Galectin-3 har anti-nekroptotisk og anti-apoptotisk virkning ved cisplatin-induceret akut tubulær nekrose

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Suhail Al-Salama et al

Cistanche tubulosa dosering for nyresygdom, klik her for at få prøven

Abstrakt

Baggrund/mål:Spidsnyreskade (AKI) er en offentlig sundhedsbyrde med øget sygelighed, dødelighed og sundhedsomkostninger. Det er forbundet med en øget risiko for udvikling af kroniskenyresygdom og død. Akut tubulær nekrose (ATN) er den mest almindelige årsag til AKI. Apoptose og vævsnekrose spiller en vigtig rolle i ATN. Galectin 3 (GAL-3), et beta-galactosid-bindende lektin, er kendt for at have en rolle ved inflammation, apoptose og oxidativt stress, men dets rolle i cisplatin-induceret akut tubulær nekrose er ikke klart belyst.

Metoder:Han C57B6-J og C57BL-6 –GAL-3 knock-out mus blev brugt til at inducere ATN ved hjælp af en cisplatin musemodel af akut tubulær nekrose. GAL-3-ekspression, apoptotiske, nekrotiske og nekroptotiske proteiner inyrerblev målt under anvendelse af standard histologiske, immunhistokemiske og enzymforbundne immunosorbent assayteknikker. Data blev præsenteret som middel ± SE Statistisk signifikante forskelle (s<0.05) were="" calculated="" between="" experimental="" groups="" and="" corresponding="" control="" groups="" by="" one-way="" analysis="" of="">

Resultater:Der var en betydelig stigning i GAL-3 inyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 vilde mus sammenlignet med dets kontrolmus. Derudover var der signifikant højere procenter af ATN, højere niveauer af plasmaurinstof og kreatinin og højere niveauer af cathepsin B og cathepsin D inyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus end cisplatin-behandlede GAL-3-vilde mus. Ligeledes var der signifikant højere niveauer af nekroptoseproteiner RIPK1, RIPK3 og MLKL inyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus end cisplatin-behandlede GAL-3-vilde mus. Desuden var der markant højere niveauer afnyrepro-apoptotiske proteiner; spaltet caspase-3, spaltet PARP, TRAIL og FAS i cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus sammenlignet med cisplatin-behandlede GAL-3-vilde mus.

Konklusion:GAL-3 kan påvirke celleoverlevelse og død gennem dets interaktion med nekroptotiske, apoptotiske og pro-overlevelsesproteiner i renale tubuli under cisplatin-induceret akut tubulær nekrose.

Nøgleord: Nyre• Akut tubulær nekrose • Cisplatin • Galectin-3 • Nekroptose • Apoptose

Introduktion

Spidsnyreskade (AKI) er karakteriseret ved en brat reduktion inyrefunktion baseret på en stigning i serumkreatininniveauet, en reduktion i urinproduktionen, behovet for nyreudskiftningsterapi eller en kombination af disse faktorer [1].

DetNyreDisease Improving Global Outcome (KDIGO) klinisk praksis for AKI, definerer AKI som enten en stigning i serumkreatinin med mere end eller lig med 0,3 mg/dl (større end eller lig med 26,5 µmol/l) inden for 48 timer; eller en stigning i serumkreatinin til mere end eller lig med 1,5 gange baseline, hvilket er kendt eller formodet at være sket inden for de foregående 7 dage; eller urinvolumen<0.5 ml/kg/h="" for="" 6="" hours="">

Akut tubulær nekrose (ATN) er en almindelig årsag til AKI [3]. Iskæmiske og nefrotoksiske overgreb er hovedårsagerne til ATN [3]. På trods af omfattende undersøgelser af ATN, som omfatter celleskade, celledød og regenerering, er de underliggende mekanismer ikke klart definerede.

Apoptose er en form for programmeret celledød medieret af caspaser. Betydelige rapporter har vist, at apoptose spiller en vigtig rolle i ATN [3, 4]. På den anden side er nekrose en form for celledød karakteriseret ved tidlig plasmamembranpermeabilisering, organelhævelse og opløsning af cellulært indhold [5]. Nekrose opstår ofte, når celler udfordres med overdreven ekstern stress. Nekrose er traditionelt blevet betragtet som passiv og uprogrammeret; derfor var der gjort meget få anstrengelser for at undersøge mekanismen for nekrose, på trods af dens udbredelse i humane sygdomme [5]. En velkendt type nekrose er nekroptose [5]. Nekroptose er en programmeret ikke-apoptotisk celledød induceret af en række ekstracellulære stimuli, såsom tumornekrosefaktor (TNF) [5]. Det blev oprindeligt defineret som celledød karakteriseret ved nekrotisk celledødsmorfologi med samtidig aktivering af receptorinteragerende serin/threonin-proteinkinase 1 (RIPK1). RIPK1 aktiverer receptor-interagerende serin/threonin-protein kinase 3 (RIPK3) for at danne et kompleks, der kaldes nekrosom [6]. Senere opnår den aktiverede RIPK3 evnen til at phosphorylere og aktivere blandet lineage kinase domæne-lignende (MLKL) [6]. Fosforylerede MLKL-molekyler er i stand til at danne oligomerer for at lette deres translokation til cellemembranen gennem binding til phosphatidylinositollipider og cardiolipin. De translokerede MLKL-oligomerer fungerer som kanaler i cellemembranen for at inducere enten tilstrømning af natrium og efflux af kaliumioner [7] eller alternativt en tilstrømning af calciumioner [8]. På begge måder vil dette føre til nekrotisk celledød gennem plasmamembranpermeabilisering og brud, hvilket fører til spild af det intracellulære indhold ind i organet.

I dette projekt har vi brugt cisplatin (Cis) til at inducere akut tubulær nekrose. Cis har en bred vifte af antitumoreffekter og er blevet brugt til at behandle forskellige maligne tumorer [9]. Ikke desto mindre er nefrotoksicitet den vigtigste bivirkning og er karakteriseret ved renal tubulær celle-nekrose, vævsskade, nyreinsufficiens og akutnyrefejl [10]. På trods af forskellige foranstaltninger, der er blevet truffet for at overvinde nyreskade, er næsten 4-23 procent af patienterne ramt af AKI [11]. De kendte mekanismer for cisplatin-induceret nyreskade omfatter apoptose, oxidativt stress og inflammatorisk respons på grund af direkte skade på renale tubulære epitelceller og nyrekar [12].

