Del 2: Anti-fibrotisk virkning af 6-brom-indirubin-3 ′-oxim (6-BIO) via regulering af aktivatorprotein-1 (AP-1) Og specificitetsprotein-1 (SP-1) transkriptionsfaktorer i nyreceller

For del 1, klikher.

3.3. 6-BIO dæmper fibrosemarkører og fibrose-associerede signalveje i de proksimale tubuli (HK-2) og interstitielle fibroblastceller (NRK49F)

Dernæst bekræftede vi effekten af ​​6-BIO på proksimale tubulære celler og interstitielle fibroblastceller. Vi observerede en koncentrations- og tidsafhængig reduktion af GSK3-mRNA-ekspression med 6-BIO i HK-2- og NRK49F-celler (fig. S2A og B), og ekspressionen af ​​ECM- og EMT-relaterede proteiner involveret inyrecellefibroseblev også reduceret (Fig. S2E). Desuden faldt øget ekspression af GSK3, efter TGF-eksponering af disse celler, også ved 6-BIO-behandling (fig. S2C og D). Fig. 3 viser proteinekspression afnyrefibrosemarkører i HK-2- og NRK49F-celler behandlet med TGF. Som vist i fig. 3A steg ekspressionen af ​​PAI-1- og CTGF-proteiner signifikant som respons på behandling med 5 og 10 ng/mL TGF i henholdsvis HK-2- og NRK49F-celler. Imidlertid reduceredes deres udtryk bemærkelsesværdigt efter behandling med 6-BIO (fig. 3B).SMADog MAPK-signalveje blev opreguleret af TGF-behandling, som blev reverseret af 6-BIO-behandlingen (fig. 4). Dernæst undersøgte vi ekspressionen af ​​AP-1- og SP-1-transkriptionsfaktorer involveret i TGF-medieret signalering i HK-2- og NRK49F-celler. Fig. 4D viser, at den TGF-medierede stigning i PC-JUN og PC-FOS blev reduceret som reaktion på behandling med 6-BIO- og JNK-hæmmer SP600125 og efter dominant-negativ C-JUN-transfektion. Fig. 4E viser ændringen i proteinintensitet i forhold til kontrol. Desuden var TGF-medieret stigning i SP-1-niveau signifikant svækket som reaktion på behandling med 6-BIO og SP-1 siRNA (fig. 4F). Fig. 4G viser ændringen i proteinintensitet i forhold til kontrol. Disse resultater tydede på, at TGF /SMADog MAPK-signalering samt transkriptionsfaktorer, AP-1 og SP-1, reguleres af 6-BIO.

3.4. 6-BIO dæmper nuklear ekspression af PC-JUN-, PC-FOS- og SP-1-proteiner i proksimale tubulære og interstitielle fibroblastceller

Fig. 5A og B viser lokaliseringen af ​​PAI-1 og CTGF med PC-JUN, PC-FOS og SP-1. Rød farvning af PC-JUN, PC-FOS og SP-1 indikerede deres overekspression i kernen efter TGF-behandling; på samme måde indikerede grøn farvning af PAI-1 og CTGF deres overekspression i cytosolen. Ekspressionsniveauerne for PC-JUN, PC-FOS og SP-1 blev dog reduceret med 6-BIO-behandlingen. Disse resultater antydede, at 6-BIO direkte påvirker AP-1 og SP-1, de transskriptionsfaktorer, der regulerer PAI-1 og CTGF-ekspression.

3.5. 6-BIO dæmper PAI-1, CTGF, AP-1 og SP-1 promotoraktivitet i proksimale tubulære og interstitielle fibroblastceller

Dernæst undersøgte vi, om 6-BIO hæmmer promotoraktiviteterne af PAI-1, CTGF, AP-1 og SP-1 gener. Promotoraktiviteten af ​​PAI-1 og CTGF steg som respons på TGF, men blev reduceret ved 6-BIO-behandlingen (fig. 6A og B). Desuden var faldet bemærkelsesværdigt, når celler blev behandlet med 6-BIO alene end i nærvær af TGF. AP-1 og SP-1 binder til promotorerne af PAI-1 og CTGF. Fig. 6C og 6D viser promotoraktiviteten af ​​AP-1 og SP-1. AP-1 og SP-1 luciferaseaktivitet blev øget ved TGF-behandling og faldet med 6-BIO på en dosisafhængig måde. Fig. 6E viser ekspressionen af ​​transkriptionsfaktoren i nukleare proteinekstrakter. Vi bekræftede således, at den nukleare ekspression af PC-JUN, PC-FOS og SP-1 steg som reaktion på TGF-behandling og blev undertrykt af 6-BIO-behandling. Fig. 6F viser ændringen i proteinintensitet i forhold til kontrol. Derudover tyder vores resultater på, at 6-BIO virker på promotorens transkriptionsfaktorbindingssted for at svække bindingen af ​​AP-1 og SP-1. Vi udførte in vitro promotorbindingsassay i nærværelse af 6-BIO for at bekræfte det samme. Bindingen af ​​nukleare proteiner og PC-JUN, PC-FOS og SP-1 blev svækket ved tilsætning af 6-BIO på en koncentrationsafhængig måde (supplerende Fig. 3). Disse resultater indikerer, at 6-BIO hæmmer PAI-1- og CTGF-promoteraktiviteter samt AP-1- og SP-1-funktioner; således kan det have terapeutisk potentiale inyrefibrose.

