CD73-overekspression i podocytter: en ny markør for podocytskade ved human nyresygdom
Feb 26, 2022
Abstrakt:CD73-vejen er en vigtig anti-inflammatorisk mekanisme i forskellige sygdomsmiljøer. Observationer i musemodeller antydede, at CD73 kunne have en beskyttende rolle inyreskade; dog intet direkte bevis for dets rolle i mennesketnyre sygdomer blevet beskrevet til dato. Her antog vi, at podocytskade hos menneskernyresygdommeændrer CD73-ekspression, der kan lette diagnosticeringen af podocytopatier. Vi vurderede ekspressionen af CD73 og et af dets funktionelt vigtige mål, CC-kemokinreceptoren type 2 (CCR2), i podocytter franyrebiopsier af 39 patienter med podocytopati (herunder focal segmental glomerulosclerosis (FSGS), minimal change disease (MCD), membranøs glomerulonephritis (MGN) og amyloidose) og en kontrolgruppe. Podocyt CD73-ekspression i hver af sygdomsgrupperne var signifikant øget sammenlignet med kontroller (p < 0.0{{10}}1–p="">< 0,0001).="" desuden="" var="" der="" en="" markant="" negativ="" korrelation="" mellem="" cd73-="" og="" ccr2-ekspression,="" som="" bekræftet="" af="" immunhistokemi="" og="" immunfluorescens="" (pearson="" r="-" 0,5068,="" p="0.0031;" pearson="" r="-" 0,4705,="" henholdsvis="" p="0.0313)," hvilket="" tyder="" på="" en="" beskyttende="" rolle="" for="" cd73="">nyreskade.Endelig identificerer vi CD73 som en ny potentiel diagnostisk markør for humane podocytopatier, især af MCD, der har været berygtet for manglen på patologiske træk, der kan genkendes af lysmikroskopi og immunhistokemi.
Nøgleord:podocyt; minimal forandring sygdom; CD73; CCR2;nyreskade;Nyresvigt
Introduktion
Den evolutionære afgørende rolle for adenosintrifosfat (ATP) som den allestedsnærværende intracellulære energikilde er blevet opdateret for mere end tre årtier siden med en revolutionerende forestilling om, at medlemmerne af det purinerge system (ATP, adenosindi- og trifosfat (henholdsvis ADP og AMP)) kan lige så godt levere ekstracellulære signaler til at mediere cellulære interaktioner [1, 2]. Dette koncept førte til forståelsen af, at det purinerge system deltager i udformningen af immunresponser via modulering af receptorekspressionsprofil, cytokinsekretion, produktion af reaktive oxygenarter (ROS) og intracellulær patogenfordøjelse [3-7] Ekstracellulær ATP gennemgår omdannelse/dephosphorylering til ADP og AMP via CD39 (ecto-nucleosidtriphosphat diphosphohydrolase 1) og endelig nedbrydes AMP til adenosin af CD73 (ecto-5 0 8 nucleotidase) CD73 kan være til stede i membranbundet eller opløselig form Membranformen har en dimer-struktur bestående af to identiske 70 kD underenheder, der binder til plasmamembranen via en forbindelse mellem C-terminal serin og glycosylphosphatidylinositol (GPI) [9]. Bemærkelsesværdigt synes CD39-substraterne ATP og ADP at være kompetitive hæmmere af CD73 [9-11]. CD73-ekspression repræsenterer således den kritiske vej til tuning af adenosinniveau i ekstracellulært rum. CD73 er ikke et celle- eller organspecifikt molekyle; dets ekspression på leukocytter, endotel, epitelceller eller mesenkymale celler fra forskellige organer (nyre, lunge, lever, tyktarm, hjerne og hjerte) og stamceller er blevet veldokumenteret [12-14]. En beskyttende rolle for adenosin via nitrogenoxid (NO)-syntesevejen i en leveriskæmi-induceret skade blev først rapporteret af Peralta et al. [15]. I overensstemmelse med disse data har dets virkning vist sig at lindre akut lungeskade, allograft-luftvejsafstødning, akut graft-versus-host-sygdom og sepsis [4,16-19].
