Del 1|Glykogensyntasekinase 3b hyperaktivitet i eksfolierede urinceller forudsiger udvikling af diabetisk nyresygdom

Xianhui Liang, et al

1Blood Purification Center, Institute of Nephrology, det første tilknyttede hospital ved Zhengzhou University, Zhengzhou, Kina; 2 Medicinsk afdeling, afdelingen for nyresygdomme og hypertension, Rhode Island Hospital, Brown University School of Medicine, Providence, RhodeIsland, USA; og 3 Department of Medicine, Division of Nephrology, University of Toledo College of Medicine, Toledo, Ohio, USA

For mere information kontakt venligst:emily.li@wecistanche.com

Cistanche tubulosa forebygger nyresygdom, klik her for at få prøven

Voksende beviser peger på glykogensyntasekinase(GSK)3b som en nøglespiller i mangfoldighednyresygdomme. Men som en central transducer af insulinsignalvejen er GSK3bs rolle i diabetikere.nyre sygdomforbliver usikker. I DB/DB-mus var nyreekspression af total og aktiveret GSK3b i stigende grad forhøjet. Dette gik forud for udviklingen af ​​diabetikerenyre sygdomog korreleret med progressionen af ​​tegn pådiabetikernyreskade, herunder albuminuri og ekstracellulær matrixakkumulering i glomeruli og tubulointerstitial. In vitro inducerede eksponering af glomerulære podocytter, mesangiale celler og renale tubulære celler til et diabetisk miljø GSK3-booverekspression og hyperaktivitet, som synes væsentlige og tilstrækkelige til at fremkaldediabetikercellulære skader i nyreceller, fordi den cytopatiske virkning af det diabetiske miljø blev mildnet af GSK3b knockdown, men blev efterlignet af ektopisk ekspression af konstitutivt aktivt GSK3b selv i det normale miljø. Inkonsekvens, nyrebiopsiprøver udtaget fra patienter med forskellige stadier af diabetisk nefropati afslørede en forstærket ekspression af totalt og aktiveret GSK3b i glomeruli og nyretubuli, forbundet med sværhedsgraden af ​​diabetisk nefropati. I retrospektive kohorter af type 2-diabetespatienter, som blev fulgt i over fem år, repræsenterede den relative aktivitet af GSK3b i bankede urineksfolierede celler en uafhængig risikofaktor for udvikling eller progression af nyreinsufficiens. Desuden viste analyse af modtagerens karakteristiske kurve, at GSK3b-aktivitet i eksfolierede urinceller gav meget bedre kraft end albuminuri hos diabetiske patienter med progressiv nyrefunktion, der skelnede fra dem med stabil nyrefunktion. Således forstærkes nyreekspression og aktivitet af GSK3b i eksperimentel og klinisk diabetisk nefropati. Derfor kan GSK3b i urineksfolierede celler tjene som en ny biomarkør til at forudsige diabetikerenyresygdomprogression.

