Del 1: Echinacosid hæmmer glutamatfrigivelse ved at undertrykke spændingsafhængig Ca2 plus indgang og proteinkinase C i cerebrokortikale nerveterminaler hos rotter
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 og Su Jane Wang 3,*
Abstrakt:
Det glutamaterge system kan være involveret i virkningerne af neurobeskyttende terapier.Echinacoside, et phenylethanoid glycosid udvundet af den medicinske kinesiske urtHerba Cistanche, har neurobeskyttende virkninger. Denne undersøgelse undersøgte virkningerne afechinacosidepå 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse i rotte cerebrocorticale nerveterminaler (synaptosomer). Echinacosid hæmmede Ca2 plus-afhængig, men ikke Ca2 plus-uafhængig, 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse på en koncentrationsafhængig måde. Echinacosid reducerede også den 4-aminopyridin-fremkaldte stigning i cytoplasmatisk fri Ca2 plus koncentration, men ændrede ikke det synaptosomale membranpotentiale. Den hæmmende effekt af echinacosid på 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse blev forhindret af o-conotoxin MVIIC, en bredspektret blokering af Cav2.2 (N-type) og Cav2.1 (P/Q-type) kanaler , men var ufølsom over for de intracellulære Ca2 plus frigivelseshæmmere dantrolen og 7-chlor-5-(2-chlorphenyl)-1,5-dihydro-4 ,1-benzodiazepin-2(3H)-on (CGP37157). Desuden reducerede echinacosid den 4-aminopyridin-inducerede phosphorylering af proteinkinase C, og proteinkinase C-hæmmere ophævede effekten af echinacosid på glutamatfrigivelsen. Ifølge disse resultater foreslår vi, at den hæmmende virkning af echinacosid på fremkaldt glutamatfrigivelse er forbundet med reduceret spændingsafhængig Ca2 plus-indgang og efterfølgende undertrykkelse af proteinkinase C-aktivitet.
Nøgleord:echinacoside; frigivelse af glutamat; cerebrokortikale nerveterminaler; spændingsafhængige Ca2 plus-kanaler; proteinkinase C
1. Introduktion
Echinacosideer et væsentligt phenylethanoid glycosid til stede iHerbaCistanche, en velkendt traditionel kinesisk medicin, der bruges til at behandle glemsomhed, impotens og kronisk forstoppelse [1].Echinacosidebesidder forskellige bioaktiviteter såsom antioxidation, anti-inflammation, anticancer, hepatobeskyttelse og immunmodulation [2-4]. Især har echinacosid neurobeskyttende virkninger; for eksempel kan det beskytte mod oxidativ stress- eller neurotoksin-induceret neurotoksicitet i primære rotte corticale neuroner, humane neuroblastom SH-SY5Y celler og pheochromocytoma (PC12) celler [5-8]. Desuden dæmper echinacosid hjerneskade og forbedrer kognitiv funktion i dyremodeller af Parkinsons sygdom, Alzheimers sygdom og okklusion af den midterste cerebrale arterie [9-12]. Men den mekanisme, hvorigennemechinacosideinducerer neurobeskyttelse er ikke fuldt ud forstået.
Neurobeskyttelse er en kompleks proces til at bevare neuronal struktur og funktion ved giftige fornærmelser. Reduktion af glutamat excitotoksicitet betragtes som en potentiel mekanisme involveret i hjernens neurobeskyttelse. Glutamat, en excitatorisk aminosyre-neurotransmitter, har en afgørende rolle i flere hjernefunktioner [13]. Imidlertid forårsager overaktivering af glutamatreceptorer under høje glutamatkoncentrationer intracellulær Ca2 plus overbelastning, mitokondriel dysfunktion, frie radikaler produktion og neuronal død [14,15]. Denne patologiske proces er impliceret i adskillige hjernesygdomme, herunder cerebral iskæmi, traumatisk hjerneskade, epilepsi og neurodegenerativ sygdom [16,17]. Derfor betragtes inhibitorer, der blokerer patofysiologisk glutamatergisk transmission, som potentielle neurobeskyttende lægemidler. Bemærkelsesværdige eksempler på disse er glutamatreceptorantagonister [18,19]; dog er kliniske forsøg med disse lægemidler mislykkedes på grund af mindre effektivitet og uønskede eller endda cytotoksiske bivirkninger [20,21]. Ud over direkte glutamatreceptorblokade kan inhibering af glutamatfrigivelse være en effektiv strategi til neurobeskyttelse. Adskillige neurobeskyttende midler (f.eks. memantin og riluzol) kan reducere glutamatfrigivelse i rottehjernevæv [22-24].
