Del 2 ERCC1-mutationer hæmmer reparation af DNA-skader og forårsager lever- og nyredysfunktion hos patienter

Kontakt:ali.ma@wecistanche.com

Klik her til del 1

Del 2

Klik til Cistanche NZ for nyresygdom

Diskussion

Et nyt tilfælde af bi-allelERCC1mutationer Kun to individer med bi-allelERCC1mutationer er blevet rapporteret til dato, som begge viste CS-lignende funktioner. Det hårdest ramte individ (165TOR) havde en nonsens-variant (Q158X) og en F231L missense-variant i (HhH)2-motivet af ERCC1 (Fig. S5 F), udviste væksthæmning, udviklingssvigt og kontrakturer og døde efter første leveår på grund af lungebetændelse (Jaspers et al., 2007). Det andet ramte individ (CS20LO) havde kontrakturer, mikrocefali og hypertoni og var homozygot for F231L missense-varianten og døde i det andet leveår (Kashiyama et al., 2013).

Vi rapporterer to søskende med bi-alleliskERCC1mutations—a paternally inherited missense variant (p.R156W; c.466C>T) og en nul-allel på grund af en maternalt nedarvet intragen deletion. Alt det resterende ERCC1-protein udtrykt i celler fra disse patienter bærer R156W-aminosyresubstitutionen, som afbryder en saltbro mellem den positivt ladede R156-rest og den modsatte negativt ladede D129-rest placeret lige under den XPA-bindende lomme i det centrale domæne afERCC1. Virkningen af ​​denne substitution er todelt: (1) den formindsker kraftigt den samlede stabilitet af ERCC1 og dens bindingspartner XPF, og (2) den påvirker specifikt interaktionen med XPA (fig. 9).

Reducerede nukleare proteinniveauer af ERCC1 på grund af delvis fejlfoldning

Western blot og immunfluorescensanalyser afslørede, at den samledeERCC1and XPF protein levels are dramatically reduced to below 20% of WT levels in the fibroblasts from both siblings. This effect is also recapitulated by the bi-allelic KI of the missense mutation (p.R156W; c.466C>T) i det endogeneERCC1locus for RPE1-hTERT-celler. Interessant nok førte fuldstændigt tab af ERCC1 hos mus til død inden for 4 uger, mens stigende proteinniveauer til omkring 15 procent af niveauerne i WT-mus øgede levetiden fem gange (Weeda et al., 1997), hvilket tyder på, at selv lave niveauer af ERCC1 øge potentialet for levedygtighed betydeligt. I overensstemmelse med vores resultater har tidligere undersøgelser vist, at missense mutationer i det centrale domæne afERCC1forårsager generelt destabilisering (Sijbers et al., 1996b), hvilket indikerer, at denne region er vigtig for proteinstabilitet.

Den nyligt rapporterede kryogene elektronmikroskopi struktur i fuld længdeERCC1-XPF heterodimer (Jones et al., 2020) afslører, atERCC1R156rest er placeret på selve kanten af ​​heterodimeren. Vi spekulerer i, at den øgede omfang og ændrede elektroniske struktur af substitutionen af ​​en arginin med tryptophan ikke kun forstyrrer den XPA-bindende lomme, men også dimeriseringsgrænsefladen mellem det centrale domæne af ERCC1 og nukleasedomænet af XPF, hvilket forårsager generel destabilisering (fig. S5 F). Af interesse er missense-varianten XPFR799W placeret ved den samme grænseflade på XPF-siden (Fig. S5 F) og resulterer også i destabilisering og alvorligt reducerede XPF-proteinniveauer (Mori et al., 2018). Hos et afficeret individ (CALIF1010), som præsenterede CS-lignende og segmentelle progeroidegenskaber, blev XPFR799W-varianten nedarvet sammen med en intergen deletion i den anden XPF-allel, hvilket resulterede i en stærk NER-defekt kombineret med en mild ICL-reparationsdefekt (Mori et al. al., 2018), svarende til søskende rapporteret i denne undersøgelse.

Ektopisk udtryk for en inducerbar version afERCC1R156Wi 24 timer gjorde det muligt for os at nå WT-niveauer af dette mutante protein, hvilket resulterede i fejllokalisering i cytoplasmaet, reduceret interaktion med XPF og øget interaktion med proteinfoldende chaperoner, som påvist af MS. Disse resultater støtter alle tanken om, atERCC1R156Wer delvist fejlfoldet og nedbrudt i patientceller, hvilket resulterer i en -80 procent reduktion i ERCC1 nukleare proteinniveauer. KI af ERCC1R156W i RPE1-hTERT-celler understøtter denne konklusion.

Når man sammenlignerERCC1og XPF-proteinniveauer i PV46LD- og PV50LD-celler med dem i celler fra mere alvorligt ramte individer (165TOR og CS20LO), bemærkede vi, at disse niveauer var sammenlignelige eller måske endda lavere i celler fra søskende, beskrevet i denne undersøgelse (fig. 3). C og Fig. S3, E og F; Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). Bemærk, at CS20LO er homozygot for ERCC1F231L, mens 165TOR er heterozygot og bærer et ekstra for tidligt stop på den andenERCC1allel (Q158X). Disse resultater tyder på, at ud over reducerede proteinniveauer skal funktionaliteten af ​​det mutante protein, der stadig udtrykkes, og kombinationen af ​​de to muterede alleler tages i betragtning som en potentiel modulator af fænotypisk sværhedsgrad og ekspressivitet.

ERCC1R156W: Differentiel indvirkning på ERCC1-afhængige DNA-reparationsveje

Ekspression af ERCC1R156W-GFP i ERCC1-KO-celler ved niveauer svarende til ERCC1WT gjorde det muligt for os at adskille virkningen af ​​aminosyresubstitutionen på proteinstabilitet fra indvirkningen på proteinfunktionalitet. Mens det mutante ERCC1R156W-protein var alvorligt svækket i dets UV-inducerede interaktion med XPA og fisk og ikke kunne lokaliseres effektivt til steder med UV-inducerede DNA-læsioner, opdagede vi stadig betydelig (~40 procent) reparationsaktivitet i UDS-assays, klonogene overlevelser, og in vitro NER-assays. Disse resultater tyder på, at et mutant ERCC1-protein, der kun interagerer meget svagt med NER-komplekset, stadig kan understøtte betydelige niveauer af NER-aktivitet (~40 procent) inde i celler. Tilsammen tyder disse fund på, at det lave ekspressionsniveau af ERCC1 (~20 procent) kombineret med den resterende GGR-aktivitet af de mutante proteiner, der stadig udtrykkes, giver tilstrækkelig beskyttelse til at forhindre PV46LD og PV50LD i at udvikle fuld-blæst XP. Faktisk blev resterende GGR-aktivitet stadig påvist under mere følsomme forhold i UDS-assays sammenlignet med fibroblaster fra en alvorligt påvirket og cancer-tilbøjelig XP-A-patient. Ikke desto mindre kan begge patienter stadig være i risiko for at udvikle hudkræft, og beskyttelse mod sollys tilrådes derfor. Den resterende aktivitet i PV46LD- og PV50LD-celler var enten lig med eller lavere end den reparationsaktivitet, vi påviste i 165TOR- eller CS20LO-celler (fig. 6 J; Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). Den kliniske sværhedsgrad korrelerer derfor ikke med NER-aktivitet, men skyldes sandsynligvis en rolle af ERCC1 uden for NER, som er vigtig under udvikling.