Galectin-3 (GAL-3), 35 kDa protein, er et unikt kimærlignende, der har ét C-terminalt kulhydratgenkendelsesdomæne (CRD) forbundet med et langt N-terminalt domæne (ND) [13 ].GAL-3 findes på celleoverfladen, cytoplasmaet og cellekernen samt i den ekstracellulære matrix [13].

Intracellulær GAL-3 har været involveret i celleproliferation og anti-apoptotiske mekanismer [14, 15]. Det påvirker K-Ras- og Akt-proteiner og regulerer således også differentieringsoverlevelse og død [14, 15]. Mens ekstracellulær GAL-3 medierer celle-celleadhæsion, celle-matrix-interaktion og signalering, inflammation og apoptose [16].

GAL-3 har vist sig at translokere enten fra cytosolen eller fra kernen til mitokondrierne efter eksponering for apoptotiske stimuli og at blokere ændringer i mitokondriemembranpotentialet og derved forhindre apoptose [17]. Undersøgelser har også vist, at GAL-3 kan hæmme TNF-induceret apoptose gennem aktivering af AKT [18]. Andre undersøgelser har vist, at GAL-3 og Beclin1 er involveret i to koordinerede veje for programmeret celledød, apoptose og autofagi [18]. I dette projekt antager vi, at GAL-3 har en beskyttende rolle på det renale tubulære epitel ved akut tubulær skade. Vi har brugt en murin model for akut tubulær skade til at undersøge den beskyttende rolle af GAL -3 i cisplatin-induceret akut tubulær skade gennem måling af nyrefunktioner (plasmaurinstof og kreatinin),nyrenekroptoseproteiner (RIP-1, RIP-3 og MLKL), nekroseproteiner (Cathepsin D og Cathepsin B), apoptoseproteiner (spaltet Caspase-3, spaltet PARP, TRAIL og FAS) , og celleoverlevelsesmarkører (p-NF-KB, beta-catenin og Wnt), ved anvendelse af standard enzym-linked immunosorbent assay, biokemisk analysator, histologiske og immunhistokemiske procedurer.

Materialer og metoder

Vi har brugt en mus eksperimentel model af akutnyreskade, som er blevet udførligt beskrevet i litteraturen og brugt til at studere akutnyreskade i laboratorier verden over [19].

Musemodel af akut tubulær nekrose

Der blev brugt C57BL/6 og C57BL/6 –GAL-3 knock-out (KO) mus, der vejede 25-30 g. Mus blev holdt på en standarddiæt. Musene blev anbragt fem pr. bur under en 12-t lys og mørke tidsplan i mindst 1 uge før Cisplatin-administration.

Cisplatin (EBEWE Pharma GmbH Nfg. KG, Unterach, ØSTRIG) blev frisk brugt på indgivelsesdagen i en koncentration på 0,5 mg/ml. Mus fik enten 30 mg/kg legemsvægt cisplatin [11] eller vehikel (normalt saltvand) intraperitonealt (IP), hvorefter musene igen havde fri adgang til mad og vand. Dødshjælpsmetoden startede med en intraperitoneal injektion af bedøvelsesmidler, som omfattede en kombination af ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg), derefter blev nyrerne fjernet, og blodprøver blev indsamlet 96 timer efter cisplatin-administration. Blod blev opsamlet i EDTA vacutainere.Nyrerblev derefter resekteret, vasket i iskoldt fosfatpufret saltvand (PBS), den ene halvdel af hver nyre blev straks frosset i flydende nitrogen og senere opbevaret i en -80 graders fryser. Den anden halvdel blev straks fikseret i 10 procent bufret formel saltvand i 24 timer. Opsamlet blod blev centrifugeret ved 3000 RPM i 15 minutter. Plasmaet blev opsamlet, alikvoteret og opbevaret ved -80 grader indtil videre analyse.

Prøvebehandling til proteinekstraktion

Totalt protein blev ekstraheret franyreprøver ved homogenisering med lysisbuffer og opsamling af supernatanten efter centrifugering. For total cellelysat blev nyreprøverne optøet, vejet og lagt i kold lyseringsbuffer indeholdende 5{{20}} mM Tris, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3 mM EDTA, 20 mM -glycerophosphat, 25 mM NaF, 1 procent Triton X-100, 10 procent w/v Glycerol og proteasehæmmertablet (Roche Complete protease inhibitor cocktailtabletter). Nyrerne blev homogeniseret på is med en homogenisator (IKA T25 Ultra Turrax). Prøverne blev derefter centrifugeret ved 14000 RPM i 15 minutter ved 4 grader, supernatanten blev opsamlet, alikvoteret og opbevaret ved -80 grader indtil videre analyse. Nuklear og cytoplasmatisk proteinekstraktion blev udført efter protokollen beskrevet andetsteds [19]. Kort fortalt blev nyreprøverne optøet på is, vejet og homogeniseret på is med buffer indeholdende Tris HCl 10 mmol/l, CaCl2 3 mmol/l, MgCl2 2 mmol/l, EDTA 0,1 mmol/l , Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) 0,5 mmol/l, saccharose 0,32 mmol/l, Dithiothreitol (DTT) 1 mmol/l, Nonidet P-40 (NP-40) 0,5 procent og proteaseinhibitorcocktail 1 procent. Homogenaterne blev centrifugeret ved 800 RPM i 10 minutter. Supernatanten blev fjernet og opbevaret som cytoplasmatiske fraktioner. Pelleten blev vasket to gange med homogeniseringsbuffer uden NP-40 og resuspenderet med en buffer med lavt saltindhold indeholdende HEPES 20 mmol/l, MgCl2 1,5 mmol/l, KCl 20 mmol/l, EDTA 0,2 mmol /l. Glycerol 25 procent, PMSF 0,5 mmol/l og DTT 0,5 mmol/l. Efter inkubation på is i 5 minutter, et lige så stort volumen højt saltbuffer indeholdende HEPES 20 mmol/l, MgCl2 1,5 mmol/l, KCl 800 mmol/l, EDTA 0,2 mmol/l. Glycerol 25 procent, PMSF 0,5 mmol/l, DTT 0,5 mmol/l, NP-40 1 procent og proteaseinhibitorcocktail 1 procent, blev tilsat, blandingen blev inkuberet på is i 30 minutter, centrifugeret ved 14000 RPM i 15 minutter ved 4 grader, og supernatanter blev gemt som den nukleare fraktion. Den samlede proteinkoncentration blev bestemt ved BCA-proteinassaymetoden (Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit).

