Del 1: Effekten af ​​Acteosid som en cellebeskytter til at producere en klonet hund

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1, Eun Young Kim1, Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1, Kil Woo Han1, Kang-Sun Park1, Kyung-Bon Lee2, Min Kyu Kim1*

1 Division of Animal & Dairy Science, College of Agriculture and Life Science, Chungnam National University, Daejeon, Republikken Korea,

2 Institut for Biologisk Uddannelse, Pædagogisk Højskole,Chonnam National University, Gwangju, Republikken Korea

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Venligst klik her til del 2

Abstrakt

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) er en velkendt laboratorieteknik. Princippet i SCNT involverer omprogrammering af en somatisk kerne ved at injicere en somatisk celle i en recipient-oocyt, hvis kerne er blevet fjernet. Derfor betragtes kernedonorcellerne som en afgørende faktor i SCNT. Cellecyklussynkronisering af kernedonorceller på G0/G1-stadiet kan induceres ved kontaktinhibering eller serumsult. I dette studie,akteosid, en phenylpropanoid glycosidforbindelse, blev undersøgt for at bestemme, om den er anvendelig til at inducere cellecyklussynkronisering, cytobeskyttelse og forbedring af SCNT-effektivitet i føtale fibroblaster fra hunde. Primære hundeføtale fibroblaster blev behandlet medakteosid(10, 30, 50 μM) i forskellige tidsperioder (24, 48 og 72 timer). Cellecyklussynkronisering på G0/G1-stadiet afveg ikke signifikant med induktionsmetoden:akteosidbehandling, kontakthæmning eller serumsult. Men af ​​disse tre behandlinger resulterede serumsult i et signifikant øget niveau af reaktive oxygenarter (ROS) (99,5 ± 0,3 procent) og apoptose. Det viste resultaterne ogsåakteosidreducerede ROS- og apoptoseprocesser inklusive nekrose i hundeføtale fibroblaster og forbedret celleoverlevelse. Hundeføtale fibroblaster behandlet medakteosidblev arresteret på G0/G1-stadiet. Desuden producerede de rekonstruerede embryoner under anvendelse af kernedonorceller behandlet med acteosid en sund klonet hund, men ikke de embryoner, der blev produceret under anvendelse af kernedonorceller udsat for kontaktinhibering. Afslutningsvis,akteosidinduceret cellecyklussynkronisering af kernedonorceller ville være en alternativ metode til at forbedre effektiviteten af ​​hunde-SCNT på grund af dets cytobeskyttende virkninger.

Cistanche acteosid kan forbedre immuniteten

Introduktion

SCNT teknik er blevet brugt til at producere genetisk overlegne eller manipulerede dyr til landbrugsformål og som biomedicinske ressourcer. Med det stigende behov for dyremodeller af sygdom, redning af dyr i fare for udryddelse, stamceller til regenerativ medicin, organtransplantation osv., har interessen for kloning af dyr ved hjælp af SCNT været stigende i nyere tid [1-5]. Selvom produktionen af ​​klonede dyr har været vellykket, er effektiviteten af ​​SCNT stadig meget lav [6]. Årsagerne til den lave SCNT-embryoudviklingskompetence omfatter mange faktorer, der er relateret til kvaliteten af ​​recipientoocytter, kvaliteten af ​​kernedonorcellerne og surrogatmoderens tilstand [7-10].

Reaktive oxygenarter (ROS) og apoptose har været kendt for at være involveret i kvindelige reproduktionsprocesser, herunder oocytudvikling in vivo og in vitro [11-14]. ROS afbryder embryoudvikling ved at inducere cytoplasmatisk kondensation, DNA-skade og apoptose i embryoner. Understøttende undersøgelser har rapporteret, at reduktion af ROS forbedrer SCNT embryoudviklingskompetence under in vitro kultur [15-17]. Apoptose er en fysiologisk proces, der opstår spontant under normal præimplantations-embryoudvikling for at opretholde cellulær homeostase ved at fjerne DNA-beskadigede/fejlfungerende celler. ROS forårsager DNA-fragmentering og øger apoptotiske blastomerer, der forstyrrer embryoudvikling. Hændelsen af ​​ROS og apoptose observeres oftere efter SCNT end efter in vitro fertilisering [18, 19]. Mange undersøgelser rapporterede, at SCNT embryoudviklingskompetence reddes ved at reducere niveauerne af ROS og apoptose ved at bruge antioxidanter såsom selen [20], insulin-transferrin-selen [17, 21], melatonin [22] og glutathion [23].