På trods af vores resultater om, at ERCC1R156W viste en reduceret interaktion med SLX4 og også blev rekrutteret mindre effektivt til lokaliteter med lokal ICL-induktion, afslørede yderligere analyse, at ERCC1R156W-mutantproteinet kun var mildt påvirket til at understøtte ICL-reparation, når det udtrykkes ektopisk i ERCC1- KO celler. Indvirkningen på ICL-reparation var dog meget mildere end virkningen af ​​R156W-substitutionen på NER, som kombineret med tidligere resultater af, at reparationen af ​​ICL'er kræver meget mindre ERCC1-protein end reparationen af ​​NER-specifikke DNA-læsioner (Jaspers et al. , 2007; Sijbers et al., 1996b), kan meget vel forklare den milde indvirkning på ICL-reparation. I patientfibroblaster, som har stærkt reducerede niveauer af ERCC1, opdagede vi moderat følsomhed såvel som øget kromosombrud ved eksponering for den ICL-inducerende forbindelse MMC, omend meget mildere end celler fra en FA-patient, der blev inkluderet parallelt. Det er vigtigt, at hverken PV46LD eller PV50LD har vist nogen åbenlyse tegn på FA-lignende kliniske træk, hvilket tyder på, at ERCC1R156W mutantproteinet giver tilstrækkelig beskyttelse mod den lave endogene ICL-belastning hos disse patienter.

ERCC1-mangel forårsager nedsat lever- og nyrefunktion

Mus, der er KO for enten ERCC1 eller XPF for at vise alvorligt løb (dvs. mindre og svagere end WT-mus) og dør før de første 4 uger af livet på grund af alvorlig leversvigt (McWhir et al., 1993; Sijbers et al., 1996b; Tian et al., 2004; Weeda et al., 1997). Leverspecifik ekspression af ERCC1 i disse mus korrigerede delvist den mindre størrelse og forlængede levetiden op til 12 uger, men afslørede også alvorlignyre dysfunktionog nyresvigt som sekundær dødsårsag (Selfridge et al., 2001). KO-mus, der er specifikke for XP eller FA, udviser ikke leversygdom, hvilket tyder på, at denne fænotype ikke er forårsaget af en NER- eller ICL-reparationsdefekt. Det er muligt, at delvis redundans mellem disse to veje, som går tabt i ERCC1-KO-mus med mangel på begge veje, kan forklare denne fænotype. I tråd med denne idé, hepatocyt ognyre-proksimale tubulicellerblev polyploid i ERCC1-KO-mus og akkumulerede høje niveauer af p53 (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997), hvilket tyder på, at akkumulering af endogen DNA-skade i disse organer kan ske. Den præcise natur af denne endogene DNA-læsion forbliver imidlertid uklar.

Interessant nok viser mus med fælles inaktivering af både NER- og ICL-reparation ikke leverdysfunktion, hvilket tyder på, at redundans mellem disse DNA-reparationsveje ikke er den eneste forklaring, og at en yderligere funktion af ERCC1-XPF uden for disse DNA-reparationsveje bidrager til nedsat leverfunktion (Mulderrig og Garaycoechea, 2020). Det er muligt, at ERCC1-XPF er involveret i yderligere DNA-reparationsveje, der håndterer endogen DNA-skade. For eksempel har ERCC1-XPF for nylig vist sig at virke på alternative DNA-strukturer, såsom Z-DNA, hvor det samarbejder med fejlparringsreparationsproteiner snarere end NER- eller ICL-reparationsfaktorer (McKinney et al., 2020). Derudover viste det sig, at ERCC1-XPF er involveret i en undervej til reparation af baseudskæring sammen med RECQ1-helikasen (Woodrick et al., 2017).

De to søskende (PV46LD og PV50LD) i denne undersøgelse udviste manglende trives, kort statur og mangel på subkutant fedt, der minder om den lille størrelse observeret i ERCC1-KO-mus (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997). Desuden udviklede søskendene leverskader med et overvejende kolestatisk billede, der førte til ortotopisk levertransplantation før 9 års alderen. Denne indgriben forhindrede klart tidlig død, men forbedrede ikke den manglende trives, som det fremgår af post-transplantation vækst af vægt, højde og hovedomkreds et godt stykke under den tredje centil.

Af interesse blev kolestatisk leversygdom rapporteret som et almindeligt træk hos egyptiske CS-patienter, hvilket tyder på, at dette bør overvåges tættere hos CS-patienter fra anden etnisk baggrund for at se, om dette er et mere almindeligt træk end tidligere anerkendt (Abdel Ghaffar et al. , 2011). Selvom der ikke er beskrevet leverabnormaliteter hos XP-patienter, er der nogle tilfælde af hepatisk cytolyse (cellenedbrydning eller bristning) hos FA-patienter (Masserot-Lureau et al., 2012), som kan adskille sig fra leverabnormaliteter observeret i ERCC 1- mangelfulde søskende. Histologisk undersøgelse af en leverbiopsi fra den ældre søskende (PV50LD) afslørede ændringer i hepatocytmorfologi med nuklear udvidelse og variabilitet, som bemærket i de ERCC-1-deficiente mus (Fig. S1 D; N´uñez et al., 2000) ).

Den anden dødsårsag i ERCC1-KO-mus med leverspecifik ekspression af ERCC1 var alvorlignyresvigt(Selfridge et al., 2001). Begge søskende viser også nyreinsufficiens med træk, der tyder på proksimal tubulær dysfunktion, der fører til progressivnyreværdiforringelse. Imidlertid stabiliserede tubulær funktion sig efter levertransplantationen, mennyrefungerekræver løbende overvågning. Den renale fænotype af ERCC1- KO-musene – med dilaterede tubuli indeholdende lækket proteinholdigt materiale i overensstemmelse med en tubulopati (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997) – er lignende til patienterne beskrevet i vores undersøgelse. Desuden er nedsat nyrefunktion og, i nogle tilfælde, svigt blevet rapporteret i kombineret XP/CS (Ben Chehida et al., 2017; Kondo et al., 2016; Kralund et al., 2013) samt CS (Funaki et al. ., 2006; Reiss et al., 1996; Sato et al., 1988), mens der er en sammenhæng mellem FA og strukturelle anomalier inyrehas also been reported (Sathyanarayana et al., 2018). The phenotype in these siblings is distinct from prior reports of individuals with biallelic ERCC1 mutations and also distinct from the known phenotypic entities, CS and XP. Neither individual had features suggestive of FA. There may be parallels between the phenotype of these siblings and a previously reported individual with biallelic ERCC1 mutations (XP2020DC; p.K266X; IVS6-26G>A) som døde i en alder af 37 år (Gregg et al., 2011; Imoto, K., et al. 2007. Patienter med defekter i de interagerende nukleotidudskæringsreparationsproteiner ERCC1 eller XPF viser xeroderma pigmentosum med sen-debuterende svær neurologisk degeneration [Abstract] J. Invest. Dermatol. 127:S92). Selvom der ikke blev rapporteret om nedsat leverfunktion, udviklede denne patient alvorlig hjerneatrofi i en alder af 15, som udviklede sig til progressiv neurodegeneration med demens. Mild hjerneatrofi er også blevet observeret hos begge søskende i en alder af 13 og 11, hvilket indikerer, at den neurologiske udvikling af begge søskende bør overvåges nøje.