Prøvebehandling til histologi

Nyrerne blev skåret ud, vasket med iskold PBS og vejet. Hvernyreblev delt i to halvdele, og hver halvdel var en kassette og fikseret direkte i 10 procent bufret formalin. Sektioner blev dehydreret i stigende koncentrationer af ethanol, renset med xylen og indlejret med paraffin. Tre-µm sektioner blev fremstillet fra paraffinblokke og farvet med hæmatoxylin og eosin og periodic acid Schiff (PAS) farvninger ved anvendelse af standardprocedurer [20]. De farvede snit blev evalueret af den histopatolog, der deltog i dette projekt.

Immunhistokemi

Fem µm sektioner blev afparaffineret med xylen og rehydreret med graderet alkohol. Sektioner blev derefter anbragt i Retrieval Solution med høj pH (pH 9) i et vandbad ved 95oC i 20 minutter. Sektioner blev derefter vasket med destilleret vand i 5 minutter efterfulgt af TBST-buffer i 5 minutter. Sektioner blev derefter behandlet med peroxidaseblokering i 10 minutter efterfulgt af proteinblokering i 10 minutter. Sektioner blev derefter inkuberet i en time ved stuetemperatur med anti-spaltet caspase-3 antistof (Rabbit Polyclonal, 1:300, Cell signaling technology, Danvers, MA USA), anti-spaltet PARP antistof (Rabbit Polyclonal, 1: 100, Cellesignaleringsteknologi, Danvers, MA, USA), anti-beta-catenin antistof (Rabbit Polyclonal, 1:100, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-phospho-NF-κB antistof (Rabbit Polyclonal, 1: 100, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-Wnt-3 (Rabbit Polyclonal, 1:100, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-RIPK1 (Rabbit polyclonal,1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), anti-RIPK3 (kanin polyklonal, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) og anti-MLKL 1 (kanin monoklonal, 1:100, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) . Efter konjugering med primære antistoffer blev sektioner inkuberet med sekundært antistof (EnVisionTM Detection System, DAKO, Agilent, USA) i 20 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af tilsætning af DAB-kromogen (EnVisionTM Detection System, DAKO, Agilent, Santa Clara, CA, USA) og modfarvning blev udført med hæmatoxylin. Der blev anvendt passende positive kontroller. For negativ kontrol blev det primære antistof ikke tilsat til sektioner. Positive og negative kontroller blev brugt i hver batch af farvede objektglas (ikke vist i figurerne).

Immunfluorescerende mærkning

Fem-μm sektioner blev afparaffineret med xylen og rehydreret med graderet alkohol. Sektioner blev anbragt i Retrieval Solution med en høj pH (pH 9) i et vandbad ved 95 grader i 20 minutter. Sektioner blev derefter vasket med destilleret vand i 5 minutter efterfulgt af TBST-buffer i 5 minutter. Sektioner blev derefter inkuberet med anti-GAL-3 antistof (Rabbit Polyclonal, 1:50, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA), anti-RIPK1 (Rabbit polyclonal, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), anti-RIPK3 1 (kanin polyklonal, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) og anti-MLKL 1 (kanin monoklonal, 1:50, Thermo Scientific, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) natten over ved stuetemperatur. Sektioner blev efterfølgende inkuberet med æsel-anti-kanin Alexa Fluor 488, (Jackson Immune Research Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA, 1:100) antistof. Til sidst blev sektioner monteret i DAPI-vandopløselige monteringsmedier (Abcam, Cambridge, MA, USA) og set med et Olympus fluorescerende mikroskop. Der blev anvendt passende positive kontrolsektioner. For negativ kontrol blev det primære antistof ikke tilsat til sektioner, og hele proceduren blev udført på samme måde som nævnt ovenfor. Positive og negative kontroller blev brugt i hver batch af farvede objektglas (ikke vist i figurerne).

Morfometrisk analyse

Morfometrisk analyse af akut tubulær nekrose blev udført af to forskere, der deltog i denne undersøgelse. Morfometrisk analyse af spaltet caspase-3, spaltet PARP, RIPK1, RIPK3, MLKL, phospho-NFK-B, Wnt-3, Beta-Catenin, ekspression i renale tubulære celler blev udført ved hjælp af ImageJ-software (http: //rsbweb.nih.gov/ij/). Spaltet caspase-3, spaltet PARP, RIPK1, RIPK3, MLKL, phospho-NFK-B, Wnt-3, Beta-Catenin, mærkning blev bestemt ved at tælle antallet af positive celler i tilfældigt udvalgt høj effekt felter (HPF) i nyrerne. Det gennemsnitlige antal positive celler konverteres fra pr. HPF til pr. mm2 (Hver mm2= 4HPF). For mærkning af spaltet caspase-3, spaltet PARP, RIPK1, RIPK3 og Wnt-3 blev celler overvejet

positiv, når der var et cytoplasmatisk farvningsmønster. Til MLKL-mærkning blev celler betragtet som positive, når der var et membranøst og cytoplasmatisk farvningsmønster. For phospho-NFK-B og Beta-Catenin, mærkning, blev celler betragtet som positive, når der var et nukleært farvningsmønster.

Enzym-Linked Immunosorbent Assay

Nyrekoncentrationer af GAL-3, Cathepsin D, Cathepsin B, Cleaved caspase-3, TRAIL og FAS blev bestemt ved hjælp af DuoSet enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) Development Kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) ) til sandwich ELISA ved at bruge standardprocedure i henhold til producentens instruktioner. Nyre-spaltede PARP-koncentrationer blev bestemt under anvendelse af cellesignalteknologi Elisa-kit (Danvers, MA, USA) til sandwich Elisa ved anvendelse af standardprocedure i henhold til producentens instruktioner. Nyre-RIPK1-, RIPK3- og MLKL-koncentrationer blev bestemt under anvendelse af MyBioSource (San Diego, CA, USA) Elisa-sæt til sandwich Elisa, ved anvendelse af standardprocedure i henhold til producentens instruktioner. Absorbansaflæsninger blev foretaget ved 450 nm under anvendelse af et 96-brøndpladespektrofotometer (BioTek ELx800 mikroplade Elisa-læser, Winooski, VT, USA). GAL-3, Cathepsin D, Cathepsin B, spaltet caspase-3, TRAIL, RIPK1, RIPK3, MLKL, spaltet PARP og FAS-koncentrationer i nyreprøver blev bestemt ved interpolation fra en standardkurve. Niveauerne blev normaliseret til totale proteinkoncentrationer.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af Graph Pad Prism Software version 5. Flere sammenligninger mellem de forskellige grupper blev opnået ved en-vejs variansanalyse (ANOVA), efterfulgt af Newman Keuls post hoc multiple range test. Sammenligninger mellem to grupper blev opnået ved Student t-test. Data præsenteres i middelværdi ± standardfejl (SE). P-værdier < 0.05="" betragtes="" som="">

Resultater

Cisplatin-induceret akut tubulær nekrose

Den cisplatin-behandlede GAL-3-vildgruppe viser ATN, der involverer (67,29 procent ± 2,392) af nyreparenkym (fig. 1) med tab af børstekanter, hævelse af tubulære celler, intratubulære faldende celler, intratubulære sekretioner og mitose ( fig. 2B og 3B).