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRESVIGT
Som overbevisende demonstreret i flere musemodeller, kan CD73 deltage i tubulo-glomerulær interaktion inyre. CD73-medieret generering af adenosin afledt af CD73 fra ATP af tubulær oprindelse under iskæmi-reperfusionsskade har vist sig at dæmpe inflammationen via hæmning af neutrofilernes effektorfunktion [20]. Desuden viser mus med CD73-mangel autoimmun inflammation, der er ledsaget af reduceret antal podocytter og endotelfenestrationer [21]. Dette fænomen var forbundet med øgede serumniveauer af pro-inflammatoriske cytokiner som tumornekrosefaktor (TNF)-alfa eller kemokin CXC-motivligand 2 (CXCL-2). I omgivelserne af mennesketnyre sygdom,det er blevet postuleret, at podocytskader sandsynligvis repræsenterer en blanding af adaptive og destruktive mekanismer for cellulær respons på patologiske stimuli, hvilket ikke nødvendigvis afspejler publicerede observationer fra in vitro- eller dyremodeller. Ætiologien af podocytskade varierer fra mekanisk stress (glomerulær hyperfiltration), oxidativ stress (som ved hypertensiv eller diabetisk nefropati, toksisk skade, inflammatorisk celleinfiltration eller dyremodeller med minimal forandringssygdom) til immunologisk stress (dvs. immunkompleks og komplementmedieret skade) under glomerulonefritis) [22]. Den inflammatoriske indstilling af glomerulonephritis kan stimulere podocytter til at syntetisere forskellige cytokiner, potentielt via CC-kemokinreceptor 2 (CCR2)-medieret signalering. Alligevel er lidt kendt om CD73's rolle i menneskernyre sygdom, især i forbindelse med kronisk inflammation og podocytskade.
I denne undersøgelse antog vi, at CD73 spiller en rolle i patogenesen af humane glomerulære sygdomme og analyserede podocyt CD73-ekspression hos menneskernyrebiopsier fra patienter med podocytopati-relaterede patologier. Vi demonstrerer, at podocytoverfladeekspression af CD73 er en pålidelig markør for podocytbeskadigelse, hvilket i særdeleshed understøtter den diagnostiske værdi af CD73 i minimal forandringssygdom (MCD). Desuden rapporterer vi en negativ korrelation mellem podocyt CCR2 og CD73 ekspression, hvilket tyder på, at overekspression af CD73 repræsenterer et adaptivt respons på glomerulær læsion.
Resultater
Kliniske data og ultrastrukturel billeddannelse af podocytskaderTabel 1 skitserer den kliniske præsentation af tilfælde inkluderet i undersøgelsen vedrørende alder, køn, kreatinin og total proteinuri værdier. Alle FSGS-patienter havde en primær NOS-form (ikke andet specificeret). Blandt 12 MGN-patienter var 5 phospholipase A2-receptor (PLA2R)-positive (42 procent). I amyloidosegruppen havde 2 patienter AA-amyloidose (16,7 procent) og 10 AL-amyloidose (83,3 procent); hos 2 patienter med AL-amyloidose var let kæde kappa tydelig (20 procent), og 8 var positive for lambda (80 procent af AL-amyloidose-gruppen). Hos alle patienter med MCD, FSGS, MGN og amyloidose blev podocytskader tydeligt påvist ved elektronmikroskopi (figur 1).
Figur 1. Ultrastrukturelt billede af primær og sekundær podocytskade. (a) Spredning af podocytlegeme på glomerulær basalmembran (pil) med tilbagetrækning af fodprocesser i tilfælde af MCD. (b) Omfattende udslettelse af podocytfodprocessen (pil) og cytoplasmatisk vakuolisering (stjerne) hos en patient med primær FSGS. (c) Udslettelse af fodprocessen (pil), vakuolisering og fremtrædende organeller (dobbeltpil) med underliggende epimembranøst elektrontæt materiale (stjerne) ved primær membranøs glomerulonefritis. ( d ) Subepitelial akkumulering af amyloid-fibriller (to-hovedet pil) med på hinanden følgende podocytløsning (som tegn på irreversibel podocytskade) hos en patient med AL-amyloidose (lambda). Alle elektronmikrofotografier præsenteres med 4000 × forstørrelse. Indsatser – tilsvarende lysmikroskopi-mikrofotografier (40 × /0,65 NA; skala stangstørrelse: 50 µm in (a,c,d) og 100 µm in (b); PAS-farvning).