A previously reported 15-yr-old boy with bi-allelic XPF mutations (XP51RO; p.R153P; c.458G>C; Jaspers et al., 2007; Niedernhofer et al., 2006) præsenterede for en fænotype med en vis overlapning med søskende rapporteret her, herunder lysfølsomhed uden hudkræft, kort statur, mangel på subkutant fedt, udviklingsforsinkelse og nyreinsufficiens (Niedernhofer et al., 2006). Til forskel fra de søskende, der er rapporteret her, viste denne dreng udtalte segmentale progeroid-træk, men et meget mildere leverbillede uden kolestase. De søskende, der er rapporteret her, viser, at bi-alleliske ERCC1-mutationer kan forårsage et spektrum af fænotyper, fra det, der typisk ses i CS til en fænotype, der omfatter mildere kortvoksning, lysfølsomhed og svær lever- ognyreværdiforringelse, potentielt på grund af en kombineret stærk indvirkning på NER og en samtidig indvirkning på ICL-reparation, som især kan påvirke disse organer.

Materialer og metoder

Alle procedurer udført i denne undersøgelse er i overensstemmelse med de etiske standarder og blev godkendt af Human Ethics Committee på Royal Children's Hospital, Melbourne, Victoria, Australien (HREC36291C) og UK National Research Ethics Service Committee North East–Newcastle og North Tyneside 2. Patienter blev rekrutteret til programmer for udiagnosticerede sygdomme for pædiatriske patienter med formodede "forældreløse" Mendelske lidelser. Spyt- eller blodprøver fra patienterne og deres familiemedlemmer blev indsamlet til genomisk DNA-ekstraktion efter skriftligt informeret samtykke var givet. Forældrene har givet tilladelse til at vise uredigerede fotografier af de berørte søskende i fig. 1 A.

Next-generation sequencing (NGS) DNA extracted from the blood of both affected siblings and unaffected parents was subjected to exome capture and sequencing through Oxford Gene Technologies Ltd. Genomic data were analyzed using a custom-made in-house pipeline using an autosomal recessive disease model. A paternally inherited missense variant in NM_202001.2 (ERCC1), g.45922415G>A, c.466C>T blev identificeret i begge berørte individer i exon 4 af 8 af ERCC1-genet. Ved indledende undersøgelse af exome-dataene hos begge berørte individer så denne variant ud til at være i en homozygot tilstand, men var til stede i en heterozygot tilstand hos faderen og fraværende hos moderen, hvilket tyder på en mulig deletion på den maternelle allel. Missense-varianten er til stede i gnomAD-databasen med en frekvens på 0.01 procent (22 heterozygoter, ingen homozygoter) og er ikke tidligere blevet rapporteret hos berørte individer. Missense-varianten er blevet deponeret i LOVD-databasen (http://www.LOVD.nl/ERCC1_000020 og http://www.LOVD.nl/ERCC1_000021) og ClinVar-databasen ( variation ID: 978472).

Påvisning af sletningen ved qPCR

For at detektere deletionen blev genomisk DNA ekstraheret fra lymfocytter/epitelceller, og den relevante region af ERCC1-genet blev amplificeret i en qPCR. qPCR blev udført ved hjælp af prober og specifikke primere (angivet i tabel S1) designet ved hjælp af Universal ProbeLibrary Assay Design Center (Roche) og syntetiseret af Sigma-Aldrich. Primerne blev designet til at inkludere den deleterede region i exon 4 og en region i genet, der ikke er deleteret som en kontrol (exon 5). En multiplex qPCR ved hjælp af LightCycler R 480 Probes Master-reaktionsblandingen (Roche) blev udført i henhold til producentens protokol for at amplificere og kvantificere ERCC1-genregionen ved at bruge CFTR-genet (exon 27) som en intern standard (tabel S1). qPCR blev udført på LightCycler R 480-instrumentet (Roche), og dataanalyse blev udført ved hjælp af LightCycler R 480-softwareversion 1.5.0 (Roche). American College of Medical Genetics retningslinjer blev fulgt for fortolkning af sekvensvariation.

Påvisning af missense-varianten ved Sanger-sekventering

Genomisk DNA blev isoleret ved at resuspendere cellepelleter i helcellelysatbuffer (50 mM KCL, 10 mM Tris, pH 8.0,25 mM MgCl2, {{12} },1 mg/ml gelatine, 0,45 procent Tween-20 og 0,45 procent NP-40) indeholdende 0,1 mg/ml Proteinase K (EO0491; ThermoFisher Scientific) og inkuberer i 1 time ved 56 grader efterfulgt af 10-min. varmeinaktivering af Proteinase K ved 96 grader. Fragmenter på ~1 kb, der spænder over missense-mutationerne, blev PCR-amplificeret (sekventeringsprimere er anført i tabel S1) efterfulgt af Sanger-sekventering ved brug af enten den fremadrettede eller den omvendte primer.

Cellelinjer

Fibroblastcellelinjer blev etableret fra hudbiopsier fra både berørte individer og forældre. Alle cellelinjer (angivet i tabel S2) blev dyrket ved 37 grader i en atmosfære af 5 procent CO2 indium (Thermo Fisher Scientific) suppleret med penicillin/streptomycin (Sigma-Aldrich) og 10 procent FBS (Bodinco BV). Alle cellelinjer blev rutinemæssigt testet for mycoplasmainfektion.

Fibroblast-immortalisering med hTERT

WT (48BR) og PV50LD fibroblasterne blev udødeliggjort ved nukleofektion af p Babe-Neo-TERT (Addgene Plasmid #1774) under anvendelse af Amaxa Nucleofector (program U23). Hver elektroporation indeholdt 400,000 fibroblaster og 2,5 µg plasmid-DNA. Efter elektroporation blev celler podet i 25-cm2 vævskulturkolber indeholdende 5 ml DMEM og 10 procent FBS. Efter 2 dage blev dyrkningsmediet erstattet med et medium indeholdende 20 µg/ml neomycin.

/streptomycin (Sigma-Aldrich) og 10 procent FBS (Bodinco BV). Alle cellelinjer blev rutinemæssigt testet for mycoplasmainfektion.

Plasmidkonstruktioner

All plasmids used in this study are listed in Table S3. The GFP gene in pERCC1-GFP-N1 (Houtsmuller et al., 1999) was replaced with m Venus (a gift of Joachim Goedhart, Amsterdam, Netherlands) using AgeI and BsrGI. The GFP-NLS gene (Luijsterburg et al., 2017) was inserted into pcDNA5-FRT-TO-Puro. The ERCC1-m Venus cassette was amplified by PCR (see Table S1 for primers) and inserted as a NheI and BspEI fragment into plenty-CW57-TO-GFP digested with NheI and AgeI to generate plenty-CW57-TO-ERCC1WT-mVenus. Overlap PCR was used to introduce the c.466C>T-mutationer i ERCC1. Det overlappende PCR-produkt blev indsat som et Nhel- og Agel-fragment for at generere rigeligt-CW57-TO-ERCC1R156W-mVenus. ERCC1WT og ERCC1R156Wblev indsat som NheI- og AgeI-fragmenter i pcDNA5-FRT-TO Puro-EGFP-N1 for at generere pcDNA5-FRT-TO-Puro-ERCC1WT-EGFPog pcDNA5-FRT-TO -Puro-ERCC1R156W-EGFP. Stedstyret mutagenese blev brugt til at introducere punktmutationer i pMacro Bac-XPF-ERCC1WT ved hjælp af KOD-plus mutagenese-kittet (Toyobo) som beskrevet i producentens protokol ved hjælp af primerne anført i tabel S1. Alle sekvenser blev verificeret ved Sanger-sekventering.