Tidligere undersøgelser rapporterede, at brugen af ​​donorceller arresteret på G{{0}}/G1-stadiet forbedrede effektiviteten af ​​SCNT [7, 9, 24-28]. Kromatinet i donorcellerne på G0/G1-stadiet er blevet betragtet som det mest effektive til SCNT-embryoudviklingskompetence. For at synkronisere donorcellecyklussen er kontakthæmning, serumsult og kemiske behandlinger blevet brugt hyppigt [7, 25, 29, 30]. Serumsult reducerede imidlertid celleoverlevelse og øger DNA-fragmentering, hvilket fører til apoptose [31]. Kemisk hæmning er en anden strategi til at standse cellecyklussen på G0/G1-stadiet ved hjælp af inhibitorer såsom roscovitin [29, 32], dimethylsulfoxid (DMSO) [33] og cycloheximid (CHX) [34]. Effektiviteten af ​​den metode, der anvendes til synkronisering, påvirkes af donorcellernes typer og arter. For optimal donorcellesynkronisering skal forskellige aspekter af de anvendte metoder omhyggeligt evalueres.

Acteosid(også kendt som verbascoside) [{{0}}(3, 4-dihydroxyphenylethyl)-1-OaL-rhamnopyranosyl-(1/3)-bD-({{13} }O-caffeoyl)-glucopyranosid] er isoleret fra de violette blomster af Syringa vulgaris. Planter, der indeholder acteosid, har været kendt for at have antimikrobielle og anti-svampeaktiviteter [35-37] og forhindre inflammation. Faktisk udviser acteosid forskellige biologiske aktiviteter in vitro og in vivo, såsom antioxidativ aktivitet, anti-apoptotisk aktivitet, cytotoksicitet mod forskellige tumorceller og cellecyklussynkronisering på G0/G1-stadiet som en cyclin-afhængig kinase (CDK) hæmmer [38]. For eksempel Lee et al.[38] rapporteret, at acteosidbehandling kan hæmme proliferationen af ​​humane promyelocytiske HL-60-leukæmiceller ved at inducere cellecyklusstandsningen på G0/G1-stadiet. Effekten af ​​acteosid-behandlede donorceller på effektiviteten af ​​hunde SCNT er endnu ikke undersøgt.

I denne undersøgelse er virkningerne afakteosidpå cellecyklussynkronisering, ROS ogapoptosepå hundeføtale fibroblaster blev undersøgt. Analysen af ​​cellecyklussynkronisering, ROS og apoptose blev udført ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). For at demonstrere effektiviteten af ​​donorcellerne behandlet med acteosidet blev SCNT-embryoner dyrket og overført til en modtagerhund og produceret med succes en sund klonet hund.

cistanchekan behandlenyresygdom forbedresnyrefungere

Materialer og metoder

Etikerklæring

I denne undersøgelse blev 44 hun-blandingshunde (i alderen 1-6 år) brugt som oocytdonorer og embryooverførselssurrogater, og en hunbeagle (i alderen 2 år) blev brugt til etablering af føtale fibroblastcellelinjer. Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Chungnam National University (godkendelsesnummer: CNU-00487) og udført i henhold til "The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" udgivet af IACUC fra Chungnam National University. Hunde blev opdrættet indendørs i separate bure med et temperatur- og ventilationskontrolsystem. Hunde blev fodret med en kommerciel diæt én gang dagligt og gav vand ad libitum. I alle dyreforsøg blev hunde indledningsvis bedøvet med 6 mg/kg ketamin og xylazin og holdt i bedøvet tilstand med 2 procent isofluran. Ved afslutningen af ​​operationen blev antibiotika (Procaine Penicillin G, Benzathine Penicillin G og Dihydrostreptomycin sulfat) administreret for at forhindre enhver infektion. Efter operationen blev hundene overført til deres egne individuelle bure med ferskvand, overvåget og ydet særlig pleje fra den ansvarlige dyrlæge, så nødvendige behandlinger kunne gives, hvis dyrene havde brug for det.