Overfladeekspression af CD73 er forbundet med podocytskade ved human nyresygdom
For at udforske, om podocytter udtrykker CD73 i de fysiologiske omgivelser og for at evaluere mønstret af CD73-ligegyldige sygdomsindstillinger relateret til topodocytskade, udførte vi immunhistokemisk analyse af CD73-ekspression. Ultrastrukturel analyse bekræftede podocytbeskadigelse som cytoskeletal uregelmæssighed med mindst fodprocesudslettelse (figur 1). I vores negative kontrolgruppe uden podocytlæsion kunne ingen signifikant podocytekspression af CD73 påvises på trods af positiviteten af en intern kontrol (peritubulære kapillærer), der typisk farves positivt (figur 2). På den anden side viste podocytskadegrupper (MCD, FSGS, MGN og amyloidose) en statistisk meget signifikant opregulering af podocyt CD73 (p < 0.{{1{{20}}}}="" 001);="" den="" signifikante="" stigning="" var="" også="" konsistent="" ved="" sammenligning="" af="" enkelte="" enheder="" med="" negative="" kontroller="" (p="" mindst="">< 0,001).="" interessant="" nok="" havde="" omfanget="" af="" cd73-opregulering="" en="" tendens="" til="" at="" være="" lavere="" i="" mcd-gruppen,="" omend="" kun="" signifikant="" lavere="" i="" sammenligning="" med="" mgn-prøver="" (p="0.0043)" (figur="" 2).="" i="" podocytskadegrupper="" var="" der="" ingen="" sammenhæng="" mellem="" semikvantitativ="" cd73-score="" og="" proteinuri="" på="" binært="" (nefrotisk/ikke-nefrotisk)="" eller="" kvantitativt="" (g/24="" timer)="" niveau="" (spearman="" r="−" 0,0807,="" p="0" .6302="" og="" spearman="" r="−" 0,076,="" henholdsvis="" p="0.6497;" figur="" 3a).="" samlet="" set="" var="" der="" ingen="" sammenhæng="" mellem="" cd73-score="" og="" kreatininniveau="" (spearman="" r="0.0722," p="0.6259;" figur="" 3b).="" derudover="" kunne="" vi="" ikke="" påvise="" signifikant="" korrelation="" mellem="" cd73-ekspression="" og="" hypertension="" (spearman="" r="−" 0,03024,="" p="0.8384)" eller="" diabetes="" mellitus="" (spearman="" r="−" 0,1784,="" p="" {{45="">
Opregulering af podocyt-afledt CD73 i human glomerulær sygdom korrelerer negativt med ekspression af CCR2-receptoren og korrelerer ikke med nefrin- og podocinekspressionVed at værdsætte offentliggjorte data om nedregulering af makrofag CCR2-ekspression efter CD73-overekspression i en stamcellemodel, antog vi, at opregulering af CD73 under podocytskade omvendt korrelerer med ekspression af pro-inflammatorisk CCR2 og udførte immunhistokemisk CCR2-analyse. I kontrolgruppen kunne ingen eller kun mild ekspression af CCR2 påvises uden en signifikant uoverensstemmelse i sammenligning med CD73-signaturen i de samme prøver. I modsætning hertil kunne for det meste signifikant opregulering af overflade-CCR2 (endnu af forskellig intensitet) ses i størstedelen af prøver fra podocyt-beskadigede biopsier og var generelt opreguleret i sammenligning med kontrolgruppen (p=0.0206; Supplerende figur S1). Sygdomsgrupperne adskilte sig ikke væsentligt fra hinanden i denne henseende.
Vi analyserede yderligere en potentiel korrelation mellem ekspressionsintensiteter af CD73 og CCR2. Ved sammenligning af CD73- og CCR2-score fra podocyt-skadebiopsi-kohorten kunne der faktisk observeres en markant negativ korrelation (Spearman r=− 0.4821, s=0.{{18} }052), (figur 4). Det skal bemærkes, at glomeruli med CD73-positive podocytter havde en tendens til at vise reduceret CCR2-ekspression ikke kun i podocytter, men også i omgivende celler, som parietale epitelceller (figur 4). Den omvendte korrelation blev bekræftet ved evaluering af immunofluorescerende co-farvning for CD73/CCR2 i beskadigede podocytter ved konfokal mikroskopi (Spearman r=- 0,4478, p=0.0282), (figur 5). For at adressere eventuel sammenhæng mellem CD73-positivitet og (tab af) podocyt-specifik proteinekspression udførte vi yderligere immunofluo-rescent-farvninger for nephrin og podocin og evaluerede deres ekspressionsmønster i kontrol-, MCD- og FSGS-grupper (figur 6a) samt co-farvning med CD73 i prøver med podocytlæsion (figur 6b-e). Vi kunne ikke påvise signifikant korrelation mellem gennemsnitlig fluorescensintensitet af podocin- eller nefrinekspression på den ene side og gennemsnitlig ekspression af CD73 på den anden (n=39, Spearman r=0.212, p {{33} }.1948 for podocin og n=60, Spearman r=0.01906, s.=0.8851 for nefrin).