Generering af KO-celle

linjer til at generere enkelte KO'er, U2OS(FRT) og RPE1-hTERT (PuroR/TP53-dKO)-celler blev cotransficeret med pLV-U6g-PPB, der koder for et guide-RNA fra Leiden University Medical Center/Sigma -Aldrich single-guide RNA (sgRNA) bibliotek (se tabel S3 for plasmider og tabel S4 for sgRNA sekvenser) målrettet mod ERCC1 genet sammen med en ekspressionsvektor, der koder for Cas9-2A-GFP (pX458; Addgene #48138) ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Transficerede U2OS(FRT)-celler blev selekteret på puromycin (1 µg/ml) i 3 dage og udpladet ved lav densitet, hvorefter individuelle kloner blev isoleret. Transficerede RPE1-hTERT-celler blev FACS-sorteret på BFP/GFP og udpladet ved lav tæthed, hvorefter individuelle kloner blev isoleret. KO-kloner blev verificeret ved Western blot-analyse. Fraværet af Cas9-integration/stabil ekspression blev bekræftet ved Western blot.

Generering af stabile cellelinjer

En enkelt ERCC1 KO-klon i U2OS(FRT)-baggrunden (se tabel S2) blev brugt til stabilt at udtrykke ERCC1WT-GFP, ERCC1R156W-GFP eller GFP-NLS ved cotransfektion af pcDNA5-FRT-TO-Puroplasmid, der koder for disse cDNA'er (2 µg), sammen med pOG44-plasmid, der koder for Flp-rekombinasen (0,5 µg). En polyklonal cellepopulation blev opnået efter selektion på 1 µg/ml puromycin og 4 µg/ml blasticidin S. Ekspression af de GFP-mærkede ERCC1-proteiner eller GFP-NLS blev induceret ved tilsætning af 2 µg/ml doxycyclin i 24 timer.

Generering af KI-cellelinjer

For at generere homozygote KI'er blev RPE{0}}hTERT-celler først behandlet i 30 minutter med 1 µM DNA-PK-hæmmer (NU7441) for at undertrykke fejltilbøjelig DSB-reparation og øge brugen af ​​homologiafhængig reparation. Efterfølgende blev 350,000 celler resuspenderet i 20 µl nukleofektorbuffer (V4XP-3032; Lonza) i nærværelse af 4,5 µg plasmid indeholdende Cas9 og sgRNA målrettet mod ERCC1-genet (se tabel S3 for plasmider og tabel S4 forsgRNA-sekvenser) og 100 µM enkeltstrenget donor-DNA indeholdende patientmutationen samt tavse mutationer for at ødelægge PAM-stedet for at forhindre genskæring af Cas9 og tavse mutationer for at indføre et HindIII-restriktionssted for at lette screening af KI-kloner. Celler blev elektroporeret under anvendelse af anAmaxa 4D-X Nucleofector Unit (Lonza) under anvendelse af EA-104-programmet. Efter elektroporering blev celler udpladet ved lav densitet i McCoy-medium med 10 procent FBS. Den næste dag blev mediet erstattet med DMEM (10 procent FBS og 1 procent penicillin/streptomycin), og celler fik lov til at danne kolonier. Cirka 400 kolonier blev isoleret og udvidet. Genomisk DNA blev isoleret, og et fragment inklusive den indførte mutation og det indførte restriktionssted (HindIII) blev amplificeret ved indlejret PCR (se tabel S1 for primere). PCR-fragmenter blev fordøjet med HindIII (NEB) i 3 timer ved 37 grader og derefter adskilt ved gelelektroforese. Klonerne, der havde det indførte HindIII-restriktionssted, blev analyseret ved Sanger-sekventering (se tabel S1 for primere). Vi opnåede to homozygote KI-kloner blandt 400 isolerede kloner, hvilket svarer til en KI-effektivitet på ~0,5 procent.

Lentiviral transduktion

til lentiviral transduktion blev mVenus-ERCC1WT eller mVenus ERCC1R156W indsat i lentiviral vektor pLenti-CW57-TO. HEK293T blev transficeret med vektorer, der koder for disse ERCC1-fusioner, VSV-G, RRE og REV under anvendelse af JetPEI (Sigma Aldrich) til at producere virussen. Den virusholdige supernatant blev opsamlet efter 24 timer og filtreret med et 0.44-µm filter. Primære fibroblaster PV46LD og PV50LD blev lentiviralt transduceret i nærvær af polybren (Sigma-Aldrich). Celler blev udvalgt med 15 µg/ml puromycin. Ekspression af de mVenus-mærkede ERCC1-proteiner blev induceret ved tilsætning af 2 µg/ml doxycyclin i 24 timer.

Klonogene overlevelsesassays

Cells were trypsinized, seeded at low density, and allowed to attach. The next day, cells were either mock-treated or exposed to an increasing dose of UV light (1, 2, 3, and 4 J/m2 of UV-C 266nm), an increasing dose of IR (2, 4, 6, and 8 Gy), or increasing concentrations of MMC (2, 4, 6, and 8 ng/ml). After 7–9 d, the cells were washed with 0.9% NaCl and stained with methylene blue. Colonies of >20 celler blev bedømt. Overlevelseseksperimenter blev udført i to eksemplarer og gentaget mindst to gange.

Immunpræcipitation for Co-IP

Celler blev mock-behandlet eller UV-C-bestrålet (20 J/m2) og høstet efter 1 time. Cellepelleter blev lyseret i 20 minutter på is i EBC-150-buffer (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 procent NP-40, 2 mM MgCl2 og proteaseinhibitor cocktail [Roche]) suppleret med 500 U/ml Benzonase Nuclease (Novagen). Cellelysater blev inkuberet i 1,5 time ved 4 grader med GFP-Trap A-perler (Chromotek). Perlerne blev derefter vasket seks gange med EBC-150-buffer (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 procent NP-40, 1 mM EDTA og proteaseinhibitorcocktail) og kogt i Laemmli-SDS prøvebuffer.

Western blot

Celler blev centrifugeret ned, vasket med PBS og kogt i 1 0 min i Laemmli-buffer (40 mM Tris, pH 6,8, 3,35 procent SDS, 16,5 procent glycerol, 0,0005 procent bromphenolblåt og 0,05 procent M dithiothreitol). Proteiner blev separeret på 4 procent –12 procent Criterion XT Bis-Tris geler (#3450124; Bio-Rad) i NuPAGE MOPSrunning buffer (NP0001-02; Thermo Fisher Scientific) og blottet på polyvinylidenfluoridmembraner (IPFL00010; EMD Millipore) ). Membranen blev blokeret med blokeringsbuffer (MB-070-003; Rock land) i 1 time ved stuetemperatur. Membranen blev derefter probet med antistoffer (angivet i tabel S5) som angivet. Et Odyssey CLx-system (LI-COR Biosciences) blev brugt til påvisning.