Den cisplatin-behandlede GAL-3 KO-gruppe viser ATN, der involverer (78,54 procent ± 0.8120) af nyreparenkym (fig. 1) med tab af børstekanter, hævelse af tubulære celler, intratubulære faldende celler, intratubulære sekretioner og mitose (fig. 2D & 3D).

Der er en markant højere procentdel af ATN inyreri cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus end cisplatin-behandlede GAL-3 vilde mus (P<0.002) (fig.="">

GAL-3 udtrykkes i akut tubulær nekrose

Der er en signifikant stigning i den cytoplasmatiske fraktionkoncentration af GAL-3 inyreri den cisplatin-behandlede GAL-3-vildgruppe (6084 ± 587,3 pg/mg) sammenlignet med GAL-3-vildkontrolgruppen (1620 ± 62,3 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 4e).="" there="" is="" a="" significant="" increase="" in="" the="" nuclear="" fraction="" concentration="" of="" gal-3="" in="">nyreri den cisplatin-behandlede GAL-3 vild

gruppe (841,8 ± 41,11 pg/mg) sammenlignet med GAL-3 vild kontrolgruppe (429,2 ± 39,56 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 4e).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Immunfluorescerende farvning af repræsentativnyresektioner har vist en signifikant højere ekspression af GAL-3 i nyretubuli påvirket af akut tubulær nekrose (fig. 4B-D) sammenlignet med GAL-3 vilde kontrolmus (fig. 4A).

GAL-3 er en anti-nekroptotisk mediator

Receptorinteragerende serin/threonin-proteinkinase 1 (RIPK1). Der var en signifikant stigning i RIPK-1-koncentrationen (55,33 ± 3,766 pg/mg) inyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 vilde mus sammenlignet med GAL-3 vilde kontrolmus (14,22 ± 1,687 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-1="" concentration="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (39.59="" ±="" 1.808="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-1="" (159.7="" ±="" 4.183="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.33="" ±="" 3.766="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Flere sammenligninger mellem de fire eksperimentelle grupper ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Newman-Keuls post hoc test var statistisk signifikante (P<>

Immunhistokemisk farvning for RIPK-1 viste et signifikant højere antal celler, der udtrykker RIPK-1 inyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus end cisplatin-behandlede GAL-3-vilde mus (P<0.001), (fig.="">

Receptorinteragerende serin/threonin-proteinkinase 3 (RIPK3). Der var en signifikant stigning i RIPK-3-koncentrationen (616,4 ± 27,07 pg/mg) i nyrerne fra cisplatin-behandlede GAL-3-vilde mus sammenlignet med GAL-3-vilde kontrolmus (17,46 ± 7.002 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" ripk-3="" concentration="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (203.1="" ±="" 6.443="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" ripk-3="" (2165="" ±="" 73.29="" pg/mg)="" in="">nyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus end i cisplatin-behandlede GAL-3-vilde mus (616,4 ± 27,07 pg/mg), (P<0.001), (fig.="">

Immunhistokemisk farvning for RIPK-3 viste et signifikant højere antal celler, der udtrykker RIPK-3 i nyrerne fra cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus end cisplatin-behandlede GAL-3-vilde mus ( P<0.001), (fig.="" 7).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Blandet lineage kinase domæne-lignende (MLKL). Der var en signifikant stigning i MLKL-koncentrationen (71,46 ± 1,757 pg/mg) inyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 vilde mus sammenlignet med GAL-3 vilde kontrolmus (23,30 ± 0,5897 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" mlkl="" concentration="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (40.30="" ±="" 1.090="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" mlkl="" (160.3="" ±="" 6.648="" pg/mg)="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (71.46="" ±="" 1.757="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 5c).="" immunohistochemical="" staining="" for="" mlkl="" showed="" a="" significantly="" higher="" number="" of="" cells="" expressing="" mlkl="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice=""><0.001), (fig.="" 8).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Cathepsin B. Der var en signifikant stigning i Cathepsin-B koncentrationen inyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 vilde mus (55,79 ± 4,141 pg/mg) sammenlignet med GAL-3 vilde kontrolmus (37,99 ± 1,206 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-b="" concentration="" in="">nyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus (85,87 ± 9,220 pg/mg sammenlignet med GAL-3 vilde kontrolmus (32,81 ± 1,570 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 9a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-b="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (85.87="" ±="" 9.220="" pg/mg="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (55.79="" ±="" 4.141="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Flere sammenligninger mellem de fire eksperimentelle grupper ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Newman-Keuls post hoc test var statistisk signifikante (P<>

Cathepsin-D. Der var en signifikant stigning i Cathepsin-D-koncentrationen inyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 vilde mus (5145 ± 286,1 pg/mg) sammenlignet med GAL-3 vilde kontrolmus (4066 ± 107,7 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cathepsin-d="" concentration="" in="">nyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus (6695 ± 587,7 pg/mg) sammenlignet med GAL-3 vilde kontrolmus (3914 ± 87,51 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 9b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cathepsin-d="" in="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" (6695="" ±="" 587.7="" pg/mg)="" than="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4066="" ±="" 107.7="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="">

Flere sammenligninger mellem de fire eksperimentelle grupper ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Newman-Keuls post hoc test var statistisk signifikante (P<>

GAL-3 er en anti-apoptotisk mediator

Spaltet caspase-3. Der var en signifikant stigning i koncentrationen af ​​spaltet caspase-3 (4665 ± 330,9 pg/mg) inyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 vilde mus sammenlignet med GAL-3 vilde kontrolmus (3193 ± 75,30 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" caspase-3="" concentration="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (3022="" ±="" 78.57="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" caspase-3="" (6319="" ±="" 686="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (4665="" ±="" 330.9="" pg/mg),=""><0.01), (fig.="" 10a).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Immunhistokemisk farvning for spaltet caspase-3 viste et signifikant højere antal apoptotiske celler i nyrerne hos cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus end cisplatin-behandlede GAL-3-vilde mus (P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="" i).cleaved="">

