se tabel 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 581,2213 (beregnet for C26H38O13Na, 581,2205).
Cistansalside D (17): brunt amorft pulver; [ |20 x51,1 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 221 (3,53), 315 (3,52); IR (ren) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; 1H-NMR (400 MHz) og 13C-NMR (75 MHz) data, se tabel 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 657,2147 (beregnet for C31H38O14Na, 657,2154).
Cistansalside E (18): brunt amorft pulver; [ |20 x59,2 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 336 (3,22); IR (ren) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; 1H-NMR (800 MHz) og 13C-NMR (200 MHz) data, se tabel 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 657,2166 (beregnet for C31H38O14Na, 657,2154)
3.5.HPLC-QTOF-MS Analyse
Kromatografisk massespektrometrianalyse blev udført på et Agilent 1260 Infinity series LC-system (Agilent Technologies, Inc., USA). Den analytiske kolonne var en SFCpak Crest C18T-5 kolonne (id 15{{10}}: 4,6 mm, 5 um, Jasco, Japan). Den mobile fase bestod af 0,1 procent (v/v) myresyre i MeCN (A) og vand (B) ved anvendelse af en gradienteluering på 0-35 min (23 procent A), 35-45 min ( 23-28 procent A), 45-75 min (28 procent A) og 75-80 min (90 procent A). Flowhastigheden blev holdt på 0,3 ml/min. Absorbansen blev målt ved 320 nm. Betingelserne for ESI-kilden var som følger: tørregas (N2) flowhastighed, 10 l/min; tørregastemperatur, 350 grader; forstøver, 30 psig; kappegasstrømningshastighed, 12,0 l/min; kappegastemperatur, 350 grader; kapillær, 4000 V; skimmer, 60 V; oktapol RF, 750 V; fragmentorspænding, 180 V; positiv tilstand. Systemet blev betjent under Masshunter workstation software. Masseområdet blev sat til m/z 50-1000.
3.6. Syre Hydrolyse
Forbindelser blev hydrolyseret under anvendelse af 1 N H2SO4 (100 uL) opvarmet med et vandbad ved 90 grader i 2 timer, derefter neutraliseret med mættet vandig Na2CO3-opløsning. Efter at opløsningerne var tørret under en strøm af N2, blev produkterne og standardsukkere (D-Glc, L-Glc, L-Rha) opløst i pyridin (100 µl) indeholdende L-cystein-methylesterhydrochlorid (0,5 mg). En L-rhamnoseprøve blev opløst i pyridin (100 uL) indeholdende D-cystein-methylesterhydrochlorid (0,5 mg). Derefter blev de opvarmet ved 60 grader i 1 time. Opløsningerne blev behandlet med 1 uL (1,11 mg) o-tolylisothiocyanat, som blev opvarmet igen ved 60 grader i 1 time. Hver endelig blanding blev analyseret direkte ved analytisk RP-HPLC (Hypersil™ BDS C18-søjle, 17 procent vandig MeCN, 0,8 ml/min, 40 minutter, 35 grader). tR for toppen ved 21,9 og 40,4 min. faldt sammen med den for thiocarbamoyl-thiazolidinderivatet af henholdsvis D-glucose og L-rhamnose.
3.7. Celle Kultur
Murine makrofager, RAW 264.7, blev opnået fra det koreanske forskningsinstitut for biovidenskab og bioteknologi (Daejeon, Korea) og dyrket i RPMI-medium indeholdende 10 procent føtalt bovint serum og 100 U/mL penicillin/streptomycinsulfat. Celler blev inkuberet i en fugtet 5 procent CO2 atmosfære ved 37 grader.
3.8.Lægemidler og kemikalier
RPMI, penicillin og streptomycin blev købt fra HyClone (Logan, UT, USA). Bovint serumalbumin og LPS blev købt fra Sigma (St. Louis, MO, USA).