Diskussion
Vi beskriver her for første gang ekspressionen af CD73 på overfladen af beskadigede podocytter hos menneskernyresygdom. Analyserernyrebiopsier fra patienter med fremtrædende podocytskader såsom i MCD, FSGS, MGN og amyloidose, rapporterer vi signifikant opregulering af podocyt CD73-ekspression i hver af disse grupper i sammenligning med kontrolnyrer,uafhængig af ætiologien af podocytskaden. Desuden rapporterer vi en omvendt korrelation mellem CD73- og CCR2-ekspression af podocytter af podocyt-skadegrupper. Boosted podocyt-specifik CCR2 har vist sig at mediere diabetikerenyreskadehos mus [23]. Derudover er blokade af CCR2 i en Adriamycin-induceret murin model af FSGS blevet rapporteret at reducere proteinuri og glomerulær skade [24]. En nylig undersøgelse fra Lee et al. - også ved hjælp af en musemodel - indikerer, at CCR2-udtømning kan forbedre fedme-induceret albuminuri via blokade af oxidativt stress og lipidakkumulering [25]. I et in vitro-system, der anvender mesenkymale stamceller (MSC) fra murint perikardielt væv, er det blevet vist, at CD73-overudtrykkende MSC'er dikterer reparative processer via anti-inflammatorisk aktivitet, blandt andre faktorer også på grund af inhibering af CCR{ {9}}positiv makrofaginfiltration [13]. Derfor er det i lyset af vores resultater og offentliggjorte data fristende at postulere, at CD73-ekspression af podocytter kan virke beskyttende inyreskade, muligvis via veje, der dæmper CCR2. CCR2-signalering er tæt forbundet med makrofagadhæsion og aktivering [26, 27]. Da makrofager kan påvirke patogenesen af podocytopati-associeretnyresygdomme(som primær MGN, hvor infiltration af CD68 plus, CCR2 plus makrofager er blevet anerkendt som en signifikant indikator for slutstadietNyresvigt[28]), yderligere undersøgelser af sammenhæng mellem monocyt-/makrofagerindhold, oprindelse (infiltrerende vs. resident), aktiveringsprofiler (M1-proinflammatorisk vs. M2-alternativt aktiveret) og CD73-ekspression hos menneskernyre sygdomer nødvendige for at kontrollere overensstemmelsen mellem vores resultater med tidligere data fra murine modeller.
I en inflammatorisk mikromilieu, der kan ses ved hypoxi, iskæmi-reperfusion eller autoimmun vævsskade, frigiver flere celler medlemmer af det purinerge signalsystem, overvejende i form af pro-inflammatorisk ATP eller ADP [29, 30]. I disse indstillinger er ekto-nukleotidase CD73 og dets produktadenosin vigtige faktorer i immunresponsregulering og lyddæmpning. I dyremodeller har CD73 vist sig at være beskyttende inyreiskæmisk reperfusionsskade og dens mangel inducerede podocytdysfunktion, hvilket førte til autoimmun inflammation ognyre sygdom[21, 31]. Andre muse-in vivo-eksperimenter med iskæmisk reperfusionsskade afslørede den vigtige anti-inflammatoriske indflydelse af CD73 udtrykt af proksimale tubulære epitelceller og dets afgørende virkning inyrebeskyttelse under diabetisk nefropati via adenosin-endotel Adora2b-receptorsignalering [20,32]. Podocytopatier er den hyppigste gruppe af glomerulære læsioner, der fører til proteinuri. MCD, en prototype 'primær' podocytopati, er den hyppigste årsag til nefrotisk proteinuri hos børn > 1 år [33, 34]. Aktuelle hypoteser om patogenese af MCD antyder en signifikant rolle af cytokiner og andre immunmediatorer i forstyrrelse af podocyt-glomerulære basalmembranintegritet [35-38]. Uoverensstemmelse mellem fravær af synlige ændringer i lysmikroskopi og svær proteinuri er kendetegnet ved MCD; ultrastrukturelle beviser for podocytbeskadigelse ved elektronmikroskopi er således en betingelse for diagnosen MCD til dato. Denne diagnostiske algoritme understreger betydningen af yderligere førstelinjediagnosticeringsværktøjer i denne henseende. Undersøgelsen af CD73-ekspression, især i omgivelser med begrænset tilgængelighed af elektronmikroskopi, kan således bidrage til at skelne mellem glomerulære (dvs. podocytopatiske) og ekstraglomerulære (f.eks. tubulære eller paraproteinemiske) kilder til proteinuri. Sammenligningen mellem immunhistokemi og immunfluorescens i vores undersøgelse ville tale til fordel for sidstnævnte.