Kløvet PARP. Der var en signifikant stigning i kløvet PARP-koncentration (1446 ± 56,97 pg/mg) inyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 vilde mus sammenlignet med GAL-3 vilde kontrolmus (171,5 ± 3,926 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (236.1="" ±="" 11.86="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Immunhistokemisk farvning for spaltet PARP viste et signifikant højere antal positive celler i nyrerne hos cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus end cisplatin-behandlede GAL-3-vilde mus (P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

TNF-relateret apoptose-inducerende ligand (TRAIL). Der var en signifikant stigning i TRAIL-koncentrationen (120,9 ± 4,748 pg/mg) inyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 vilde mus sammenlignet med GAL-3 vilde kontrolmus (86.14 ± 2.879 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (120.9="" ±="" 4.748="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Immunhistokemisk farvning for spaltet caspase-3 viste et signifikant højere antal apoptotiske celler inyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus end cisplatin-behandlede GAL-3-vilde mus (P<0.001), (fig.="" 11="" a,="" c,="">

Kløvet PARP. Der var en signifikant stigning i koncentrationen af ​​spaltet PARP (1446 ± 56,97 pg/mg) i nyrerne hos cisplatin-behandlede GAL-3 vilde mus sammenlignet med GAL-3 vilde kontrolmus (171,5 ± 3,926 pg/ mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" cleaved="" parp="" concentration="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="">nyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus sammenlignet med GAL-3 KO-kontrolmus (236,1 ± 11,86 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" cleaved="" parp="" (2044="" ±="" 91.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (1446="" ±="" 56.97="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Immunhistokemisk farvning for spaltet PARP viste et signifikant højere antal positive celler inyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus end cisplatin-behandlede GAL-3-vilde mus (P<0.001), (fig.="" 11="" e,="" g,="">

TNF-relateret apoptose-inducerende ligand (TRAIL). Der var en signifikant stigning i TRAIL-koncentrationen (120,9 ± 4,748 pg/mg) i nyrerne fra cisplatin-behandlede GAL-3 vilde mus sammenlignet med GAL-3 vilde kontrolmus (86.14 ± 2,879 pg/mg), (P<0.05), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" trail="" concentration="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (82.77="" ±="" 3.881="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="" 10c).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" trail="" (184.3="" ±="" 19.47="" pg/mg)="" in="" the="">nyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus end i cisplatin-behandlede GAL-3-vilde mus (120,9 ± 4,748 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10c).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

FAS legende.Der var en signifikant stigning i FAS-koncentrationen (332,5 ± 6,395 pg/mg) inyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 vilde mus sammenlignet med GAL-3 vilde kontrolmus (77,72 ± 2,805 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" fas="" concentration="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="">nyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus sammenlignet med GAL-3 KO-kontrolmus (134,1 ± 3,597 pg/mg), (P<0.001), (fig.="" 10d).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" concentration="" of="" fas="" (387.9="" ±="" 8.520="" pg/mg)="" in="" the="" kidneys="" of="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (332.5="" ±="" 6.395="" pg/mg),=""><0.001), (fig.="">

Flere sammenligninger mellem de fire eksperimentelle grupper ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Newman-Keuls post hoc test var statistisk signifikante (P<>

GAL-3 og prosurvival-signaler

NF-KB.Immunhistokemisk farvning for phosphor-NF-kB viste et signifikant højere antal celler farvet med phosphor-NF-kB inyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 vilde mus end cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus (P<0.001), (fig.="" 12="">

Beta Catenin.Immunhistokemisk farvning for Beta-catenin viste et signifikant højere antal celler farvet med Beta-catenin inyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 vilde mus end cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus (P<0.001), (fig.="" 12="">

Wnt-3a.Immunhistokemisk farvning for Wnt-3a viste et signifikant højere antal celler farvet med Wnt-3a i nyrerne fra cisplatin-behandlede GAL-3-vilde mus end cisplatin-behandlede GAL-3 KO mus (P<0.001), (fig.="" 12="">

Plasma UreaDer var en signifikant stigning i plasmaurinstofkoncentrationen (23,88 ± 6,715 mmol/L) i cisplatin-behandlede GAL-3 vilde mus sammenlignet med GAL-3 vilde kontrolmus (6,688 ± 0). 6066 mmol/L), (P<0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (8.331="" ±="" 0.5194="" mmol/l),=""><0.001), (fig.="" 13a).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" urea="" concentration="" (36.10="" ±="" 2.878="" mmol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (23.88="" ±="" 6.715mmol/l),=""><0.001), (fig.="">

Flere sammenligninger mellem de fire eksperimentelle grupper ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Newman-Keuls post hoc test var statistisk signifikante (P<>

Plasma kreatinin

Der var en signifikant stigning i plasma-kreatininkoncentrationen (48,42 ± 3,992 umol/L) i cisplatin-behandlede GAL-3 vilde mus sammenlignet med GAL-3 vilde kontrolmus (13,27 ± 0). 3106 umol/L), (P<0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significant="" increase="" in="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" when="" compared="" with="" gal-3="" ko="" control="" mice="" (13.88="" ±="" 0.4183="" umol/l),=""><0.001), (fig.="" 13b).="" there="" was="" a="" significantly="" higher="" plasma="" creatinine="" concentration="" (62.36="" ±="" 3.605="" umol/l)="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" ko="" mice="" than="" in="" cisplatin-treated="" gal-3="" wild="" mice="" (48.42="" ±="" 3.992="" umol/l),=""><0.01), (fig.="" 13b).="" multiple="" comparisons="" between="" the="" four="" experimental="" groups="" using="" one-way="" anova,="" followed="" by="" newman-keuls="" post="" hoc="" test="" were="" statistically="" significant=""><>

Diskussion

Spidsnyreskade er et almindeligt sundhedsproblem på verdensplan. Hvert år er der omkring 13,3 millioner tilfælde af akuttenyreskade (AKI). En byrde, der er ved at blive særlig høj i nye vækstlande [21]. Globalt er der 1,7 millioner dødsfald om året forårsaget af AKI. Heraf forekommer omkring 1,4 millioner i lav- og mellemindkomstlande [21]. AKI kan ofte forebygges og behandles med kun få, hvis nogen, langsigtede sundhedsmæssige konsekvenser. Identifikation af hovedmekanismer og aktører, der deltager i udviklingen af ​​AKI, vil blive afspejlet i at forbedre patienters pleje og minimere dødelighed og sygelighed.