3.9.Måling af NO-produktion
Nitritkoncentrationen i dyrkningsmediet blev målt som en indikator for NO-produktion ifølge Griess-reaktionen. Cellerne blev podet ved 2:105 celler/brønd i 96-brøndskulturplader. Efter præ-inkubation af RAW 264.7-cellerne i 18 timer blev cellerne forbehandlet med forbindelser (50 uM, 10 uM, 5 uM eller 1 uM) og stimuleret med LPS (500 ng/ml) i 24 h. Testforbindelser opløst i DMSO. Celler blev også behandlet med 0,05% DMSO som bærerkontrol. RAW 264,7-celler (2: 105 celler/brønd) blev dyrket i 96-brøndsplader under anvendelse af RPMI uden phenolrødt og forbehandlet med prøver i 0,5 time. Cellulær NO-produktion blev induceret ved tilsætning af 500 ng/ml slutkoncentration LPS og en 24 timers inkubation. Efter inkubation blev 100 µl konditioneret medium blandet med det samme volumen af Griess-reagens og inkuberet i 15 min. Absorbansen af blandingen ved 540 nm blev målt med en ELISA mikropladelæser (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA). De opnåede værdier blev sammenlignet med værdierne for standardkoncentrationer af natriumnitrit opløst i RPMI, og koncentrationerne af nitrit i de konditionerede medier af prøvebehandlede celler blev beregnet.
3.10.3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay for cellelevedygtighed
Celler blev podet i {{0}}brøndsplader ved en densitet på 5:104 celler/brønd og inkuberet med serumfrit medium i nærværelse af prøver. Testforbindelser opløst i DMSO. Celler blev også behandlet med 0,05% DMSO som bærerkontrol. Efter inkubation i 24 timer blev 10 uL MTT (5 mg/ml i saltvand) tilsat, og inkubation blev fortsat i yderligere 4 timer. Mitokondriel succinatdehydrogenase i levende celler omdanner MTT til synlige formazankrystaller under inkubation. Formazan-krystallerne blev derefter solubiliseret i dimethylsulfoxid, og absorbansen blev målt ved 540 nm under anvendelse af en enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) mikropladelæser (Benchmark, Bio-Rad Laboratories). Relativ cellelevedygtighed blev beregnet sammenlignet med absorbansen af den ubehandlede kontrolgruppe. Alle eksperimenter blev udført i tre eksemplarer.
3.11.Immunblotanalyse
Proteinekspression blev vurderet ved western blotting ifølge standardprocedurer. Kort fortalt blev RAW264.7-celler dyrket i 6{{20}} mm dyrkningsskåle (2:106/mL), efterfulgt af forbehandling af 50 uM forbindelser . Celler blev vasket to gange i iskold PBS (pH 7,4), cellepelleterne blev resuspenderet i lyseringsbuffer på is i 15 minutter, og celleaffaldet blev derefter fjernet ved centrifugering. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved hjælp af Bio-Rad proteinassay-reagens i henhold til producentens instruktioner. Protein (20-30 ug) blev blandet 1:1 med 2: prøvebuffer (20 procent glycerol, 4 procent SDS, 10 procent 2- ME, 0,05 procent bromphenolblåt og 1,25 M Tris [pH 6,8]), anbragt på 8 eller 15 procent SDS-PAGE geler og kørt ved 150 V i 90 min. Cellulære proteiner blev overført til Immunoblot polyvinylidendifluoridmembraner (Bio-Rad) under anvendelse af et Bio-Rad halvtørt overførselssystem i henhold til producentens instruktioner. Membranerne blev derefter inkuberet natten over med de respektive p-NF-入B, NF-入B, pI入B og -actin primære antistoffer (Abcam, Cambridge, UK) i Tris-bufret saltvand indeholdende 5 procent skummetmælk og 0,1 procent Tween 20. Den følgende dag blev blottene vasket tre gange med Tris-bufret saltvand (0,1 procent Tween 20) og inkuberet i 1 time med et HRP-konjugeret sekundært anti-IgG-antistof (fortyndet 1:2000-1 :20.000). Blottene blev vasket igen tre gange med Tris-bufret saltvand (0,1 procent Tween 20), og immunoreaktive bånd blev udviklet ved anvendelse af det kemiluminescerende substrat ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA).