Diabetisk nyresygdom(DKD) er fortsat en førende årsag til nyresvigt i slutstadiet i USA og andre udviklede lande.1,2 Det er imidlertid ikke alle patienter med diabetes mellitus, der udvikler diabetisk nefropati (DN), som det fremgår af en række lang- term epidemiologiske opfølgningsundersøgelser.3 Årsagen til dette heterogene resultat er ikke fuldt ud forstået, men tilsyneladende multifaktoriel, der involverer forskellige årsagsfaktorer, herunder genetik, miljøer, allerede eksisterendenyresygdom, og sværhedsgraden af ​​diabetes.4,5 Dårlig glykæmisk kontrol har været en velkendt risikofaktor for albuminuri og DN. Ikke desto mindre udvikler en betydelig del af patienterne stadig DN trods stram glykæmisk kontrol.6 I klinisk praksis er det nødvendigt at anvende en følsom og præcis biomarkør til stratificering af diabetespatienter med risiko for at udvikle sig til nedsat nyrefunktion. Albuminuri har i årevis været betragtet som en surrogatmarkør for diabetiske nyrekomplikationer.7,8 Ikke desto mindre tyder en voksende mængde af beviser på, at albuminuri muligvis ikke er nøjagtig.9,10 En signifikant uoverensstemmelse mellem albuminuri og nedsat nyrefunktion i DN er blevet bemærket. 11,12 Ifølge data fra Det Forenede Kongerige Prospective Diabetes Study13 af de patienter, der udviklede nyrefunktion, havde 61 procent ikke albuminuri på forhånd, og 39 procent udviklede aldrig albuminuri under undersøgelsen. Ligeledes udviklede kun 24 procent af de patienter, der udviklede albuminuri, efterfølgende nedsat nyrefunktion under undersøgelsen. Med andre ord, for patienter med mikroalbuminuri eller makroalbuminuri udvikler det fremherskende flertal muligvis ikke nyreinsufficiens. Disse data udfordrer således det klassiske paradigme af albuminuri, der altid går forud for nyreinsufficiens under progressionen af ​​DKD. Som sådan er det bydende nødvendigt at identificere nye biomarkører.

til forudsigelse af DN eller til tidlig diagnose af DN. I det seneste årti er en række nye molekyler blevet testet.14-16 Blandt disse er glykogensyntasekinase 3 (GSK3) dukket op som en attraktiv kandidat. GSK3 er en meget konserveret, allestedsnærværende udtrykt serin/threonin-proteinkinase, der oprindeligt blev karakteriseret til at være en nøgletransducer af insulinsignaleringskaskaden og styrer glykogenese. Interessen for GSK3 steg meget med erkendelsen af, at den også fungerer som et konvergenspunkt for flere cellesignalveje involveret ibetændelse, immunmodulering, embryogenese, vævsskade, reparation og regenerering.17-19 GSK3 eksisterer som 2 isoformer: GSK3a og GSK3b. I forskellige organvæv udtrykkes de 2 isoformer forskelligt. I nyrebarken er b-isoformen overvejende udtrykt og lokaliseret til glomeruli og proksimale tubulære celler.20,21 Renal GSK3b-overaktivitet er blevet forbundet med en bred vifte af nyresygdomme, herunder proteinuriske Glo-neuropatier og progressiv kronisk nyresygdom.22 Ikke desto mindre , som en nøgletransducer af insulinsignalvejen, er GSK3bs rolle i patogenesen af ​​DN endnu ukendt. Det mangler at blive afgrænset, om GSK3b-dysregulering i nyren er involveret i DN. For at løse dette problem undersøgte denne undersøgelse ekspressionsprofilerne for total og aktiveret GSK3b i nyreprøver udtaget fra dB/dB murine modeller af ikke-insulinafhængig DN og i nyrebiopsivæv fra patienter med forskellige stadier af type 2 DN. I retrospektive kohorter af patienter med type 2-diabetes blev ekspressionsniveauerne af total og aktiveret GSK3b desuden målt i eksfolierede urinceller, som blev udtaget som en urinbaseret flydende nyrebiopsi. Vi undersøgte forholdet mellem ekspressionsniveauerne af GSK3b eller dets aktiverede form i baseline urineksfolierede celler og udviklingen eller progressionen af ​​nedsat nyrefunktion hos diabetespatienter.

RESULTATER

GSK3b er overudtrykt og hyperaktiv i renale parenkymceller i db/db mus, forbundet med progression af albuminuri og diabetisk nyreskade