Vi har vist en signifikant stigning i GAL-3-koncentration inyrerudsat for AKI. Vi har også vist en signifikant højere ekspression af GAL-3 i nyretubuli påvirket af akut tubulær nekrose i cisplatin-behandlede GAL-3-vilde mus end nyretubuli i den saltvandsbehandlede kontrolgruppe. Både cytoplasmatiske og nukleare koncentrationer af GAL-3 er signifikant forhøjet i nyretubuli efter ATN sammenlignet med saltvandsbehandlede mus. Det forhøjede niveau af GAL-3 i beskadigede nyretubuli tyder på, at GAL-3 er en vigtig spiller i ATN.

Vi har også brugt GAL-3 KO-mus til at undersøge den mekanistiske rolle af GAL-3 i ATN. Dette hjælper os med at se nærmere på moduleringerne af pro-apoptotiske, pro-nekroptotiske og prosurvival-proteiner i nærvær og fravær af GAL-3 og bestemmer, om GAL-3 har nogen effekt eller ej på disse ændringer .

Vi har vist en signifikant højere procentdel af tubuli påvirket af ATN i cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus end i cisplatin-behandlede GAL-3-vilde mus. Vores resultater har også vist en signifikant stigning i cathepsin B og cathepsin D i nyrer påvirket af ATN. Derudover er der signifikant højere niveauer af cathepsin B og cathepsin D innyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus end i cisplatin-behandlede GAL-3-vilde mus. Cathepsiner spiller vigtige roller i signalvejene, der driver apoptotisk og nekrotisk celledød, ved at nedbryde forskellige substrater og/eller bidrage til mitokondriel destabilisering [22]. Lysosomale proteaser, cathepsin B og cathepsin D er rigeligt udtrykt i nyrerne [23].

Cathepsin B, en cysteinproteinase, der har optimal aktivitet i et surt miljø, deltager i mange fysiologiske og patologiske processer. Det fordøjer strukturelle proteiner og enzymer i cellen, nedbryder hovedelementerne i basalmembranen og aktiverer proenzymer, hormoner og vækstfaktorer [24]. Forøgede ekspressionsniveauer og aktivering af cathepsin B er blevet observeret i den humane proksimale tubulære epitelcellelinje HK-2, der gennemgår apoptose [25].

Cathepsin D udtrykkes signifikant i proksimale tubulære celler. Cathepsin D er en nøglelysosomal asparaginprotease, der er ansvarlig for nedbrydningen af ​​proteiner og organeller ved autofagi-lysosomal såvel som under cellulær nekrose og brud på den lysosomale membran [26]. Cathepsin D er signifikant øget i beskadigede tubuli efter nyreiskæmi/reperfusionsskade, hvilket understøtter vores opdagelse af en signifikant stigning i cathepsin D inyrermed akut tubulær nekrose [27].

De højere niveauer af Cathepsin B og D med en højere procentdel af ATN inyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus end cisplatin-behandlede GAL-3-vilde mus foreslår GAL-3 som en anti-nekrotisk mediator.

Vi har også vist signifikant højere niveauer af nekroptoseproteiner; RIPK1, RIPK3 og MLKL inyreraf cisplatin-behandlede mus. Desuden har vi identificeret signifikant højere koncentrationer af RIPK1, RIPK3 og MLKL i nyrerne hos cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus end cisplatin-behandlede GAL-3-vilde mus.

Undersøgelser har vist, at cisplatin er forbundet med øget oxidativt stress [28]. Generering af reaktive oxygenarter (ROS), akkumulering af lipidperoxidationsprodukter inyrer, og undertrykte antioxidantsystemer menes at være hovedmekanismerne for cisplatin-induceret AKI [29]. I cellen omdannes cisplatin til en meget reaktiv form, der hurtigt reagerer med thiolholdige antioxidantmolekyler såsom glutathion [30]. Cisplatin kan også forårsage mitokondriel dysfunktion og øget ROS-produktion gennem en svækket respirationskæde [31]. ROS letter RIPK1-autophosphorylering og fremmer rekrutteringen af ​​RIPK-3 og dannelsen af ​​nekrosom [32]. Derudover er ROS en kritisk inducer af lysosomal membranpermeabilitet (LMP) [33].

Cai et al. [34] har vist, at ROS-medieret LMP er involveret i induktionen af ​​nekroptose i intervertebrale diskceller fra kanin. Ligeledes efterfølges RIPK1--induceret mitokondriel-ROS-produktion af LMP og mitokondriel dysfunktion som et resultat af en positiv feedback-loop mellem Ca2 plus og JNK, hvilket fører til nekroptose af A549- og H1299-celler [35, 36].

Desuden er det blevet vist, at opreguleret-RIPK3 i nekroptose inducerer endoplasmatisk retikulumstress, som øger cellulær Ca2 plus koncentration og ekspression af xanthinoxidase, hvilket fører til boostet ROS-generering [37].

Cathepsin B og D er de vigtigste funktionelle indhold frigivet fra lysosomer med øget LMP under processen med celledød [34]. Cathepsin B- og D-aktivering kan øge den nekroptotiske vej [38]. Så nekroptose kan induceres på en receptor-uafhængig måde [39]. Desuden har rapporter vist, at der er yderligere stimuli, bortset fra ROS, cathepsin B og D, til induktion af nekroptose, og disse inkluderer opregulering af TRAIL og FAS legende-proteiner [40]. Så den øgede ROS, uanset om det skyldes cisplatin eller induktionen af ​​RIPK1 eller RIPK3, kan føre til øget LMP og frigivelse af cathepsin B og D, som igen forstærker nekroptose. Ligeledes kan den øgede ROS aktivere RIPK1, rekruttering af RIPK3, forøgelse af nekrosomdannelse, phosphorylering af MLKL, translokation af phosphoryleret MLKL til cellemembran, hvilket fører til nekrotisk celledød gennem plasmamembranpermeabilisering og ruptur.

I denne undersøgelse mener vi, at den øgede ROS, cathepsin B, cathepsin D, TRAIL og FAS er involveret i induktionen af ​​nekroptose i ATN.

For at bestemme rollen af ​​GAL-3 i nekroptose har vi målt RIPK1-, RIPk3- og MLKL-koncentrationer i nærvær og fravær af GAL-3 ved at bruge GAL-3 wild og GAL{{5 }} KO mus.