I betragtning af glutamats rolle i excitotoksicitet og den neurobeskyttende profil af echinacosid, brugte denne undersøgelse isolerede nerveterminaler (synaptosomer) renset fra rottens cerebrale cortex til at undersøge effekten af echinacoside på glutamatfrigivelse og yderligere udforskede potentielle mekanismer. Det isolerede nerveterminalpræparat er en veletableret model til at studere den præsynaptiske regulering af neurotransmitters frigivelse af lægemidler i fravær af postsynaptiske effekter [25]. Ved at bruge denne model evaluerede vi effekten af echinacosid på glutamatfrigivelse, membranpotentiale, præsynaptisk Ca2 plus tilstrømning og proteinkinase C-aktivitet. Ifølge vores gennemgang af litteraturen er dette den første rapport, der dokumenterer den mekanisme, hvorigennem echinacosid hæmmer endogen glutamatfrigivelse på præsynaptisk niveau.
2. Resultater
2.1. EchinacosideHæmmer 4-Aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse fra rotte-cerebrokortikale nerveterminaler ved at reducere vesikulær eksocytose
Figur 1 illustrerer den koncentrationsafhængige effekt af echinacosid på 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse fra rensede cerebrokortikale synaptosomer fra rotter. I synaptosomer inkuberet med 1 mM CaCl2 fremkaldte 1 mM 4-aminopyridin en glutamatfrigivelse på 7,4 ± {{1{{20}}}}.1 nmol/mg/5 min., som blev reduceret med 1, 5, 10, 30 og 50 uM echinacosid til 6,5 ± 0,2, 5,8 ± 0,3, 4,8 ± 0,2,
4,1 ± 0,1 eller 2,3 ± 0,4 nmol/mg/5 min, henholdsvis (F(5,24)=67.1, p=0. 000). IC50-værdien for echinacosid-medieret inhibering af 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse, afledt af en dosis-respons-kurve, var 24 uM. Desuden er glutamatfrigivelsen fremkaldt af 1 mM 4-aminopyridin i en ekstracellulær Ca2 plus-fri opløsning indeholdende 300 uM ethylenglycol bis(-aminoethylether)-N,N,N/,N/-tetraeddikesyre (EGTA) var 2.1 0.2 nmol/mg/5 min (F(2,12)=310.65, p=0.000),
og denne Ca2 plus-uafhængige komponent af 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse var upåvirket af 20 uM echinacosid (1,8 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p {{1 0}}.58; figur 1). I synaptosomer behandlet med 0,1 uM bafilomycin A1, en vesikulær transportørhæmmer [26], blev 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse reduceret signifikant (2,2 ± 0,2 nmol/mg/ 5 min; F (2,12)=249.518, s=0.000). I nærvær af bafilomycin A1 kunne 20 uM echinacosid ikke signifikant hæmme frigivelsen af glutamat (2,1 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p=0.94; figur 1). I modsætning hertil øgede 10 uM DL-threo-beta-benzyl-oxyaspartat (DL-TBOA, en glutamatgenoptagelseshæmmer) [27], 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse til 11,8 ± 0,4 nmol/mg/5 min ( t(8)=-11.31, s=0.000). Selv i nærvær af DL-TBOA hæmmede 20 uM echinacosid 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse signifikant (7,7 ± 0,2 nmol/mg/5 min; F(2,12)=87.23, p.=0.000; Figur 1).