db/db mus med leptinreceptormangel er veletablerede modeller for type 2 diabetes mellitus og DN. Fra 10 ugers alderen udvikler db/db mus spontant tidlige tegn pånyreskader, karakteriseret ved progressiv albuminuri og matrixakkumulering i glomeruli.23 I modsætning hertil har aldersmatchede kontrolmus (db/m) normal glykæmi og ingen mærkbare tegn pånyre sygdom. I et eksperiment, der startede ved 10 ugers alderen, blev nyreekspression af total (figur 1) og aktiveret (figur 2) GSK3b (phosphoryleret ved Y216 [p-GSK3B]) i db/db mus i forhold til kontrol db/m mus progressivt forhøjet ( figur 1b og 2b). Dette var hovedsageligt lokaliseret til podocytter og mesangiale celler i glomeruli (figur 1a) og til tubulære epitelceller i tubulointerstitial (figur 2a), som vist ved immunhistokemi farvning. De morfologiske fund blev bekræftet ved immunoblotanalyse af helnyrehomogenater (figur 1c og 2c). Regressionsanalyse viste, at farvningsintensiteten af ​​total (figur 1d) og aktiveret (figur 2d) GSK3b i glomeruli positivt korrelerede med urinudskillelsen af ​​albuminuri i db/db mus i forskellige aldre. Selv på det tidlige stadium af diabetes hos db/db-mus, såsom ved 10 eller 14 ugers alderen, var aktiviteten af ​​GSK3b markant forhøjet i nyrerne, som afspejlet af en signifikant induktion af p-GSK3b (figur 2). Det ser ud til, at GSK3b-hyperaktivitet i nyrerne hos db/db-mus på det tidlige stadie i høj grad skyldtes post-translationelle modifikationer, såsom phosphorylering ved Y216, men i et senere stadium skyldtes det hovedsageligt øget ekspression af total GSK3b.

Progressionen af ​​DN viser stigende akkumulering af den ekstracellulære matrix i både glomeruli og interstitiel. Faktisk, som vist ved FL-fluorescerende immunhistokemi-farvning, viste db/db musenyrer progressivt øget ekspression af fibronectin i både glomeruli og interstitiel (figur 3a). Dette blev yderligere bekræftet ved immunoblotanalyse af nyrehomogenater for fibronectin og kollagen IV (figur 3b og c). Desuden korrelerede ekspression af total og aktiveret GSK3b positivt med den for fibronectin inyrevæv(Figur 3d).

For yderligere at bestemme, om forbedret GSK3b-aktivering går forud for udviklingen af ​​DKD, blev db/db og db/m mus fulgt op i et separat eksperiment, der startede ved 4 ugers alderen i prædiabetesstadiet. I uge 7 udviste db/db-mus tydelig hyperglykæmi (Supplerende Figur S1A), hvilket tyder på diabetes, men ingen tegn på DKD, som vist ved normal albuminuri (Supplerende Figur S1B). Det skal bemærkes, at selv i et så tidligt stadium af diabetes var nyreekspression af GSK3b og p-GSK3b såvel som den relative aktivitet af GSK3b udtrykt som p-GSK3b/GSK3b-forhold steget variabelt, målt ved immunoblotanalyse af nyrebiopsivæv efterfulgt af densitometri (Supplerende figur S1C og D). Derudover viste lineær regressionsanalyse, at renal GSK3b-aktivitet i uge 7 var positivt korreleret med udviklingen af ​​albuminuri og DKD i uge 13 (Supplerende figur S1E). Desuden viste receiver operation characteristic (ROC) kurveanalyse, at nyre GSK3b aktivitet i db/db mus ved 7 ugers alderen, når der ikke var tegn på DKD, gav fremragende nøjagtighed og kraft til at forudsige udviklingen af ​​albuminuri og DKD (Supplerende figur). S1F).

Eksponering af nyreceller for et diabetisk miljø forårsager overekspression og hyperaktivitet af GSK3b, hvilket resulterer i diabetiske cytopatiske ændringer

For at bestemme, om diabetisk tilstand direkte øger GSK3b-aktivering inyreceller, blev in vitro-kulturer af forskellige nyrecellelinjer, herunder murine podocytter, mesangiale celler og tubulære epitelceller, brugt og udsat for et diabetisk miljø, der består af høj omgivende glucose og transformerende vækstfaktor (TGF) b1. Eksponering af podocytter for det diabetiske miljø resulterede i slående podocytskade, præget af et tab af podocytmarkørproteinet synaptopodin. Dette var samtidig leje med fremtrædende induktion af total og aktiveret GSK3b, som vist ved FL-fluorescerende immuncytokemi-farvning (figur 4a og b) og bekræftet ved immunblotanalyse