4. Diskussion

Ved hjælp af rottemodellen af ​​UUO og TGF-behandletnyreproksimale tubuli afledte og interstitielle fibroblastcellelinjer, viste vi, at 6-BIO-behandling kan svækkesnyreskade. UUO-modellen er en repræsentativ dyremodel for obstruktiv nefropati, der er karakteriseret ved progressiv tubulointerstitielfibrose[43]. Histopatologisk analyse afnyrevæv opnået fra UUO-modellen viste, at ECM-akkumuleringen og tubulær atrofi i det interstitielle rum blev genoprettet ved 6-BIO-behandlingen. Derudover ved hjælp af TGF-behandletnyreproksimale tubuli-afledte og interstitielle fibroblastceller, viste vi, at 6-BIO-behandling kan svækkesnyreskade. I UUO-modellen og TGF-behandlede HK-2- og NRK49F-celler hæmmede 6-BIO ekspressionen afnyrefibrosemarkører samt MAPK ogSMADsignalveje. Derudover reducerede 6-BIO-behandling ekspressionen af ​​PC-JUN-, PC-FOS- og SP-1-proteiner induceret af UUO og TGF, såvel som nuklear ekspression og promotoraktivitet af AP{{6 }} og SP-1 i TGF- -behandlede HK-2- og NRK49F-celler. Hæmning af AP-1 og SP-1 transkriptionsfaktorer ved 6-BIO-behandling er blevet forbundet med hæmning af ECM-akkumulering, der fører til forværring afnyrefibrose. Dette opnås ved at undertrykke MAPK ogSMADsignalveje, der fører til en reduktion i ekspressionen af ​​PAI-1 og CTGF. Vores resultater tyder på, at 6-BIO kan være et potentielt terapeutisk middel modnyresygdomme, såvel som til forebyggelsenyreskader forårsaget af UUO og TGF .

Klik til økologisk Cistanche til nyresygdom

Det semisyntetiske cellegennemtrængelige indirubinderivat 6-BIO tilhører en bis-indol-familie og forekommer naturligt i spiselige gastropod-bløddyr og planter [12]. Indirubin indeholder en intramolekylær hydrogenbinding mellem 2-C-dobbeltbindingen O og N1-H-gruppen og en anden intermolekylær hydrogenbinding mellem molekylerne. 6-BIO har en kemisk modificeret struktur, hvor 6-positionen er substitueret med Br for at overvinde ulempen ved dårlige farmakokinetiske egenskaber på grund af indirubins lave vandopløselighed [44]. Mange indirubiner, på grund af kompetitiv binding til ATP, fungerer som dobbelte hæmmere af cyclin-afhængig kinase (CDK) og glycogensyntase kinase{{10}} (GSK-3), og udviser mere end {{ 12}}fold selektivitet over CDK5 [12]. Derudover udviser 6-BIO markant selektiv hæmning af GSK-3 med en IC50-værdi på 0,005 μM [12]. Ifølge rapporter fra flere grupper inhiberer 6-BIO fuldstændigt MCF-7-celleproliferation og blokerer migration med cirka 75 procent ved en koncentration på 10 μM og hæmmer phosphorylering af PDK1. Dette viste, at 6-BIO blev indsat i bindingslommen i PDK1 for at danne tre hydrogenbindinger med rester i hængselregionen, og bindingslommen rummede let de yderligere Br-atomer i 6-BIO [45]. Med disse egenskaber bliver 6-BIO undersøgt som et nyt lægemiddel til at regulere cellulære processer såsom aldringsrelateret inflammation, oxidativt stress, celleoverlevelse, proliferation og apoptose i cancer, diabetes og degenerative sygdomme [46,47 ]. Men undersøgelser om genregulering og molekylære mekanismer relateret tilnyrecellefibroseer knappe. Derfor søgte vi at undersøge, om 6-BIO var svækketnyrefibroseved at hæmme PAI-1- og CTGF-genregulering inyreceller, hvorved ECM-akkumulering reduceres.

Adskillige undersøgelser har brugt UUO-modellen til at rapportere en sammenhæng mellem ECM-akkumulering og kronisknyresygdom forårsaget af tubulær interstitielfibrose[43]. Desuden er overudtrykt PAI-1 og CTGF angiveligt forbundet med høj ECM-akkumulering under progressionen af ​​kroniskenyresygdom. Derfor er det vigtigt at identificere et terapeutisk molekyle, der hæmmer signalering og transskription af gener forbundet med øget ECM-akkumulering for effektivt at hæmmenyrefibrose. Derfor evaluerede vi i denne undersøgelse 6-BIO, en af ​​inhibitorerne af glycogensyntase kinase 3 (GSK-3), inyrefibrose.