2.2 Echinacosid reducerer cytosolisk Ca2 plus koncentration, men ændrer ikke synaptosomale membranpotentiale
Synaptosom-depolarisering forårsaget af 1 mM 4-aminopyridin øgede Ca2 plus-koncentrationen (p=0.000; tabel 1). Anvendelsen af 20 uM echinacosid påvirkede ikke den basale Ca2 plus-koncentration signifikant (t(8)=0.06, p=0.95), men reducerede signifikant den 4-aminopyridin-inducerede stigning i Ca2 plus koncentration (t(10)=6.16, p=0.000). Derudover steg 1 mM 4-aminopyridin i 3',3',3'-dipropylthiadicarbocyanin iodid [DiSC3(5)] fluorescens (p=0.000). Tilsætningen af 20 uM echinacosid ændrede ikke hvilemembranpotentialet (t(8)=0.976, p=0.36) eller ændrede signifikant den 4-aminopyridin-medierede stigning i DiSC3 (5) fluorescens (t(8)=-0.014, p=0.99; Tabel 1).
2.3 Reduceret Ca2 plus tilstrømning gennem Cav2.2 (N-Type) og Cav2.1 (P/Q-Type) kanalerne kan være forbundet med inhibering af 4-Aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse af Echinacoside
Figur 2 viser, at 2 uM o-conotoxin MVIIC, en N- og P/Q-type Ca2 plus kanalblokker, reducerede 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse fra 7,4 ± {{10}}. 2 til 2.0 ± 0.1 nmol/mg/5 min (t(9)=25.35, p=0.000). I nærvær af o-conotoxin MVIIC var virkningen af 20 uM echinacosid på 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse ikke-signifikant (1,8 2± plus 0,2 nmol/mg/5 min; t(8)=1.06,s.=0.32). Dantrolene (10 uM), en inhibitor af intracellulær Ca-frigivelse fra endoplasmaet
reticulum [28], reduceret 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse (5,6 ± 0,3 nmol/mg/5 min; F(2,14) {{10}}. 95, s=0.000). I nærvær af dantrolen kunne 20 uM echinacosid dog stadig inhibere glutamatfrigivelsen signifikant (3,3 ± 0,2 nmol/mg/5 min; p=0.000). Lignende resultater blev observeret ved anvendelse af 100 uM 7-chlor-5-(2-chlorpheny)-1,5-dihydro-4,1-benzothiazepin -2(3H)-on (CGP37157), en membrangennemtrængelig blokering af mitokondriel Na plus /Ca2 plus udveksling. I de fem undersøgte synaptosomale præparater reducerede 20 uM echinacosid kombineret med 100 uM CGP37157 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse med 48,3 procent ± 5,2 procent (F(2,13) = 136.79, p {{ 49}}.000), svarende til inhiberingen af echinacosid alene (46,2 procent ± 2,3 procent; p=0.89; figur 2).
2.4 EchinacosideHæmmer 4-Aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse ved at signalere gennem proteinkinase C
Som illustreret i figur 3, 10 uM 2-[1-(3-dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-3-(indol-3-yl)maleimid (GF109203X), en generel proteinkinase C-hæmmer [29], reduceret 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse (F(2,13) = 19.46, p=0.{{17 }}). I de GF109203X-behandlede synaptosomer reducerede 20 uM echinacosid 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse med kun 5,5 procent ± 1,8 procent (p=0,89), mindre end ved echinacosid alene (42,4 procent ± 2,3). procent ; p=0.000). Lignende resultater blev opnået med 5,6,7,13-tetrahydro-13-methyl-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pyrrolo[3 ,4-c]carbazol-12-propanenitril (Go6976), en selektiv for Ca2 plus-afhængige proteinkinase C isoformer (, I, II, y) [29]. I nærvær af 3 uM Go6976 reducerede 20 uM echinacosid glutamatfrigivelsen med 11,9 procent ± 2,9 procent (p=0.59), hvilket betyder en signifikant reduktion sammenlignet med den med echinacosid alene (42,4 procent 2,3 procent; p {{ 65}}.000; figur 3). I modsætning hertil ændrede 3 uM rottlerin, en Ca2 plus-uafhængig proteinkinase C6-hæmmer [30], ikke signifikant 4-aminopyridin (1 mM)-fremkaldt glutamatfrigivelse (p=0.45). Ikke desto mindre forårsagede 20 uM echinacosid i nærvær af rottlerin en gennemsnitlig hæmning på 37,1 procent ± 5,6 procent af frigivelsen (F(2,13) = 19.72, p=0.{{88 }}), svarende til den af echinacoside alene (s=0.41; figur 3). Derudover den mitogenaktiverede proteinkinasehæmmer 2-(2-amino-3-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-on) (PD98059 ) (50 uM) og proteinkinase A-hæmmeren N-[2-(p-bromocinnamylamino)ethyl]-5-isoquinolinsulfonamid (H89) (100 uM) reducerede 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse (s=0.000). Selv i nærvær af PD98059 eller H89 reducerede 20 uM echinacosid effektivt frigivelsen (F(2,13) = 52.3, p=0.000; figur 3).