3.12.Statistisk analyse
Eksperimentelle data præsenteres som middelværdien af SEM. Niveauet af statistisk signifikans blev bestemt ved variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Dunnetts t-test for multiple sammenligninger.p Værdier mindre end 0.05 blev betragtet som signifikante.
Cistanche salsa ekstrakt
4. Konklusioner
I denne undersøgelse isolerede og belyste vi strukturerne af fem nye phenylpropanoid-substituerede glycosider, benævnt cistansalside AE (5, 6, 12, 17 og 18), ud over at isolere og identificere 13 kendte forbindelser ved hjælp af en dereplikationsstrategi. De kendte forbindelser blev bestemt til at være lipedosid AI (1) [21], 23-acetylacteosid (2) [22], isocistanosid C (3) [15], osmanthusid B (4) [21], epimeridinosid A ( 7) [15], cistanosid D (8) [23], salsaside B (9) [6], tubulosid E (10) [16], cistanosid M (11) [15], isomartynosid (13) [24], salsaside C (14) [6], jionosid C (15) [25] og salsaside F (16) [6]. Deres strukturer blev etableret gennem analyse af omfattende spektroskopiske data og ved sammenligning med rapporterede data i litteraturen. Det blev bekræftet, at foreløbigt forudsagte strukturer af phenylpropanoid-substituerede glycosider var korrekt matchet til deres virkelige strukturer.
Fordel ved Cistanche salsaekstrakt
Referencer
1. Shimamura, H.; Miyazawa, M.; Enomoto, K.; Nakamura, S.-I.; Kameoka, H. Undertrykkelse af SOS-inducerende aktivitet af Trp-P-1 af fedtsyrer fra Cistanche salsa i Salmonella Typhimurium TA1535/pSK1002 umu-testen. Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 261-265. [CrossRef]
2. Jeon, E.; Chung, K.-S.; An, H.-J. Anti-spredningsvirkninger af Cistanches salsa på udviklingen af benign prostatahyperplasi. Kan. J. Physiol. Pharmacol. 2016, 94, 104-111. [CrossRef] [PubMed]
3.Xu, C.; Jia, X.; Xu, R.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Sun, S. Hurtig diskrimination af Herba Cistanches ved multi-trins infrarød makrofingeraftryk kombineret med blød uafhængig modellering af klasseanalogi (SIMCA). Spectrochim. Acta Part A Mol. Biomol. SpectrosCistanche2013, 114, 421-431. [CrossRef] [PubMed]
4. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Differentiering af Herba Cistanches ved fingeraftryk med højtydende væskekromatografi-diode array detektion-massespektrometri. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156-2162. [CrossRef] [PubMed]
5. Kobayashi, H.; Karasawa, H.; Miyase, T.; Fukushima, S. Studier af Cistanchis Herbas bestanddele. V. Isolering og strukturer af to nye phenylpropanoidglycosider, cistanosider E og F. Chem. Pharm. Tyr. 1985, 33, 1452-1457. [CrossRef]
6. Lei, L.; Jiang, Y.; Liu, X.-M.; Tu, P.-F.; Wu, L.-J.; Chen, F.-K. Nye glykosider fra Cistanche salsa. Helv. Chim. Acta 2007, 90, 79-85. [CrossRef]
7. Kartbaeva, EB; Sakipova, ZB; Ibragimova, LN; Kapsalyamova, EN; Ternynko, II Sammensætningsundersøgelse af phenoliske forbindelser af Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck, der vokser i Republikken Kasakhstan. J. Chem. Pharm. Res. 2015, 7, 120-122.