RNA-gendannelsesassay (RRS)

30,000 celler blev podet på 12-mm dækglas i 24-brøndsplader i DMEM med 1 procent FBS. Efter 24 timer blev celler bestrålet med UV-C i en dosis på 6 J/m2 og inkuberet i et konditioneret medium i forskellige tidsperioder ({{20}} timer, 3 timer og 18 timer). Efter inkubation blev begyndende transkriptioner mærket ved at inkubere cellerne med 400 µM 5-ethynyl-uridin (CLK-N002-10; Jena Bioscience), som derefter blev visualiseret med en Click-iT-blanding bestående af 50 mM Tris-buffer, pH 8,0, 60 µM Atto-azid (647N-101; ATTO-TEC), 4 mM CuSO4•5H2O, 10 mM L-ascorbinsyre (A0278; Sigma-Aldrich) og 0,1 µg/ml DAPI (D1306; Thermo Fisher Scientific) i 1 time. Celler blev vasket tre gange i 5 minutter med PBS og monteret på objektglas (Thermo Fisher Scientific) ved anvendelse af Aqua Polymount (Brunschwig).

Immunfluorescens

Til immunfluorescerende farvning blev 250,000 celler podet på 18-mm glasdækglas. Den næste dag blev celler fikseret med 4 procent paraformaldehyd, efterfulgt af permeabilisering med {{10}},5 procent Triton X-100 i 10 min. Celler blev behandlet med 100 glyciner i PBS i 10 minutter for at blokere uomsatte aldehydgrupper, skyllet med PBS og ækvilibreret i vaskebuffer (PBS indeholdende 0,5 procent BSA og 0,05 procent Tween-20; Sigma-Aldrich) i 10 minutter. Antistoftrin og vask var i vaskebuffer. De primære antistoffer blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur, efterfulgt af sekundære antistoffer i 1 time og DAPI i 5 minutter. Primære og sekundære antistoffer er angivet i tabel S5. Celler blev inkuberet med 0,1 µg/ml DAPI og monteret ved anvendelse af Aqua Polymount.

H2AX farvning

200,000 celler blev podet på 18-mm glasdækglas i 24-brøndsplader med DMEM (10 procent FBS og 1 procent P/S). Den næste dag blev cellerne udsat for IR af YXlon International røntgengenerator (200 KV, 4 mA; dosishastighed 2 Gy/min). På de angivne tidspunkter blev celler fikseret med 3 procent paraformaldehyd i PBS i 10 minutter og farvet for H2AX i 1 time (se ovenfor). Billeder blev kvantificeret ved hjælp af en specialbygget makro i ImageJ, der muliggjorde automatisk og objektiv analyse af antallet af foci pr. celle, som beskrevet tidligere (Typas et al., 2015).

Mikroskopisk analyse af fikserede celler

Billeder af fikserede prøver blev taget på et Zeiss AxioImagerM2 eller D2 bredfelts fluorescensmikroskop udstyret med 63× PLAN APO (1,4 numerisk apertur [NA]) olie-immersionsobjektiver (Zeiss) og en HXP 120 metalhalogenlampe brugt til excitation. Fluorescerende prober blev detekteret ved hjælp af følgende filtre til DAPI (excitationsfilter: 350/50 nm; dikroisk spejl: 400 nm; emissionsfilter: 460/50 nm), Alexa 555 (excitationsfilter: 545/25 nm; dichroisk spejl: dichroisk spejl: 565 ; emissionsfilter: 605/70 nm), eller Alexa 647 (excitationsfilter: 640/30 nm; dikroisk spejl: 660 nm; emissionsfilter: 690/50 nm). Billeder blev optaget ved hjælp af ZEN 2012-software og analyseret i ImageJ.

UV laser mikrobestråling

Celler blev dyrket på 18-mm kvarts (UV-C) eller glas (UV-A) dækglas og anbragt i et Chamlide CMB magnetisk kammer, hvori vækstmediet blev erstattet af CO2-uafhængig Leibovitz L{ {4}} medium (Thermo Fisher Scientific). UV-C laserspor blev lavet ved hjælp af en diodepumpet faststof 266-mm yttrium aluminium granatlaser (gennemsnitlig effekt 5 mW, gentagelseshastighed op til 10 kHz og pulslængde 1 ns). Før UV-Amicro-bestråling blev celler enten sensibiliseret med 6 µM trioxsalen i 1 time for at generere ICL'er eller med 15 µM BrdU i 24 timer for at generere DSB'er. UV-A laserspor blev lavet af en diodepumpet faststof 355-nm Yttrium Aluminium Granat-laser (gennemsnitlig effekt 14 mW og gentagelseshastighed op til 200 Hz). Begge lasere blev integreret i et UGA-42-Caliburn/2L Spot Illumination-system (Rapp OptoElectronic).

Mikrobestråling blev kombineret med levende-celle-billeddannelse i et miljøkammer indstillet til 37 grader på et bredfelts fluorescerende Zeiss Axio Observer 7-mikroskop i helt kvarts, ved brug af et 100× (1.2NA) ultrafilter glycerol-immersion-objektiv (UV-C) ) eller et Plan-Neofluar 63× (1,25 NA) olie-immersion objektiv (UV-A). Lasersystemet er koblet til mikroskopet via en TriggerBox, og et filter med neutral densitet (ND-1) blokerer 90 procent af laserlyset. AnHXP 120-V metalhalogenlampe blev brugt til excitation. Billeder blev erhvervet i Zeiss ZEN og kvantificeret i ImageJ.

Kromosombrudsanalyse

2 × 1{{20}}6 fibroblaster blev podet i 175-cm2 vævskulturkolber med DMEM (10 procent FBS) og dyrket ved 37 grader i nærvær eller fravær af 50 nM MMC. Efter 48 timer blev 600 µl demecolcin (10 µg/µl) tilsat til hver dyrkningskolbe, og celler blev inkuberet i yderligere 30 minutter ved 37 grader for at berige for metafaser. Celler blev derefter trypsiniseret og resuspenderet i 75 mM KCL og inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur. Cellerne blev centrifugeret ned, resuspenderet i 10 ml fikseringsmiddel (75 procent methanol og 25 procent eddikesyre), inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur og centrifugeret. Pellets blev resuspenderet i 10 ml fikseringsmiddel og inkuberet i 5 minutter ved stuetemperatur. Dette trin blev gentaget, og til sidst blev pelleten resuspenderet i 0,5-1,0 ml fiksativ. Cellesuspensionen blev dryppet på et objektglas og fik lov til at tørre. Objektglassene blev farvet i 5 minutter i en 3 procent Giemsa-opløsning, skyllet i postevand og fik lov til at tørre. Slides blev kodet, og fra hver kodet kultur blev 50 metafaser undersøgt for kromosombeskadigelse. Efter scoring blev objektglassene afkodet, og resultaterne blev analyseret som præsenteret (Stoepker et al., 2011).