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYRESYGDOMME
Adskillige publikationer har overbevisende dokumenteret afvigende fordeling og tab af podocytspecifikke proteiner i forskelligenyre sygdomindstillinger, der inkluderer podocytskade og proteinuri, som for nylig gennemgået [39]. I vores undersøgelse kunne vi inden for podocyt-skadegruppen ikke påvise en signifikant sammenhæng mellem intensiteten af podocin/nephrin-fluorescens og intensiteten af CD73-ekspression. Specifikke begrænsninger udelukker dog patofysiologisk fortolkning af podocin/nephrin vs. CD73 statistiske data. For det første valgte vi podocytter til evaluering af fluorescensintensitet ved hjælp af teknisk forstørrelse og opløsningskapacitet af konfokal mikroskopi. Selvom disse forhold let muliggør påvisning af podocytlegemer, forbliver større processer og især fodprocesser utydelige, og derfor muligvis ikke markeret/analyseret. For det andet kan korrelation mellem ekspression af CD73 og podocytspecifikke proteiner i hele glomeruli ikke retfærdiggøres: selvom vurdering af podocin og nephrin på dette niveau ville være legitim (da det er rimeligt at antage, at ingen andre glomerulære celler udtrykker disse proteiner), kan dette ikke være krævet for CD73, som er delvist udtrykt i det mindste af endotelceller. For det tredje er evaluering af gennemsnitlig fluorescensintensitet alene som uafhængig markør for podocytskade tvivlsom, da den ikke dækker det patologiske, granulære distributionsmønster af podocin og nephrin i glomerulus, som vi tydeligt kunne observere i figur 6. Derfor er vi tilbageholdende. at tilskrive fraværet af CD73-podocin og CD73-nephrin-korrelation i vores analyse til divergerende molekylære veje for disse markører. Yderligere podocytter in vitro og dyreforsøg er nødvendige for at udforske eventuel interferens mellem disse signaleringskaskader.
Tilsammen, idet vi anerkender lille prøvestørrelse som hovedbegrænsningen af vores undersøgelse, viser vi her en konsekvent CD73-overekspression af beskadigede podocytter og foreslår CD73 som en ny diagnostisk markør for podocytopati. Ved minimal forandringssygdom kan vores resultater hjælpe med at identificere beskadigede podocytter og resultere i en mindre tids- og omkostningskrævende diagnostisk proces. Derudover går vores resultater i overensstemmelse med publicerede data fra murine eksperimentelle tilgange og foreslår en beskyttende interaktion mellem CD73 og CCR2 hos menneskernyre sygdom. Yderligere multicenterundersøgelser med større patientkohorter er nødvendige for at adressere mekanismer for CD73-signalering hos menneskernyresygdom og dens prognostiske værdi. Tilsvarende ville der være behov for større kohortetal for at etablere en potentiel korrelation mellem sygdommens sværhedsgrad og CD73-ekspression.