Kemikalier

Alle kemikalier blev købt fra Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), medmindre andet er angivet. Acteosid blev opnået fra Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. i Kina.

Isolering af hundeføtale fibroblaster

Hundeføtale fibroblaster blev opnået fra {{0}}dage gamle fostre. Kort fortalt blev en hun-beagle kunstigt insemineret med sæd fra en han-beagle. Efter 28 dage blev graviditet hos hunbeagle bekræftet, og 5 fostre blev opnået ved celiohysterektomi. Fostre blev vasket tre gange i phosphatbufret saltvand (PBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA). Hovedet, indre organer og lemmer af fostrene blev fjernet med et kirurgisk blad, og de resterende kropsdele blev hakket i PBS. Stykker af fostre blev vasket to gange ved centrifugering ved 400 × i 5 minutter og dyrket i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Gibco) suppleret med 1 procent penicillin-streptomycin (produktnr. P4458) og 20 procent føtalt bovint serum (FBS; Gibco) ved 39 grader i en befugtet atmosfære på 5 procent CO2 og 95 procent luft. Når celler nåede sammenløb efter 5-7 dage, blev de behandlet med 0,25 procent trypsin-EDTA (Gibco) i 2 minutter og høstet. To hunde føtale fibroblastcellelinjer blev etableret fra to individuelle fostre. Cellerne blev frosset i 10 procent DMSO i FBS og opbevaret i flydende nitrogen ved -196 grad, indtil de blev brugt.

Cellebehandling

De frosne hundefibroblaster blev optøet og dyrket indtil 80 procent konfluens. Celler blev høstet og passeret 4 til 7 gange til efterfølgende eksperimenter. Celler blev podet ved en koncentration på 106/ml i 60 mm kulturskåle. Cellerne blev dyrket i (1) DMEM suppleret med 10 procent FBS og 1 procent penicillin-streptomycin i fem dage (kontakthæmning), (2) DMEM suppleret med 0,5 procent FBS og 1 procent penicillin-streptomycin i fem dage (serumsult) , eller (3) DMEM suppleret med 10 procent FBS og 1 procent penicillin-streptomycin indeholdende acteosid ved 10 μM, 30 μM eller 50 μM i 24 timer, 48 timer og 72 timer (acteosidbehandling).

Cellecyklusanalyse ved flowcytometri

Til analyse af cellecyklusstadierne blev celler høstet under anvendelse af {{0}}.25 procent trypsin-EDTA og vasket 3 gange med PBS ved centrifugering. Efter den sidste vask blev supernatanterne kasseret, og cellerne resuspenderet i 0,3 mL PBS. Til fiksering blev {{10}},7 mL kold absolut ethanol tilsat dråbevist til cellesuspensionen, blandet ved forsigtig vortexing og opbevaret natten over ved 4 grader. De fikserede celler blev centrifugeret og vasket to gange med kold PBS. Cellerne blev resuspenderet i 0,25 mL PBS suppleret med 5 μL 10 mg/mL RNase og inkuberet i 1 time ved 37 grader. Derefter blev 10 μL 1 mg/ml propidiumiodid (PI) tilsat. Cellecyklus blev analyseret ved kvantificering af DNA-indhold i cellepopulationer ved G0/G1 (2n), S (mellem 2n og 4n) og G2/M (4n) faser ved hjælp af et FACS Calibur flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA , USA).

ROS-detektion ved flowcytometri

ROS i levende celler blev vurderet ved hjælp af et Image-iT™ Live Green Reactive Oxygen Species Detection Kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Kort fortalt blev celler vasket i PBS efter fjernelse af dyrkningsmediet, og 2 ml af 100 μM tert-butylhydroperoxid (TBHP) arbejdsopløsning blev tilsat. Efter inkubation ved 37 grader i 1 time blev TBHP-arbejdsopløsningen fjernet, og cellerne blev forsigtigt vasket 3 gange i varmt Dulbeccos phosphatpufret saltvand (DPBS; Gibco). Celler blev derefter inkuberet i 25 μM 5-(og-6)-carboxy-2,7-dichlordihydro-fluoresceindiacetat (carboxy-H2DCFDA) arbejdsopløsning ved 37 grader i 30 minutter i mørke . Ved oxidering udsender carboxy-H2DCFDA grøn fluorescens, hvilket letter vurderingen af ​​ROS ved flowcytometri. TBHP, som er en inducer af ROS-produktion, blev brugt som en positiv kontrol. Cellernes kerner blev farvet med Hoechst 33342. Efter vask 3 gange med PBS blev cellerne høstet ved trypsinisering, suspenderet i PBS og brugt til påvisning af ROS ved anvendelse af et FACS Calibur flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA ). Hastigheden af ​​ROS-dannelse blev beregnet ved at dividere antallet af ROS-positive celler med det samlede celleantal og konvertere værdierne til procenter.