UDS

180,000 celler blev podet på 18-mm dækglas i 12-brøndsplader i DMEM med 1 procent FBS. Efter 24 timer blev celler lokalt bestrålet gennem et 5-µm filter med 30 J/m2 UV-C. Celler blev efterfølgende pulsmærket med 20 µM EdU (VWR) og 1 µM 5-fluor-deoxyuridin (Sigma-Aldrich) i enten 1 time eller 4 timer. Efter mærkning blev cellerne medium jaget med 10 µM thymidin i DMEM uden tilskud i 30 minutter og fikseret i 15 minutter med 3,7 procent formaldehyd i PBS. Celler blev permeabiliseret i 20 minutter i PBS med 0,5 procent Triton-X100 og blokeret i 3 procent BSA (Thermo Fisher Scientific) i PBS. Den indbyggede EdU blev koblet til Attoazide Alexa Fluor 647 ved hjælp af Click-iT kemi i henhold til producentens instruktioner (Invitrogen). Efter kobling blev cellerne postfikseret med 2 procent formaldehyd i 10 minutter og efterfølgende blokeret med 100 mM glycin. DNA blev denatureret med 0,5 M NaOH i 5 minutter efterfulgt af blokering med 10 procent BSA i 15 minutter. Derefter blev cellerne inkuberet med et antistof mod cyclobutan-pyrimidin-dimerer (se tabel S5) i 2 timer, efterfulgt af sekundære antistoffer i 1 time og DAPI i 5 minutter. Celler blev monteret i Polymount (Brunschwig).

MS dataindsamling

MS blev udført i det væsentlige som tidligere beskrevet (Salas Lloret et al., 2019). Alle eksperimenterne blev udført på et EASY-nLC 1000-system (Proxeon) forbundet til en Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) gennem en nano-elektrospray-ionkilde. Q-Exactive blev koblet til en 25-cm silica-emitter (FS360-75-15-N-5-C25; NewObjective) internt pakket med 1,9 µm C18-AQ-perler (Reprospher) -DE; Pur; Dr. Manish, Ammerbuch-Entringen, Tyskland). Prøver blev kørt i en 40-min. kromatografigradient fra 0 procent til 30 procent acetonitril og derefter øget til 95 procent acetonitril før søjle-re-ækvilibrering med en flowhastighed på 200 NL/min. Massespektrometeret blev betjent i en dataafhængig indsamlingstilstand med en top-syv-metode og et scanningsområde på 300-1.600 m/z. Full-scan MS-spektre blev opnået ved en målværdi på 3 × 106 og en opløsning på 70,000, og de højere kollisionsdissociations-tandem-massespektre (MS/MS) blev registreret ved en målværdi på 105, og med en opløsning på 35.000, et isolationsvindue på 2,2 m/z og normaliseret kollisionsenergi på 25 procent. Minimumsmålet for automatisk forstærkningskontrol var 104. De maksimale MS1- og MS2-injektionstider var henholdsvis 250 og 120 ms. Precursorionmasserne af scannede ioner blev dynamisk udelukket fra MS/MS-analyse i 30 s. Ioner med ladning 1 og højere end 6 blev udelukket fra at udløse MS2-analyse.

MS-dataanalyse Alle rådata blev analyseret ved hjælp af MaxQuant (version 1.6.6.0) som beskrevet tidligere (Tyanova et al., 2016a). Vi udførte søgningen mod et i silico-fordøjet UniProt referenceproteom for Homo sapiens, inklusive kanoniske og isoforme sekvenser (27. maj, 2019). Databasesøgninger blev udført i henhold til standardindstillinger med følgende modifikationer. Fordøjelse med trypsin/P blev anvendt, hvilket tillod fire manglende spaltninger. Oxidation (M) og acetyl (protein N-term) blev tilladt som variable modifikationer med et maksimalt antal på tre. Carbamido-methyl (C) blev deaktiveret som en fast modifikation. Label-fri kvantificering (LFQ) blev aktiveret, hvilket ikke tillader hurtig LFQ. Max-Quant outputdata blev yderligere behandlet ved hjælp af Perseus beregningsplatform (v 1.6.6.0; Tyanova et al., 2016b). LFQ-intensitetsværdier blev log2-transformeret, og potentielle kontaminanter og proteiner identificeret ved kun sted eller omvendte peptider blev fjernet. Prøver blev grupperet i eksperimentelle kategorier, og proteiner, der ikke blev identificeret i fire ud af fire replikater i mindst én gruppe, blev også fjernet. Manglende værdier blev imputeret ved hjælp af normalfordelte værdier med en 1,8 nedskiftning (log2) og en randomiseret 0,3 bredde (log2) under hensyntagen til hele matrixværdier. Statistisk analyse (t-test) blev udført for at bestemme, hvilke proteiner der var signifikant beriget. Vulkanplot blev genereret, og statistiske analyseoutputtabeller blev viderebearbejdet i Microsoft Excel. MS proteomics data er blevet deponeret til ProteomeXchange Consortium via PRIDE (Perez-Riverol et al., 2019) partnerlager med datasættets identifikator PXD017940.

Oprensning af rekombinant ERCC1-XPF

Baculovirusproduktion blev udført som beskrevet under anvendelse af pMacroBac-His-ERCC1/XPF-HA-konstruktionerne (Enzlin og Sch¨arer, 2002). ERCC1WT og ERCC1R156W blev co-udtrykt med XPFWT fra et enkelt baculovirus i Sf9-insektceller. Heterodimererne blev oprenset over nikkelaffinitet, størrelsesudelukkelse og heparinkromatografi som beskrevet (Enzlin og Sch¨arer, 2002). ERCC1-XPF blev elueret fra heparinsøjlen ved omkring 600 mM NaCl. Proteinkoncentrationer varierede fra 0,1 til 0,2 mg/ml.

Nuklease assay

Et stamløkkesubstrat (GCCAGCGCTCGG(T)22CCGAGCGCTGGC) indeholdende fluorescerende farvestof Cy5 (50 pmol) ved 39 termini (IDT) blev annealet i en 100-µl annealingbuffer (10 mM Tris, pH 7,5 og 50 mM NaCl) ved at opvarme til 95 grader i 5 minutter og langsomt køle ned over en periode på 2 timer. 200 fmol annealet substrat blev brugt i 20-µl reaktioner indeholdende 25 mM HEPES, pH 8,0, 2 mM MgCl2, 10 procent glycerol, 0,5 mM -mercaptoethanol, 0,1 mg/ml BSA, 40 mM NaCl og 0-40 nM protein. Reaktionerne blev inkuberet ved 30 grader i 30 minutter og stoppet ved tilsætning af 10 µl 90 procent formamid/10 mM EDTA. Efter opvarmning ved 95 grader i 5 minutter og afkøling på is, blev 15 µl af hver prøve fyldt på en 15 procent denaturerende polyacrylamidgel. Geler blev kørt ved 30 mA i 30 minutter, og bånd blev visualiseret ved fluorescens af Typhoon RGB (Amersham Biosciences).