Figur 4 viser, at 1 mM 4-aminopyridin øgede phosphoryleringen af proteinkinase C i synaptosomer (t(4)=-6.871, p=0.002). Når synaptosomer blev forbehandlet med 20 uM echinacosid i 10 minutter før tilsætning af 4-aminopyridin, faldt 4-aminopyridin-induceret phosphorylering af proteinkinase C betydeligt (F(2,6)=29.202 , s=0.001).
2.5 Echinacosid-medieret hæmning af glutamatfrigivelse involverer ikke en gamma-aminosmørsyre type A (GABAA) receptor
I figur 5 blev virkningen af echinacosid på 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse i fravær eller tilstedeværelse af SR95531 (en antagonist af GABAA-receptoren) sammenlignet. Derudover ændrede 100 uM SR95531 ikke signifikant 4-aminopyridin (1 mM)-fremkaldt glutamatfrigivelse. I de SR95531-behandlede synaptosomer resulterede påføring af 20 uM echinacosid i en 43 procent hæmning af 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse (F(2,12)=42.63, p { {18}}.000), som ikke var signifikant forskellig fra hæmningen produceret af echinacosid alene (40 procent ; p=0.000). Et lignende resultat blev opnået med en anden GABAA-receptorantagonist, bicucullin (50 uM). Frigivelsen målt i nærvær af bicucullin og echinacosid var signifikant forskellig fra den, der blev opnået i nærvær af bicucullin alene (p=0.000).
3. Diskussion
I dette studie,echinacoside, en aktiv forbindelse i HerbaCistanche, hæmmede 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse i rottens hjernebark-nerveterminaler. De mulige underliggende mekanismer forechinacoside-medieret inhibering af glutamatfrigivelse er yderligere undersøgt og diskuteret her.
3.1 Mekanismer, der ligger til grund for Echinacosid-medieret hæmning af glutamatfrigivelse
Glutamatfrigivelse fremkaldt af 4-aminopyridin omfatter to komponenter: en fysiologisk relevant Ca2 plus-afhængig komponent, som produceres gennem eksocytose af synaptiske vesikler indeholdende glutamat; og en Ca2 plus-uafhængig komponent, som stammer fra langvarig depolarisering, der forårsager et membranpotentialemedieret skift af glutamattransportørens steady-state mod udadgående retning, hvilket påvirker cytosolisk glutamatudstrømning [31]. Her observerede vi, at echinacosid ikke signifikant hæmmede 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse i nærværelse af et Ca2 plus-frit medium (Ca2 plus-uafhængig frigivelse). Ydermere blev den observerede echinacosid-medierede hæmning af 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse effektivt forhindret af bafilomycin A1 (som udtømmer glutamatindholdet i synaptiske vesikler), men ikke af DL-TBOA (som ikke-selektivt hæmmer al excitatorisk aminosyre transportør undertyper). Disse resultater tyder på, at echinacosid påvirker den Ca2 plus-afhængige exocytose af glutamatfrigivelse uden at påvirke den Ca2 plus-uafhængige cytosoliske effluks af glutamat gennem reversering af den nerveterminale plasmamembran glutamattransportør. I synaptiske terminaler stabiliserer Na plus kanal inhibering eller K plus kanal aktivering membran excitabilitet og reducerede følgelig den fremkaldte Ca2 plus indgang og neurotransmitter frigivelse [32,33]. Derfor involverer den potentielle mekanisme, der ligger til grund for echinacosid-medieret glutamatfrigivelsesinhibering, en reduktion i synaptosomal excitabilitet. Denne mulighed er imidlertid uholdbar på basis af to observationer: (1) 4-aminopyridin-fremkaldt membranpotentialedepolarisering, målt med det membranpotentialefølsomme farvestof DiSC3(5) var upåvirket af tilsætningen af