Apoptoseanalyse ved flowcytometri

Apoptoseanalyse blev udført under anvendelse af et Vybran1 Apoptosis Assay Kit #2 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Kort fortalt blev cellerne høstet ved trypsinisering og vasket 2 gange med kold PBS. Derefter blev 100 μL 1 x annexinbindende buffer, 5 μL Alexa Fluor 488 annexin V og 1 μL PI tilsat til cellerne. Efter inkubation i 15 minutter ved stuetemperatur blev 400 μL 1 x annexin-bindende buffer tilsat, og cellesuspensionen blev forsigtigt blandet. Annexin V, som er et Ca2 plus-afhængigt phospholipid-bindende protein, har en høj affinitet for phosphatidylserin (PS). I levende celler er PS placeret på den indre cytoplasmatiske membran og translokeret til den ydre cytoplasmatiske membran i apoptotiske celler. Apoptotiske celler skelnes af Annexin V mærket med Alexa Fluor 488, der binder til PS på den ydre membran. Derudover farver PI, som er et nukleinsyrebindende farvestof, nekrotiske celler med rød fluorescens. Derfor blev apoptotiske celler med grøn fluorescens, nekrotiske celler med rød fluorescens og levende celler med ringe eller ingen fluorescens i cellerne analyseret ved hjælp af et FACS Calibur flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Satserne blev beregnet ved at dividere celleantallet af levende, nekrotiske eller apoptotiske celler med det samlede celleantal og konvertere de beregnede værdier til procenter.

Indsamling af in vivo modnede oocytter

For at påvise ægløsning hos hver hund blev serumprogesteron (P4)-koncentrationen målt ved hjælp af et DSL-3900ACTIVE progesteron-coated tube Radioimmunoassay Kit (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX, USA). Som tidligere beskrevet [39, 40] blev dagen, hvor P4-koncentrationen oversteg 4 ng/ml, betragtet som ægløsningsdagen. 72 timer efter ægløsning blev oocytter udvundet ved laparotomi under anvendelse af aseptiske kirurgiske procedurer. Oviduktens fimbria blev nærmet gennem bursal-spalten og kanyleret under anvendelse af en omvendt flangeformet stålnål (18 gauge, 7,5 cm). Et 24 gauge intravenøst ​​(IV) kateter (Angiocath™ Plus, Becton Dickison Korea Inc., Seoul, Korea) blev indsat i isthmus af æggelederen nær den uterotubale forbindelse, og medium 199 (Gibco) suppleret med 1 procent penicillin-streptomycin og 5 procent FBS blev indført i æggelederen gennem IV-kateteret. Oocytter blev straks transporteret til laboratoriet. I alt 316 oocytter blev indsamlet fra 31 hunde.

Somatisk cellekerneoverførsel og embryooverførsel SCNT blev udført som tidligere beskrevet [39]. Kort fortalt blev cumulus-oocyt-komplekser (COC) gentagne gange pipetteret i 0,1 procent hyaluronidase for at fjerne cumulusceller fra in vivo-modnede oocytter. Det første polære legeme og metafase-II kromosomer blev fjernet ved aspiration. Enucleation blev bekræftet ved farvning med Hoechst 33342 (bisbenzimid). Hundeføtale fibroblaster blev behandlet med 30 μM acteosid i 48 timer og derefter høstet med 0,25 procent trypsin-EDTA. En enkelt celle, som har en glat cellemembran, blev overført til perivitellinerummet af hver enucleeret oocyt. Kupletterne var ækvilibreret infusionsmedium, som er 0.26 M mannitolmedium indeholdende 0.1 mM HEPES, 0,5 mM MgSO4 og 0,05 procent BSA, og fusioneret af to pulser jævnstrøm (69–75 V i 15 μs) fra et elektrocellefusionsapparat (NEPA gene Co., Chiba, Japan). Disse coupletter blev inkuberet i medium 199 suppleret med 10 procent FBS i 1 time og 30 minutter. De fusionerede SCNT-embryoner blev kontrolleret, og kemisk aktivering blev induceret ved at inkubere dem i 10 μM calciumionofor (produktnr. C7522, Sigma) i 4 min. SCNT-embryoner blev vasket og derefter anbragt i et modificeret syntetisk æggeledervæskemedium (mSOF) [41] indeholdende 1,9 mM 6-dimethylaminopurin (6-DMAP) i 3 timer og 30 min. De konstruerede embryoner blev kirurgisk overført til ovidukterne af brunstsynkroniserede surrogater inden for 4 timer efter SCNT. Graviditet blev bekræftet ved ultralyd 26 dage (tidligst) efter embryooverførsel.