(Figur 4c og d). I dyrkede mesangiale celler blev ekspression af total (figur 5a) og aktiveret (figur 5b) GSK3b ligeledes forøget efter eksponering for det diabetiske miljø, parallelt med øget ekspression af ekstracellulære matrixmolekyler såsom fibronectin (figur 5). Tilsvarende overudtrykte dyrkede renale tubulære epitelceller totalt og aktiveret GSK3b efter diabetisk miljøbehandling, og dette blev ledsaget af tubulær celledysfunktion og dedifferentiering, præget af formindsket og forstyrret ekspression af epiteliale tight junction molekyler såsom zonula occludens -1 -1) (Figur 6a–d). I modsætning hertil resulterede mannitolbehandling af alle nyreceller, som en osmolalitetskontrol, i en virkning, der ikke var forskellig fra hvilken, blev formidlet af det normale miljø indeholdende normal omgivende glucose. Menneskelig diabetes involverer ikke kun hyperglykæmi, men også insulinresistens. Selvom det er umuligt fuldstændigt at adskille hyperglykæmi fra insulinresistens i dyremodeller eller hos patienter, er in vitro-modeller blevet udnyttet til at undersøge den isolerede effekt af høj glucose versus insulinresistens. For at efterligne tilstanden af ​​insulinresistens blev b-isoformen af ​​insulinreceptoren slået ned i dyrkede podocytter, mesangiale celler og renale tubulære celler (Supplerende figur S2A-C), og dette forstærkede ekspressionen og aktiviteten af ​​GSK3b selv i de normale miljø, som vist ved immunoblotanalyse og densitometri. Denne virkning blev forstærket efter eksponering for det diabetiske miljø, hvilket angiver en synergistisk effekt af insulinresistens og høj glucose på aktivering af GSK3b.

GSK3b-hyperaktivitet er essentiel og tilstrækkelig til nyrecelleskade og dysfunktion fremkaldt af det diabetiske miljø

For at undersøge, om GSK3b-hyperaktivitet er involveret i cytopatiske ændringer i nyreceller, skal GSK3b-aktivitet idyrket nyreceller blev kunstigt manipuleret ved RNA-interferens

(RNAi) eller genoverekspression. Som vist i figur 7a påvirker RNAi, der anvender små, interfererende RNA, knap den cytopatiske virkning af det diabetiske miljø i alle nyreceller. I modsætning hertil ophævede GSK3b-silencing væsentligt den diabetiske miljø-anstiftede synaptopodin-undertrykkelse i podocytter, fibronectin-induktion i mesangiale celler og ZO-1-afbrydelse i renale tubulære celler, hvilket tyder på, at GSK3b sandsynligvis er afgørende for at udløse diabetes-relaterede cytopatiske ændringer i nyreceller. For at skelne om GSK3b-overekspression og hyperaktivitet er tilstrækkelige til de cytopatiske virkninger induceret af det diabetiske miljø, blev celler forbigående transficeret med enten en tom vektor eller en vektor, der koder for den konstitutivt aktive mutant af GSK3b (S9A). Selvom tom vektortransfektion næsten ikke udøvede nogen virkning, resulterede ektopisk overekspression af S9A i tab af synaptopodin-ekspression i podocytter, forhøjet fibronectinproduktion i mesangiale celler og reduceret ZO-1-ekspression i renale tubulære celler, selv i det normale miljø (figur 7b), der minder om den cytopatiske virkning af det diabetiske miljø.