echinacosid; og (2) echinacosid påvirkede ikke den 4-aminopyridin-fremkaldte Ca2 plus-uafhængige glutamatfrigivelse, en frigivelseskomponent, der kun afhænger af membranpotentialet [31]. Hvis effekten ikke er forårsaget af synaptosomal excitabilitetsundertrykkelse, kan den manifesteres gennem en reduktion i aktiviteten af Cav2.2 (N-type) og Cav2.1 (P/Q-type) Ca2 plus kanaler koblet med glutamat exocytose i nerveterminaler [34-36]. Ved at bruge fura-2 demonstrerer vi, at echinacosid signifikant reducerer den 4-aminopyridinfremkaldte stigning i Ca2 plus koncentration. Derudover viser vores data, at den hæmmende effekt af echinacosid på 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse faldt fra 42,4 procent 2,3 procent til 12,1 procent 3,9 procent efter eksponering for en blokker af Cav2.2 (N-type) og Cav2 .1 (P/Q-type) Ca2 plus kanaler. Desuden observerede vi, at echinacosid fortsatte med at inhibere 4-aminopyridin-fremkaldt glutamatfrigivelse signifikant i nærværelse af intracellulær Ca2 plus frigivelseshæmmere. Disse resultater indikerer, at den samtidige undertrykkelse af Cav2.2 (N-type) og Cav2.1 (P/Q-type) Ca2 plus kanalaktivitet er den potentielt mekanisme, der ligger til grund for echinacosid-medieret glutamatfrigivelsesinhibering. Imidlertid kunne den kombinerede aktivering af Cav2.2 (N-type) og Cav2.1 (P/Q-type) Ca2 plus kanalaktivitet ikke blokere virkningen af echinacoside fuldstændigt. Derfor kan andre uidentificerede typer af Ca2 plus-kanaler eller andre præsynaptiske veje være involveret i inhiberingen. For eksempel er GABAA-receptorer til stede på det præsynaptiske niveau, og deres aktivering har vist sig at hæmme Ca2 plus tilstrømning og glutamatfrigivelse [37]. I denne undersøgelse blokerede GABAA-receptorantagonisterne SR95531 og bicucullin ikke echinacosid-medieret hæmning af glutamatfrigivelse, hvilket tyder på, at GABAA-receptorer ikke er involveret i reduktionen af spændingsafhængig Ca2 plus-kanalaktivitet og i den efterfølgende hæmning af glutamatfrigivelse. Ca2 plus-indgang gennem spændingsafhængige Ca2 plus-kanaler aktiverer adskillige proteinkinaser forbundet med glutamatfrigivelse i nerveterminaler, herunder mitogenaktiveret proteinkinase, proteinkinase C og proteinkinase A. Her viser vi, at proteinkinase C-hæmmere effektivt antagoniserede echinacosidet -medieret inhibering af glutamatfrigivelse; ikke desto mindre var den mitogenaktiverede proteinkinaseinhibitor PD98059 eller proteinkinase A-inhibitoren H89 ineffektive. Ydermere faldt den 4-aminopyridin-inducerede phosphorylering af proteinkinase C i synaptosomer efter forbehandling med echinacosid i en koncentration, der er effektiv til at hæmme glutamatfrigivelse. Derfor kan signalvejen for den echinacosid-medierede glutamatfrigivelsesinhibering involvere proteinkinase C. Proteinkinase C er et vigtigt intracellulært signalsystem, der er til stede på det præsynaptiske niveau og har en afgørende rolle i neurotransmitters exocytose. For eksempel phosphoryleres adskillige synaptiske proteiner involveret i den synaptiske vesikelhandel eller rekruttering og exocytose, såsom det myristoylerede alaninrige C-kinasesubstrat, af proteinkinase C [38,39]. Denne phosphoryleringsproces kan øges ved depolarisationsstimuleret Ca2 plus-indgang, hvilket letter glutamatfrigivelse [40]. Derfor kan vi med rimelighed spekulere i, at den hæmmende effekt af echinacosid på Ca2 plus indgang observeret her kan reducere proteinkinase C-aktivitet og følgelig glutamatfrigivelse.