aktiv ingrediensakteosidicistanche

In vitro kultur af klonede embryoner

Efter SCNT blev klonede embryoner dyrket i 40 μL mikrodråber af et modificeret syntetisk oviductal fluid medium (mSOF) (10 klonede embryoner pr. mikrodråbe) overlejret med mineralolie ved 38,5 grader i 5 procent CO2 og 95 procent luft. SCNT embryoudvikling blev observeret fra dag 2 til dag 8.

Mikrosatellit- og mitokondrie-DNA-analyse af en klonet hund

Total DNA blev ekstraheret fra de nukleare donorceller og huden på oocytdonorhundene, surrogathundene og den klonede hund med G-spin™ Genomic DNA Extraction Kit (intRON BIOTECHNOLOGY, Seongnam, Korea) i henhold til producentens retningslinjer, og blev derefter elueret i 100 μL TE-buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). Mængden af ​​DNA blev målt med BioSpec-nano Spectrophotometer (Shimadzu Corp., Japan).

Til mikrosatellit-genotypning blev følgende 7 specifikke gener udvalgt: PEZ1, PEZ3, PEZ8, PEZ12, FH2010, FH2054 og FH2079. PCR blev udført med indledende denaturering i 10 minutter ved 95 grader, 20 cyklusser bestod af denaturering i 30 sekunder ved 95 grader, 30 sekunders annealing ved 58 grader (-0.1 grad/cyklus), 1 minuts forlængelse kl. 72 grader og 15 flere cyklusser bestående af denaturering i 30 sekunder ved 95 grader, 30 sekunders annealing ved 56 grader, 1 minuts forlængelse ved 72 grader og endelig forlængelse ved 72 grader i 10 minutter.

Til mitokondriel DNA-sekventering, under anvendelse af de komplette nukleotidsekvenser af mtDNA fra hunde (GenBank accessionsnr.: U96639), blev følgende oligonukleotidprimere syntetiseret: Cytokrom b-region (L14,252 –L14,631) F: ACTCATTCATTCATTGACCATCATCCATCCAGGGATAGGAGGACCAGTTCCAGCCAGGG; Cytokrom c-oxidase-underenhed II (L7,054—L7,465) F: ATGGCGTACCCATTTCAACT,R: GGATGGTTATTTCTATTGG; 16S rRNA (L2,033 –L2,472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT,R: AGGACTTTAATCGTTGAAC; D-loop region (L15,622 – L16,030) F: CATAGGACATATTAACTCAATC,R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]. PCR-cyklusserne for denne analyse inkluderede: 95 graders indledende denatureringer i 5 minutter, 5 cyklusser af denaturering i 30 sekunder ved 95 grader, 40 sekunders annealing ved 60 grader (-1 grad/cyklus), 1 minuts forlængelse kl. 72 grader og de næste 30 denatureringscyklusser i 30 sekunder ved 95 grader, 40 sekunders annealing ved 55 grader, 1 minuts forlængelse ved 72 grader og endelig forlængelse ved 72 grader i 10 minutter. PCR-fragmenter fra de forskellige eksperimenter blev analyseret under anvendelse af en ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc., USA). Sekvenssamling, flere justeringer og justeringstrimning for kontrolområder blev udført med BioEdit-softwaren (v.7.0.5.3).

akteosidicistanchekan styrke immunforsvaret