Materialer og metoder
StudiekohorteI alt 49 biopsier inkluderet i denne undersøgelse fra 49 forskellige patienter blev diagnosticeret mellem 1. januar 2018 og 31. december 2019 på University Hospital Mannheim, University of Heidelberg. Yderligere udvælgelseskriterier var en repræsentativ biopsi med mulighed for at udføre triple-diagnostik med immunhistokemi og EM, tilstrækkelig klinisk information, entydig diagnose og tilstrækkeligt materiale til denne undersøgelse. Alle patienter var voksne og kaukasiere. Undersøgelserne omfattede 39 biopsier fra patienter med podocytskade af varierende ætiologi (7 biopsier fra patienter med primær fokal segmental glomerulosklerose—FSGS; 8 fra minimal change disease—MCD; 12 fra patienter med membranøs glomerulonephritis—MGN; 12 fra patienter med amyloidose). Negative kontroller varnyrebiopsier fra 10 patienter uden podocytlæsion og uden proteinuri (6 patienter med mild nefrosklerose, 2 patienter med interstitiel nefritis og 2 patienter uden patologiske forandringer). Alle de ovennævnte biopsier blev inkluderet i analysen af podocyt CD73-ekspression; for CCR2, efter udelukkelse af paraffinsnit med utilstrækkeligt antal ikke-sklerotiske glomeruli (<5), we="" performed="" analysis="" of="" surface="" expression="" and="" of="" correlation="" with="" cd73="" signature="" in="" 6="" samples="" from="" fsgs,="" 8="" from="" mcd,="" 10="" from="" mgn="" and="" 8="" from="" the="" amyloidosis="" group.="" in="" the="" ccr2="" analysis,="" the="" control="" group="" consisted="" of="" 6="" biopsies.="" relevant="" clinical="" data="" were="" collected="" from="" electronic="" medical="" records="" (table="" 1).="" informed="" consent="" was="" waived="" because="" of="" the="" retrospective="" nature="" of="" the="" study,="" because="" of="" the="" fact="" that="" anonymous="" clinical="" data="" were="" used="" for="" analysis="" and="" because="" the="" study="" was="" performed="" on="" already="" existing="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" after="" completing="" the="" diagnostic="" process,="" as="" approved="" by="" the="" ethic="" committee="" of="" the="" university="" medical="" centre="" mannheim,="" university="" of="" heidelberg="" (reference="" number:="">
Histologi, Immunhistokemi, Immunfluorescens og ElektronmikroskopiDe 1 µm serielle snit blev udført på paraffin-indlejretnyrebiopsier og farvet med hæmatoxylin/eosin (H/E), periodic acid-Schiff (PAS), Massons trichromfarvning samt standard rutinemæssig immunhistokemi til diagnostiske formål. Immunhistokemisk og immunfluorescerende farvning af formalinfikserede paraffinindlejrede biopsier for blev udført manuelt ved anvendelse af kanin-anti-humant CD73 monoklonalt antistof (klon D7F9A, Cell Signaling, Frankfurt am Main, Tyskland) og muse monoklonalt anti-humant CCR2-antistof (klon 7A7; Abcam, Cambridge, UK), kanin polyklonalt anti-humant antistof mod nephrin (Abcam, Cambridge, UK) og kanin anti-humant podocin-antistof (Sigma, Saint Louis, MO, USA), ifølge producentens protokoller. Alle biopsierne blev inkluderet i analysen af podocyt CD73-ekspression ved immunhistokemi; for CCR2, paraffinsnit med utilstrækkeligt antal ikke-sklerotiske glomeruli (<5) were="" excluded.="" to="" minimize="" the="" noise,="" antibody="" optimization="" for="" immunohistochemistry="" was="" performed="" using="" control="" (tonsil)="" tissue.="" the="" tissue="" sections="" were="" stained="" with="" dako="" real="" detection="" system="" alkaline="" phosphatase/red="" rabbit/mouse="" kit="" (agilent,="" santa="" clara,="" ca,="" usa)="" and="" avidin/biotin="" blocking="" kit="" (vector="" laboratories,="" burlingame,="" ca,="" usa).="" antigen="" retrieval="" was="" performed="" for="" 20="" min="" using="" dako="" target="" retrieval="" solution="" (equivalent="" citrate="" buffer,="" ph="" 6.0).="" primary="" antibodies="" were="" incubated="" for="" 60="" min="" in="" dako="" antibody="" diluent="" with="" 2%="" dry="" milk="" at="" 37="" ◦="" c="" and="" detected="" using="" the="" dako="" real="" link,="" biotinylated="" secondary="" antibodies="" (included="" in="" the="" kit),="" and="" dako="" real="" streptavidin="" alkaline="" phosphatase="" (ap).