In vitro NER-assay

XPF-deficiente (XP2YO) celleekstrakter og plasmidet indeholdende stedspecifik dG-AAF-læsion blev genereret som tidligere beskrevet (Gillet et al., 2005; Shivji et al., 1999) . For hver reaktion, 2 µl reparationsbuffer (2{{40}}0 mM Hepes-KOH, 25 mM MgCl2, 2,5 mM DTT, 10 mM ATP, 110 mM phosphocreatin og 1,8 mg /ml BSA, endelig pH 7,8), 0,2 µl kreatinfosphokinase-buffer (2,5 mg/ml kreatin-phosphokinase fra kaninmuskel [Sigma Aldrich], 10 mM glycin, pH 9,0 og 50 procent glycerol), 3 µl celle-XF-deficient ekstrakt, NaCl (til en slutkoncentration på 70 mM) og oprensede ERCC1-XPF-proteiner i et samlet volumen på 9 µl blev forvarmet ved 30 grader i 10 minutter. 1 µl plasmid indeholdende dG-AAF (50 ng/µl) blev tilsat til hver reaktion, og reaktionerne blev inkuberet ved 30 grader i 45 minutter. Reaktionsblandingen blev derefter afkølet på is i 5 minutter, efterfulgt af tilsætning af 0,5 µl 1 µM komplementær streng d(GGGGCATGTGGCGCCGGTAATAGC TACGTAGCTC), og reaktionsblandingen blev denatureret ved opvarmning ved 95 grader i 5 minutter. Efter 15 minutters annealing ved stuetemperatur blev 1 µl sekvensblanding (indeholdende 0,13 U sekvens og 2,0 µCi [-32P] dCTP for hver reaktion) tilsat. Efter præinkubation ved 37 grader i 3 minutter blev 1,2 µl deoxyribonukleotidtriphosphatblanding (50 µM dCTP, 100 µM dTTP, 100 µM dATP og 100 µM dGTP) tilsat. Reaktionsblandingen blev inkuberet ved 37 grader i 12 minutter, og reaktionen blev stoppet ved at tilsætte 8 µl påfyldningsfarvestof (80 procent formamid og 10 mM EDTA). Prøver blev opvarmet ved 95 grader i 5 minutter, afkølet på is og sat på en 14 procent denaturerende polyacrylamidgel. Geler blev kørt ved 45 W i 2,5 timer, og bånd blev visualiseret ved anvendelse af en PhosphorImager (Typhoon RGB).

Online supplerende materiale

Fig. S1 viser laboratorieværdier af lever- og nyrefunktioner hos søskende 1 og søskende 2. Fig. S2 viser genomiske sekventeringsdata, der bekræfter missense-mutationen og den intragene deletion i ERCC1-genet. Fig. S3 viser proteinekspressionen af ​​ERCC1 og XPF i patientfibroblaster. Fig. S4 viser oprensede rekombinante ERCC1- og XPF-proteiner og Co-IP af ERCC1WT og ERCC1R156W. Fig. S5 viser mikroskopibilleder af UDS, H2AX-fociene og placeringen af ​​patientmutationer i ERCC1-XPF. Tabel S1 indeholder sekvenserne af alle primere og prober anvendt i denne undersøgelse. Tabel S2 viser alle cellelinjer testet i denne undersøgelse. Tabel S3 viser alle plasmider involveret i denne undersøgelse. Tabel S4 viser undersøgelsens sgRNA-sekvenser, og Tabel S5 viser antistofferne. Tabel S6 viser antallet af celler, der anvendes til kvantificering i figurerne. Data S1 viser alle de ubeskårne Western blot-filer.

Anerkendelser

Forfatterne anerkender både søskende og deres forældre for at have bidraget til denne artikel, Sylvie Noordermeer (Leiden University Medical Center [LUMC], Leiden, Holland) for thepLenti-CW57-TO-GFP lentiviral ekspressionsvektor og råd om generering af KI celler, Joachim Goedhart (University of Amsterdam, Amsterdam, Holland) for mVenus cDNA, Bert van derKooij (LUMC, Leiden, Holland) for DNA-PK-hæmmeren, Wim Vermeulen og Anja Rams (Erasmus MC, Rotterdam, Holland) for at levere 165TOR-celler, Tomoo Ogi (University of Nagoya, Japan) for at levere CS20LO-celler, Alan Lehman (University of Sussex, UK) for at levere CSL16NG og CSL16NG hTERT-celler, og Joost Schimmel (LUMC, Leiden, Holland) for at få råd om generering af KI-celler .

Dette arbejde blev finansieret af et Leiden University Medical CenterResearch Fellowship og en Nederlandse Organisatie voor We tenschappelijk Onderzoek VIDI-bevilling (ALW.016.161.320) til MSLuijsterburg, et europæisk forskningsråds startbevilling (310913) til ACO Vertegaal, et KWF Kankerbestrijding YoungInvestigator-stipendium ( 11367) til R. Gonz´alez-Prieto, et KWF Kan kerbestrijding-stipendium (VU 2013-5983) til MA Rooimans, og stipendier fra Korean Institute for Basic Science (IBS-R022-A1) og National Cancer Institute (P01CA092584) til ODSch arer.

Forfatterbidrag: K. Apelt genererede KO-celler, KI-celler og stabile cellelinjer; udførte Western blot og immunfarvninger for ERCC1 og XPF ekspression, lentivirale transduktioner, klonogene overlevelser (UV, MMC, IR), Co-IP eksperimenter til Western blot analyse, UDS eksperimenter, Co-IP eksperimenter for MS og H2AX farvninger; og skrev papiret. A. Kragten udførte UDS, RRS og immunfarvninger efter lokal UV. AP Wonder gem genererede KO- og KI-celler og udførte UDS-eksperimenter, Western blot og Sanger-sekventering for at bekræfte missense-mutationen. SM White ydede rådgivning til patienterne, analyserede exomdata, udførte biopsier, genererede primære fibroblaster og skrev den kliniske patientbeskrivelse. S. Lunke og BT Wilson genererede NGS-data. S. Pantaleoand D. Flanagan udførte qPCR for at validere sletningen. C.Quinlan skrev den kliniske beskrivelse af nyren. W. Hardikar skrev den kliniske beskrivelse af leveren. MA Rooimans og R.MF Wolthuis genererede hTERT-immortaliserede 48BR- og PV50LD-fibroblaster og udførte de MMC-inducerede kromosombrudsassays. R. Gonzalez-Prieto og ACO Vertegaal analyserede alle MS-eksperimenter. WW Wiegant og H. vanadium udførte klonogene overlevelser i U2OS-celler (IR). J.-E.Yeo og HS Kim oprensede rekombinante proteiner og udførte nukleaseassayet og in vitro NER-assayene. OD Sch¨arer-overvåget in vitro NER-arbejde bidrog til den strukturelle fortolkning af R156W-allelen og redigerede papiret. MS Luij sterburg overvågede projektet og skrev papiret.

Referencer

Abdel Ghaffar, TY, ES Elsobky og SM Elsayed. 2011. Kolestase hos patienter med Cockayne syndrom og foreslåede modificerede kriterier for klinisk diagnose. OrphanetJ. Sjælden Dis. 6:13. -1172-6-13

Abdullah, UB, JF McGouran, S. Brolin, D. Ptchelkine, AH El-Sagheer, T. Brown og PJ McHugh. 2017. RPA aktiverer XPF-ERCC1 endonukleasen for at initiere behandlingen af ​​DNA interstreng tværbindinger. EMBO J. 36: 2047–2060.