8. Liu, J.-Y.; Guo, Z.-G.; Zeng, Z.-L. Forbedret akkumulering af phenylethanoidglycosider ved forløbertilførsel til suspensionskultur af Cistanche salsa. Biochem. Eng. J. 2007, 33, 88-93. [CrossRef]
9. Maruyama, S.; Akasaka, T.; Yamada, K.; Tachibana, H. Cistanche salsaekstrakt virker på samme måde som proteinbundet
polysaccharid-K (PSK) på forskellige typer cellelinjer. J. Tradit. Med. 2008, 25, 166-169.
10. Tian, X.-F.; Pu, X.-P. Phenylethanoidglycosider fra Cistanches salsa hæmmer apoptose induceret af 1-methyl-4-phenylpyridiniumion i neuroner. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 59-63. [CrossRef] [PubMed]
11. Michel, T.; Halabalaki, M.; Skaltsounis, AL Nye koncepter, eksperimentelle tilgange og dereplication strategier for opdagelsen af nye fytoøstrogener fra naturlige kilder. Planta Med. 2013, 79, 514-532. [CrossRef] [PubMed]
12. De Medeiros, LS; Abreu, LM; Nielsen, A.; Ingmar, H.; Larsen, TO; Nielsen, KF; Rodrigues-Filho, E. Dereplication-guidet isolation af depsides theaflavins ST og lecanora DF fra den endofytiske svamp Setophoma sp. Phytochemistry 2015, 111, 154-162. [CrossRef] [PubMed]
13. Rakotondraibe, LH; Rasolomampianina, R.; Park, H.-Y.; Li, J.; Slebodnik, C.; Brodie, PJ; Blasiak, LC; Hill, R.; TenDyke, K.; Shen, Y.; et al. Antiproliferative og antiplasmodiale forbindelser fra udvalgte Streptomyces-arter. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2015, 25, 5646-5649. [CrossRef] [PubMed]
14. Jiang, Y.; Liu, F.-J.; Wang, Y.-M.; Li, H.-J. Dereplication-guidet isolation af nye hepatobeskyttende triterpenoid saponiner fra Celosiae Semen ved højtydende væskekromatografi koblet med elektrospray ionisering tandem quadrupol-time-of-flight massespektrometri. J. Pharm. Biomed. Anal. 2017, 132, 148-155. [CrossRef] [PubMed]
15. Zhang, J.; Li, C.; Che, Y.; Wu, J.; Wang, Z.; Cai, W.; Li, Y.; Ma, Z.; Tu, P. LTQ-Orbitrap-baseret strategi for traditionel kinesisk medicin målrettet klasseopdagelse, identifikation og hendes omics-forskning: Et casestudie om phenylethanoidglycosider i tre forskellige arter af Herba Cistanches. RSC Adv. 2015, 5, 80816-80828. [CrossRef]
16. Yoshizawa, F.; Deyama, T.; Takizawa, N.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. Bestanddelene af Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. II. Isolering og strukturer af et nyt phenylethanoid glycosid og et nyt neolignan glycosid. Chem. Pharm. Tyr. 1990, 38, 1927-1930. [CrossRef]
17. Tanaka, T.; Nakashima, T.; Ueda, T.; Tomii, K.; Kouno, I. Nem diskrimination af aldose-enantiomerer af reversed-phase HPLCistancheChem. Pharm. Tyr. 2007, 55, 899-901. [CrossRef] [PubMed]
18. Wong, WS; Guo, D.; Wang, XL; Yin, ZQ; Xia, B.; Li, N. Undersøgelse af cis-kanelsyre i Arabidopsis thaliana. Plante Fysiol. Biochem. 2005, 43, 929-937. [CrossRef] [PubMed]
19. Kahnt, G. Trans-Cis-ligevægt af hydroxykanelsyrer under bestråling af vandige opløsninger ved forskellig pH. Phytochemistry 1967, 6, 755-758. [CrossRef]