="" the="" reaction="" was="" visualized="" by="" a="" red="" chromogen="" (included="" in="" the="" kit).="" the="" slides="" were="" counterstained="" with="" hematoxylin,="" dehydrated,="" mounted="" using="" aquatex="" (merck,="" darmstadt,="" germany)="" and="" cover-slipped.="" for="" immunofluorescence,="" ccr2/cd73="" co-expression="" was="" evaluated="" in="" total="" of="" 22="" podocytes="" from="" all="" podocyte="" lesion="" groups.="" cd73="" was="" stained="" with="" alexa="" flour="" tm="" 488="" tyramide="" superboost="" tm="" kit,="" streptavidin="" (invitrogen,="" thermo="" fisher,="" waltham,="" ma,="" usa)="" using="" secondary="" biotinylated="" anti-mouse="" antibody="" (biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" secondary="" antibodies="" for="" the="" immunofluorescence="" were="" donkey="" anti-mouse="" cf="" 594="" and="" donkey="" anti-rabbit="" cf="" 594="" (both="" from="" biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" for="" electron="" microscopy,="" biopsies="" were="" post-fixed="" with="" 1%="" osmium="" tetroxide="" (roth,="" karlsruhe,="" germany),="" embedded="" in="" agar="" 100="" resin="" (agar="" scientific,="" stansted,="" uk),="" cut="" at90nm="" thickness="" andstained="" with1%="" uranylacetate(serva,="" heidelberg,="" germany).="" micro-graphs="" were="" taken="" on="" transmission="" electron="" microscope="" jem-1400="" (joel,="" freising,="">
CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYREFUKTION
Lysmikroskopi og morfometriske analyserBilledoptagelse og analyse blev udført ved hjælp af PreciPoint scanningsmikroskopet M8 med Olympus PlanCN 40 × /0.65 objektiv og MicroPoint-software (v.5 2. maj016; PreciPoint, Freising , Tyskland). Semikvantitativ evaluering af podocyt CD73 overfladeekspression i immunhistokemisk farvning blev vurderet ved hjælp af en 0-3 scoringsskala (0-ingen udtryk; 1-fokal segmental positivitet (<50% podocytes="" positive="" in=""><50% glomeruli);="" 2—focal="" global="" (="">50 procent podocytter positive i<50% glomeruli);="" 3—diffuse="" (any="" percentage="" of="" podocytes="" positive="" in="">50 procent glomeruli). CD73 positive og negative podocytter blev analyseret for CCR2 co-ekspression ved hjælp af et intensitetsbaseret semikvantitativt scoringssystem (0 - ingen udtryk, 1 - svag ekspression, 2 - moderat ekspression og 3 - stærk ekspression, ifølge biopsi-intern CCR2 positiv kontrol - endotel og infiltrerende immunceller). Evaluering blev udført uafhængigt af to patologer (SP og ZP) på en blind måde.
Konfokal mikroskopiBilleder af CD73 (Alexa Fluor 488), CCR2 (Alexa Fluor 594) og kerner (DAPI) af podocytter blev taget sekventielt med Olympus FV1000 motoriseret konfokalmikroskop udstyret med et HeNe 594 nm, Argon 488 nm og en UV-diode 405 nmlaser og fotomultiplikatorrør (PMT'er) styret af FluoView-softwaren ved hjælp af 60 × /1,35 UPlanSApo-objektivet. 12-bit-billederne med 512 × 512 pixelrammer og pixelstørrelse på 0,41 µm for oversigter og 0,10 µm for høj opløsning blev opnået ved at holde alle indstillingerne på mikroskopet konstante. Billederne blev yderligere semi-automatisk behandlet og analyseret ved hjælp af en egenudviklet ImageJ-makro (adgangsdato: 15. december 2020). Kort efter blev billeder segmenteret for individuelle podocytter, tærskel blev anvendt, og gennemsnitlig intensitet blev målt, statistisk analyseret og plottet. Alle billederne blev behandlet med konstante indstillinger og vist med samme pseudofarve lige lineært justeret for individuelle kanaler på flettede billeder
Statistiske analyserStatistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPadPrismv. 8.4.3software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Alle data er rapporteret som middel ± SEM. Statistiske forskelle blev beregnet ved hjælp af parret eller uparret t-test samt Pearson korrelationsanalyse, som angivet.