Adair, GM, RL Rolig, D. Moore-Faver, M. Zabelshansky, JH Wilson og RS Nairn. 2000. ERCC1's rolle i fjernelse af lange ikke-homologe haler under målrettet homolog rekombination. EMBO J. 19:5552-5561.

Ahmad, A., AR Robinson, A. Duensing, E. van Drunen, HB Beverloo, DB Weisberg, P. Hasty, JH Hoeijmakers og LJ Niedernhofer. 2008. ERCC1-XPF-endonuklease letter reparation af DNA-dobbeltstrengsbrud. Mol. Celle. Biol. 28:5082-5092.

Ahmad, A., JH Enzlin, NR Bhagwat, N. Wijgers, A. Raams, E. Appledoorn, AF Theil, JH J Hoeijmakers, W. Vermeulen, NG J Jaspers, et al. 2010. Fejllokalisering af XPF-ERCC1 nuklease bidrager til reduceret DNA-reparation hos XP-F patienter. PLoS Genet. 6:e1000871.

Auerbach, AD 2009. Fanconi anæmi og dens diagnose. Mutat. Res. 668:4-10.

Ben Chehida, A., N. Ghali, R. Ben Abdelaziz, F. Ben Moussa og N. Tebib. 2017. Nyreinddragelse hos 2 søskende med Cockayne Syndrom. Iran. J. Kidney Dis. 11:253-255.

Biggerstaff, M., DE Szymkowski og RD Wood. 1993. Co-korrektion af ERCC1, ERCC4 og xeroderma pigmentosum gruppe F DNA reparationsdefekter in vitro. EMBO J. 12:3685-3692.

-2075.1993.tb06043.xBogliolo, M., B. Schuster, C. Stoepker, B. Derkunt, Y. Su, A. Raams, JP Trujillo, J. Minguillón, MJ Ramı´rez, R. Pujol et al. 2013. Mutationer i ERCC4, der koder for DNA-reparationsendonukleasen XPF, forårsager Fanconi-anæmi. Er. J. Hum. Genet. 92:800-806.

Ceccaldi, R., P. Sarangi og AD D'Andrea. 2016. Fanconi-anæmisvejen: nye spillere og nye funktioner. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17: 337-349.

de Laat, WL, E. Appeldoorn, NG Jaspers og JH Hoeijmakers. 1998a. DNA-strukturelementer, der kræves til ERCC1-XPF-endonukleaseaktivitet. J. Biol. Chem. 273:7835-7842.

de Laat, WL, AM Sijbers, H. Odijk, NG Jaspers og JH Hoeijmakers. 1998b. Kortlægning af interaktionsdomæner mellem humane reparationsproteiner ERCC1 og XPF. Nucleic Acids Res. 26:4146-4152.

nar/26.18.4146

de Vries, A., CT van Oostrom, FM Hofhuis, PM Dortant, RJ Berg, FR de Gruijl, PW Wester, CF van Kreijl, PJ Capel, H. van Steeg og SJ Verbeek. 1995. Øget modtagelighed for ultraviolet-B og kræftfremkaldende stoffer hos mus, der mangler DNA-udskæringsreparationsgenet XPA. Natur. 377:169-173.

DiGiovanna, JJ og KH Kraemer. 2012. Lyser på xeroderma pigmentosum. J. Invest. Dermatol. 132:785-796.

Enzlin, JH og OD Schrer. 2002. Det aktive sted for DNA-reparationsendonukleasen XPF-ERCC1 danner et stærkt konserveret nukleasemotiv. EMBO J. 21:2045-2053.

Funaki, S., S. Takahashi, H. Murakami, K. Harada og H. Kitamura. 2006. Cockayne syndrom med tilbagevendende akut tubulointerstitiel nefritis. Pathol. Int. 56:678-682.

.02029.x

Gillet, LC, J. Alzeer og OD Schrer. 2005. Stedspecifik inkorporering af N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluoren (dG-AAF) i oligonukleotider ved hjælp af modificeret 'ultramild' DNA-syntese. Nucleic Acids Res. 33:1961-1969.

Gregg, SQ, AR Robinson og LJ Niedernhofer. 2011. Fysiologiske konsekvenser af defekter i ERCC1-XPF DNA-reparationsendonuklease. DNA Reparation (Amst.). 10:781-791.

Guo, C., Y. Nakazawa, L. Woodbine, A. Bjorkman, M. Shimada, H. Fawcett, N. Jia, K. Ohyama, TS Li, ​​Y. Nagayama, et al. 2015. XRCC4-mangel hos mennesker forårsager en markant neurologisk fænotype, men ingen åbenlys immundefekt. J. Allergy Clin. Immunol. 136:1007-1017.

Helfricht, A., PE Thijssen, MB Rother, RG Shah, L. Du, S. Takada, M. Rogier, J. Moritz, H. IJspeert, C. Stoepker, et al. 2020. Tab af ZBTB24 svækker ikke-homolog ende-sammenføjning og klasse-switch-rekombination hos patienter med ICF-syndrom. J. Exp. Med. 217:e20191688.

Houtsmuller, AB, S. Rademakers, AL Nigg, D. Hoogstraten, JH Hoeij-makers og W. Vermeulen. 1999. Virkning af DNA-reparationsendonuklease ERCC1/XPF i levende celler. Videnskab. 284:958-961. h

videnskab.284.5416.958

Jaspers, NG, A. Raams, MC Silengo, N. Wijgers, LJ Niedernhofer, AR Robinson, G. Giglia-Mari, D. Hoogstraten, WJ Kleijer, JH Hoeij-makers og W. Vermeulen. 2007. Den første rapporterede patient med human ERCC1-mangel har Cerebro-oculofacio-skeletsyndrom med en mild defekt i nukleotidudskæringsreparation og alvorlig udviklingssvigt. Er. J. Hum. Genet. 80:457-466.

Joenje, H., AB Oostra, M. Wijker, FM di Summa, CG van Berkel, MA Rooimans, W. Ebell, M. van Weel, JC Pronk, M. Buchwald og F. Arwert. 1997. Beviser for mindst otte Fanconi anæmi gener. Er. J. Hum. Genet. 61:940-944.

Jones, M., F. Beuron, A. Borg, A. Nans, CP Earl, DC Briggs, AP Snijders, M. Bowles, EP Morris, M. Linch og NQ McDonald. 2020. Cryo-EM-strukturer af XPF-ERCC1-endonukleasen afslører, hvordan DNA-junction-engagement forstyrrer en auto-hæmmet konformation. Nat. Commun. 11:1120.

Karikkineth, AC, M. Scheibye-Knudsen, E. Fivenson, DL Croteau og VA Bohr. 2017. Cockayne syndrom: Kliniske træk, modelsystemer og veje. Aldring Res. Åb 33:3–17.002

Kashiyama, K., Y. Nakazawa, DT Pilz, C. Guo, M. Shimada, K. Sasaki, H. Fawcett, JF Wing, SO Lewin, L. Carr, et al. 2013. Fejlfunktion af nuklease ERCC1-XPF resulterer i forskellige kliniske manifestationer og forårsager Cockayne syndrom, xeroderma pigmentosum og Fanconi anæmi. Er. J. Hum. Genet. 92:807-819.