De signifikant højere koncentrationer af RIPK1, RIPK3 og MLKL i cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus end cisplatin-behandlede GAL-3-mus indikerer, at knock-out af GAL-3 er forbundet med en signifikant stigning i nekroptoseproteiner, hvilket tyder på en anti-nekroptotisk rolle af GAL-3.

Desuden har vi vist signifikant højere niveauer af pro-apoptotiske proteiner; spaltet caspase-3, spaltet PARP, TRAIL, FAS og apoptotiske legemer inyrerefter ATN.

Under ATN tillader lysosomal membranpermeabilisering translokation af cathepsin D og cathepsin B fra lysosomet til cytosolen, hvor det kan udøve sin pro-apoptotiske funktion. Cytosolic cathepsin D spalter Bid-protein til tBid, hvilket udløser indsættelsen af ​​Bax-protein i mitokondriemembranen. Dette fører til frigivelse af cytokrom c fra mitokondrierne til cytosolen og aktivering af pro-caspases 9 og 3 [41]. I denne undersøgelse har både immunfluorescerende farvning og proteinkoncentration vist signifikant højere ekspression af intracellulær GAL-3, både cytoplasmatiske og nukleare fraktioner, i ATN inyreraf GAL-3 vilde mus sammenlignet med kontrolmus.

Så de højere niveauer af pro-apoptotiske proteiner; spaltede caspase-3, TRAIL, FAS og apoptotiske legemer inyreraf cisplatin-behandlede GAL-3 KO-mus end i cisplatin-behandlede GAL-3-vilde mus tyder på en anti-apoptotisk rolle for GAL-3. GAL-3 har vist sig at være kritisk involveret i apoptose afhængigt af dets subcellulære lokalisering. Undersøgelser har vist, at intracellulær GAL-3 kan hæmme apoptose [42-44]. Til støtte for den anti-apoptotiske rolle af GAL-3 har vi identificeret et signifikant højere antal celler, der udtrykker phospho-NF-κB, beta-catenin og Wnt-proteiner i nyrerne af cisplatin-behandlet GAL{{15} } vilde mus end GAL-3 KO-mus. NF-KB er en transkriptionsfaktor, der spiller en vigtig rolle i regulering af inflammation, celleproliferation og celleoverlevelse. Fosforylering spiller en kritisk rolle i aktiveringen af ​​NF-KB nedstrøms for alle disse stimuli [45]. NF-KB er nu anerkendt som en vigtig bidragyder til celleoverlevelse og beskyttelse mod apoptose [46]. Wnt-proteinerne har vist sig at have beskyttende virkninger på skadede celler gennem deres anti-apoptotiske funktion via aktivering af -catenin og c-Myc [47].

Wu et al. har også vist en signifikant stigning i p-NF-kB inyrermed ATN [48]. Wang et al. har også vist opregulering af Wnt/-catenin signalvejen ved akut nyreskade [49]. Undersøgelser har vist, at NF-KB er involveret i induktionen af ​​GAL-3 [50] såvel som at GAL-3 er involveret i aktiveringen af ​​NF-KB [51]. Interessant nok har GAL-3 vist sig at være en ny bindingspartner til -catenin [52].

Disse resultater tyder på, at den anti-apoptotiske rolle af GAL -3 også kan medieres gennem aktivering af NF-KB og Wnt/-catenin-veje. GAL-3 ser ud til at forbinde disse pro-overlevelsessignaltransduktionsveje, der er undersøgt i vores undersøgelse. Disse veje har også krydstale mellem dem på forskellige niveauer. Wnt/-catenin pathway-spillere modulerer mange af deres effekter gennem interaktion med NF-KB, og gensidigt påvirker NF-KB også Wnt/-catenin signalvejen [53]. Derfor er det forståeligt, at GAL-3 spiller en central forbindelsesrolle i prosurvival-signaltransduktionsvejene.

Vores undersøgelse viser, at tilstedeværelsen eller fraværet af intracellulær GAL-3 er forbundet med signifikante ændringer i proapoptotiske, pronekroptotiske og prosurvival-proteiner i cisplatin-induceret ATN, og at de høje niveauer af GAL-3 i nyretubuli er medierende et anti-apoptotisk, antinekroptotisk og prosurvival miljø, der kan forme det fremtidige sygdomsforløb. Dette tyder på en beskyttende rolle for GAL-3 i akut cisplatin-induceret ATN, som understøttes af signifikant lavere plasmaniveauer af urinstof og kreatinin i GAL-3 vilde cisplatin-behandlede mus end GAL-3 KO-cisplatin-behandlede mus (fig. 13).

Konklusion

GAL-3 kan påvirke celleoverlevelse og død gennem dets interaktion med nekroptotiske, apoptotiske og pro-overlevelsesproteiner i renale tubuli under cisplatin-induceret akut tubulær nekrose.

Anerkendelser

Forfatterbidrag

Alle forfattere har gennemgået og godkendt den indsendte version af manuskriptet. SA introducerede konceptet, designede undersøgelsen, analyserede og fortolkede dataene, designede figurerne og skrev papiret. GJ udførte dyreforsøg og ELISA teknik, MS udførte immunhistokemisk og immunfluorescerende farvning og relateret vævsbehandling. HT udførte dyreforsøg og ELISA-teknik. JY udførte en biokemisk analyse af nyrefunktionen og indsendte de resulterende data.

Oplysningserklæring

Forfatterne erklærer ikke at have nogen konkurrerende interesser.

Referencer

1 Lameire NH, Bagga A, Cruz D, De Maeseneer J, Endre Z, Kellum JA, Liu KD, Mehta RL, Pannu N, Van Biesen W, Vanholder R: Akut nyreskade: en stigende global bekymring. Lancet 2013;382:170-179.

2 KDIGO: Retningslinjer for klinisk praksis for akut nyreskade. Nyre Int 2012;2:1–138.

3 Schumer M, Colombel MC, Sawczuk IS, Globe G, Connor J, O'Toole KM, Olsson CA, Wise GJ, Buttyan R: Morfologiske, biokemiske og molekylære beviser for apoptose under reperfusionsfasen efter korte perioder med nyreiskæmi Am. J Pathol 1992;140:831-838.

4 Schumer AT, Davies DR, McLaren AJ, Cerundolo L, Morris PJ, Fuggle SV: Apoptose ved iskæmi/reperfusionsskade af humane nyre-allotransplantater. Transplantation 1998;66:872-876.