Progression af humant DN falder sammen med GSK3b overekspression og hyperaktivitet i renale glomeruli og tubuli

For yderligere at validere, om ovenstående fund i dyre- og cellekulturmodeller også er anvendelige til klinisk DN, blev arkiveret nyrebiopsivæv fra normale forsøgspersoner og patienter med forskellige stadier af DN behandlet til peroxidase-immunhistokemi-farvning for GSK3b og p-GSK3b. Karakteristikaene for kontrolpersoner og patienter er opsummeret i supplerende tabel S1. Som vist i figur 8a, renal

ekspression af total og aktiveret GSK3b blev i stigende grad forøget sammen med DN-progression som klassificeret i henhold til den patologiske klassifikation baseret på periodic acid-Schiff-farvning. Dette er i overensstemmelse med Nephroseq-dataene, som også viser en signifikant øget GSK3b-ekspression i nyrebiopsivæv fra patienter med DN (Supplerende figur S3). Den øgede ekspression af totalt og aktiveret GSK3b var overvejende lokaliseret til podocytter og mesangiale celler i glomeruli og til renale tubulære epitelceller i tubulointerstitial (figur 8a), i overensstemmelse med resultaterne i db/db mus. De morfologiske resultater blev yderligere bekræftet af computeriseret morfometrisk analyse, som afslørede en positiv sammenhæng mellem ekspressionsniveauerne af total (figur 8b) eller aktiveret (figur 8c) GSK3b og sværhedsgraden af ​​DN.

GSK3b er hyperaktivt i urineksfolierede celler indsamlet fra diabetespatienter og forudsiger udviklingen af ​​nyreinsufficiens Under både fysiologiske og sygdomstilstande sker omsætning og udskillelse af nyreepitelceller, såsom glomerulære podocytter og tubulære epitelceller, konstant, hvilket fører til kontinuerlig udskillelse af renale parenkymceller i urinen. Urineksfolierede celler er med succes blevet udnyttet som urinbaseret ikke-invasiv flydende nyrebiopsi til forsknings- og diagnostiske formål.24,25 Forudsat de førnævnte resultater, at ekspression af total og aktiveret GSK3b er øget i nyreparenkymceller hos patienter med DN og i DB/DB mus selv på det tidlige stadie før albuminuri manifesterede sig, spekulerede vi på, om måling af GSK3b i urineksfolierede celler kunne udnyttes til at forudsige

udvikling eller progression af menneskelig DKD. Til dette formål brugte vi biobanken for diabetes og gennemførte et retrospektivt kohortestudie. I alt blev 127 patienter med type 2-diabetes mellitus, som var blevet fulgt op på det første tilknyttede hospital ved Zhengzhou University siden 2010 med opsamlede prøver af fraktioneret urin, screenet for inklusion i denne undersøgelse. Af disse patienter blev 67 udelukket, hvor 10 mistede til opfølgning, 52 havde nyresvigt eller åbenlys proteinuri ved sygdomsstart, og 5 blev senere diagnosticeret som andre nyresygdomme ved nyrebiopsi eller billeddiagnostik. I sidste ende blev 60 patienter inkluderet i denne retrospektive kohorteundersøgelse (figur 9). De demografiske og kliniske karakteristika for disse patienter ved baseline er opsummeret i tabel 1. Ingen af ​​patienterne havde nyredysfunktion eller åbenlys proteinuri ved baseline, og ingen påbegyndte dialysebehandling i opfølgningsperioden. I henhold til omfanget af albuminuri blev patienterne kategoriseret i 2 undergrupper: normoalbuminuri og mikroalbuminuri grupper. Bortset fra urinalalbuminudskillelsesniveauer (UAE) var de 2 undergrupper af patienter ikke statistisk forskellige ved baseline i alle andre kliniske, biokemiske og fysiologiske parametre, inklusive diabetesvarighed, glykeret hæmoglobinniveau, nyrefunktion, blodtryk og ordinerede behandlinger . Efter 5 års opfølgning påviste 29 af de 60 patienter progressionen af ​​nedsat nyrefunktion, hvilket blev defineret som enten en reduktion på 25 procent i estimeret glomerulær filtrationshastighed (eGFR) eller progression af albuminuristatus som indikeret af eskaleringen af ​​sværhedsgraden af albuminuri langs forskellige kliniske stadier af DN, det vil sige normoalbuminuri, mikroalbuminuri, mikroalbuminuri eller åbenlys proteinuri. I modsætning hertil udviste de resterende 31 patienter ingen tegn på nyresygdomsprogression (figur 9). Patienternes baselinedata blev stratificeret i henhold til progressionsstatus for nyreinsufficiens efter 5 års opfølgning (tabel 2). Patienter med progression af nedsat nyrefunktion sammenlignet med patienter uden progression udviste en signifikant reduktion i eGFR og en markant stigning i UAE. For at bestemme om GSK3b var overudtrykt eller overaktiveret i nyreceller og