Vi undersøgte effekten af ​​PAI-1 og CTGF-proteiner pånyrecellefibroseog bekræftede, at deres udtryk var reguleret af almindelige transkriptionsfaktorer, AP-1 og SP-1. Transkriptionsfaktoren, AP-1, er en heterodimer sammensat af proteiner, der tilhører JUN (C-JUN, JUNB og JUND), FOS (C-FOS, FOSB, Fra-1 og Fra{ {6}}), ATF (aktivering transkriptionsfaktor) og JDP (JUN dimerization protein) familie [48]. Det regulerer flere cellulære processer såsom celleproliferation, død,

differentiering og vaskularisering. En tidligere undersøgelse rapporterede, at AP-1 aktivitet øges i leveren og lungerne ved aktivering af type VI kollagen og fibroblaster [49,50]. De to hovedkomponenter af AP-1, C-JUN og C-FOS reagerer på en række forskellige stimuli, såsom cytokiner, vækstfaktorer og stress [51]. Vi observerede øget phosphorylering af C-JUN og C-FOS i en UUO-rottemodel og TGF-behandlede HK-2- og NRK49F-celler (fig. 2D og 4D). C-JUN og C-FOS danner heterodimerer og binder til AP-1-bindingsstedet i DNA og fungerer derved som transkriptionsfaktorer til at regulere ekspressionen af ​​andre gener. Derudover aktiverer phosphorylering af ERK1/2 og JNK henholdsvis C-FOS og C-JUN. I vores undersøgelse var phosphoryleringen af ​​ERK1/2 og JNK samt C-JUN og C-FOS i kernen bemærkelsesværdigt øget som respons på behandling med TGF. Men 6-BIO-behandling vendte disse virkninger markant. Vores undersøgelse viste, at 6-BIO effektivt hæmmede phosphoryleringen af ​​ERK1/2 og JNK og reducerede aktiviteten af ​​transkriptionsfaktor AP-1, og derved hæmmede phosphoryleringen af ​​C-JUN og C-FOS, som er dens nedstrøms effektorer. SP-1-hæmning i hepatiske astrocytter udøver enanti-fibrotiskeffekt [52]. En anden undersøgelse viste, at SP-1 spillede en vigtig rolle ifibrose[52,53]. Derfor vurderede vi, om 6-BIO kunne hæmme transkriptionsfaktoren SP-1. Vi observerede, at ekspressionen af ​​SP-1-protein steg som respons på TGF-behandling såvel som i UUO-modellen, hvorimod den faldt efter 6-BIO-behandling. Desuden blev den nukleare ekspression af SP-1 induceret af TGF undertrykt af 6-BIO-behandlingen. Som et resultat blev promotoraktiviteter for PAI-1 og CTGF, som har AP-1- og SP-1-bindingssteder, også reduceret ved behandling med 6-BIO (fig. 6) ). Derfor tyder disse fund på, at faldet i promotoraktivitet af PAI-1 og CTGF ved 6-BIO-behandling sænkede PAI-1- og CTGF-proteinekspressionen og mindskede ECM-akkumulering og derved reduceredenyrecellefibrose.

5. Konklusion

6-BIO-behandling reducerede PAI-1 og CTGF-ekspression i UUO-modellen og TGF-behandletnyreceller. Derudover 6-hæmmede BIO den TGF-inducerede aktivering afSMADog MAPK-signalering, mens de også hæmmer aktiviteterne af AP-1 og SP-1, to af de adskillige transkriptionsfaktorer, der binder til promotorerne af PAI-1- og CTGF-gener. Hæmning af AP-1 og SP-1 ser ud til at være en af ​​nøglemekanismerne, hvorved 6-BIO hæmmernyrefibrose. Vores resultater tyder således på, at 6-BIO kan være et potentielt terapeutisk middel modnyresygdomme.

CRediT forfatterskabsbidragserklæring

Jung Sun Park: Konceptualisering, Metodologi, Datakuration, Skrivning – forberedelse af originalt udkast, Skrivning – gennemgang og redigering, Visualisering, Finansieringsanskaffelse. I Ae Jung: Datakuration, skrivning − gennemgang og redigering. Hong Sang Choi: Datakuration, skrivning − anmeldelse og redigering. Dong-Hyun Kim: Metodik, datakuration. Hoon In Choi: Metodik, datakuration. Eun Hui Bae: Skrivning − anmeldelse og redigering, Supervision. Seong Kwon Ma: Skrivning − anmeldelse og redigering,

6. Referencer

Kilden er fra Jung Sun Park et al. på Biomedicine & Pharmacotherapy 145 (2022) 112402