5 Degterev A, Huang Z, Boyce M, Li Y, Jagtap P, Mizushima N, Cuny GD, Mitchison TJ, Moskowitz MA, Yuan J: Kemisk inhibitor af nonapoptotisk celledød med terapeutisk potentiale for iskæmisk hjerneskade. Nat Chem Biol 2005;1:112-119.

6 Vandenabeele P, Galluzzi L, Vanden Berghe T, Kroemer G: Molekulære mekanismer for nekroptose: en ordnet cellulær eksplosion. Nat Rev Mol Cell Biol 2010;11:700-714.

7 Chen X, Li W, Ren J, Huang D, He WT, Song Y, Yang C, Li W, Zheng X, Chen P, Han J: Translokation af blandet lineage kinase domæne-lignende protein til plasmamembran fører til nekrotisk celle død. Cell Res 2014;24:105-121.

8 Cai Z, Jitkaew S, Zhao J, Chiang HC, Choksi S, Liu J, Ward Y, Wu LG, Liu ZG: Plasmamembrantranslokation af trimeriseret MLKL-protein er påkrævet for TNF-induceret nekroptose. Nat Cell Biol 2014;16:55-65.

9 Wang Y, Liu Y, Liu Y, Zhou W, Wang H, Wan G, Sun D, ​​Zhang N, Wang Y: Et polymert prodrug af cisplatin-baseret på pullulan til målrettet behandling mod hepatocellulært karcinom. Int J Pharm 2015;483:89–100.

10 Pablo N, Dong Z: Cisplatin nefrotoksicitet: mekanismer og genbeskyttende strategier. Nyre Int 2008;73:994-1007.

11 Mi XJ, Hou JG, Wang Z, Han Y, Ren S, Hu JN, Chen C, Li W: Maltols beskyttende virkning på cisplatin-induceret nefrotoksicitet gennem AMPK-medierede PI3K/Akt og p53 signalveje. Sci Rep 2018;8:15922.

12 Ozkok A, Edelstein CL: Patofysiologi af cisplatin-induceret akut nyreskade. Biomed Res Int 2014;2014:1–17.

13 Hughes RC: Sekretion af galectinfamilien af ​​kulhydratbindende proteiner fra pattedyr. Biochim Biophys Acta 1999;1473:172-185.

14 Liu FT, Patterson RJ, Wang JL: Intracellulære funktioner af galectiner. Biochim Biophys Acta 2002;1572:263- 273.

15 van den Brûle FA, Waltregny D, Liu FT, Castronovo V: Ændring af det cytoplasmatiske/nukleære ekspressionsmønster af galectin-3 korrelerer med prostatacarcinomprogression. Int J Cancer 2000;89:361-367.

16 Xue J, Gao X, Fu C, Cong Z, Jiang H, Wang W, Chen T, Wei Q, Qin C: Regulering af galectin-3-induceret apoptose af Jurkat-celler af både O-glycaner og N-glycaner på CD45. FEBS Lett 2013;587:3986-3994.

17 Matarrese P, Fusco O, Tinari N, Natoli C, Liu FT, Semeraro ML, Malorni W, Iacobelli S: Galectin-3-overekspression beskytter mod apoptose ved at forbedre celleadhæsionsegenskaber. Int J Cancer 2000;85:545- 554.

18 Oka N, Nakahara S, Takenaka Y, Fukumori T, Hogan V, Kanayama HO, Yanagawa T, Raz A: Galectin-3 hæmmer tumornekrosefaktor-relateret apoptose-inducerende ligand-induceret apoptose ved at aktivere Akt i human blære karcinomceller. Cancer Res 2005;65:7546-7553.

19 Hashmi S, Al-Salam S: Galectin-3 udtrykkes i myokardiet meget tidligt efter myokardieinfarkt. Cardiovasc Pathol 2015;24:213-223.

20 Zhang S, Li R, Dong W, Yang H, Zhang L, Chen Y, Wang W, Li C, Wu Y, Ye Z, Zhao X, Li Z, Zhang M, Liu S, Liang X: RIPK3 medierer renal tubulær epitelcelleapoptose ved endotoksin-induceret akut nyreskade. Mol Med Rep 2019;20:1613-1620.

21 Liyanage T, Ninomiya T, Jha V, Neal B, Patrice HM, Okpechi I, Zhao MH, Lv J, Garg AX, Knight J, Rodgers A, Gallagher M, Kotwal S, Cass A, Perkovic V: Verdensomspændende adgang til behandling for nyresygdom i slutstadiet: en systematisk gennemgang. Lancet 2015;385:1975-1982.

22 Turk B, Stoka V: Proteasesignalering ved celledød: caspaser versus cysteinkathepsiner. FEBS Lett 2007;581:2761–2767.

23 Pavlock GS, Southard JH, Starling JR, Belzer FO: Lysosomal enzymfrigivelse i hypodermisk perfunderede hundenyrer. Cryobiology 1984;21:521-528.

24 Werle B, Jülke B, Lah T, Spiess E, Ebert W: Cathepsin B-fraktion aktiv ved fysiologisk pH på 7,5 er af prognostisk betydning ved planocellulært karcinom i den menneskelige lunge. Br J Cancer 1997;75:1137-1143.

25 Wang C, Jiang Z, Yao J, Wu X, Sun L, Liu C, Duan W, Yan M, Sun L, Liu J, Zhang L: Deltagelse af cathepsin B i emodin-induceret apoptose i HK -2 Celler. Toxicol Lett 2008;181:196-204.

26 Suzuki C, Tanida I, Ohmuraya M, Oliva Trejo JA, Kakuta S, Sunabori T, Uchiyama Y: Mangel på Cathepsin D i de renale proksimale tubulære celler resulterede i øget følsomhed mod nyreiskæmi/reperfusionsskade. Int J Mol Sci 2019;20:1711.

27 Lameire N, Van Biesen W, Vanholder R. Akut nyresvigt. Lancet 2005;365:417-430.

28 Yu W, Chen Y, Dubrulle J, Stassi F, Putluri V, Sreekumar A, Putluri N, Baluya D, Lai SY, Sandulache VC: Cisplatin genererer oxidativ stress, som er ledsaget af hurtige skift i det centrale kulstofmetabolisme. Sci Rep 2018;8:4306.

29 Aydinoz S, Uzun H, Cermiketal G: Effekter af forskellige doser hyperbar oxygen på cisplatin-induceret nefrotoksicitet. Nyresvigt 2007;29:257–263.

30 Siddik ZH: Cisplatin: cytotoksisk virkning og molekylær basis for resistens. Oncogene 2003;22:7265-7279.