målt for at evaluere sensitiviteten og specificiteten af ​​GSK3b-aktivitet i eksfolierede urinceller i forhold til baseline-albuminuri for at forudsige udviklingen af ​​nedsat nyrefunktion. Som vist i figur 11 viste den relative aktivitet af GSK3b i urineksfolierede celler, udtrykt som p-GSK3b/GSK3b-forhold, fremragende nøjagtighed og kraft til at skelne patienter med progressiv nyreinsufficiens fra dem med stabil nyrefunktion, med området under ROC. kurven er 0.844 (95 procent konfidensinterval, 0.747–0.941; P ¼ 0.001 ), hvilket var meget bedre end arealet under ROC-kurven for baseline Ln(UAE) ({{20}}.750; 95 procent konfidensinterval, 0,626-0,874). Cutoff, der maksimerede Youdens indeks, var 1,24 for p-GSK3b/GSK3b-forholdet og 76 mg/24 timer for UAE. Ved disse cutoffs var sensitiviteten og specificiteten 69 procent og 87,1 procent for p-GSK3b/GSK3b-forholdet og 69 procent og 77,4 procent for Ln(UAE). Desuden forbedrede kombinationen af ​​p-GSK3b/GSK3b-forholdet med det totale GSK3b-niveau i urineksfolierede celler signifikant den diskriminerende kraft, hvor arealet under ROC-kurven var 0,971 (95 procent konfidensinterval, 0,931-1.{{48} }). Disse resultater tyder på, at målinger af GSK3b-aktivitet i eksfolierede urinceller kan give meget bedre nøjagtighed end UAE til at forudsige udviklingen af ​​nedsat nyrefunktion hos diabetespatienter.

To further explore whether enhanced GSK3b activation also predicts the development of DKD, a separate cohort of patients with type 2 diabetes but no signs of kidney disease, who started follow-up between 2010 and 2013, were retrospectively screened and examined (Supplementary Table S2). The baseline characteristics of patients were stratified according to the presence or absence of renal impairment or DKD after 5 years' follow-up (Supplementary Table S3), which was defined as either a $25% reduction in eGFR or the persistent presence of albuminuria (>30 mg/24 timer). Urineksfolierede celler, der var samlet ved baseline, blev hentet og undersøgt ved immunoblotanalyse for GSK3b og p-GSK3b (Supplerende figur S4A og B). Aktiviteten af ​​GSK3b blev estimeret af de densitometriske forhold mellem p-GSK3b og total GSK3b for hver prøve i forhold til værdien af ​​kontrolprøver (Supplerende figur S4C).

Blandt forskellige kliniske/biokemiske variabler blev GSK3b-aktivitet (p-GSK3b/GSK3b-forhold) i baseline urineksfolierede celler bemærket at være signifikant højere hos patienter, der udviklede DKD, end hos dem, der ikke gjorde det (Supplerende tabel S3). Desuden tyder ROC-kurveanalyse på, at den relative aktivitet af GSK3b (p-GSK3b/GSK3b-forhold) i urineksfolierede celler gav fremragende nøjagtighed og kraft til at forudsige udviklingen af ​​DKD hos diabetespatienter i tidlige stadier (Supplerende figur S4D).