Overvinde immundefekter med Allogrooming

Enkel oversigt:

Vi undersøgte, om to nært beslægtede termitarter adskiller sig i deres afhængighed af social eller individuel immunitet mod to arter af patogene svampe, som alle blev indsamlet fra samme sted. Vores resultater indikerer, at gensidig pleje (allogrooming) er yderst effektiv til at begrænse dødelige infektioner i det omfang, det kan kompensere for relativt svagt individuelt immunforsvar. Efter at patogener er stødt på, bruger termitter en alternativ strategi til social distancering og begrænsning af spredningen af ​​smitsomme sygdomme og går i stedet sammen for at rense hinanden. Variation i intensiteten af ​​denne adfærdsreaktion indikerer en nuanceret reaktion på trusselsniveauet.

cistanche supplement fordele-øge immunitet

Abstrakt:

Allogrooming ser ud til at være afgørende hos mange sociale dyr for beskyttelse mod rutinemæssig eksponering for parasitter. Hos sociale insekter ser det ud til at være afgørende for fjernelse af patogene propagula fra neglebåndet, før de kan starte en infektiøs cyklus. For underjordiske termitter omfatter dette svampesporer, der almindeligvis forekommer i jorden, såsom Metarhizium conidia, der hurtigt kan spire og trænge ind i neglebåndet. Vi undersøgte, om der er forskel i afhængighed af social og medfødt immunitet hos to nært beslægtede underjordiske termitter til beskyttelse mod dødelige infektioner af to lokalt stødte Metarhizium-arter. Vores resultater indikerer, at relativt svag medfødt immunitet hos en termitart kompenseres af mere vedvarende allogrooming. Dette inkluderer forbedret allogrooming som reaktion på koncentrationer af konidier, der afspejler mere rutinemæssig kontaminering af neglebåndet, såvel som på kraftig kutikulær kontaminering, der fremkalder en netværksforbundet nødreaktion.

Nøgleord:

social immunitet; medfødt immunitet; entomopatogener; alarmadfærd; endestation

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

1. Introduktion

Sociale forsvarsmekanismer kan være yderst effektive til at modvirke modtagelighed for smitsom sygdom på trods af selskabelighed, der favoriserer dens spredning [1,2]. Hos termitter og myrer ser udviklingen af ​​effektive sociale mekanismer for immunforsvar ud til at have lempet det selektive pres på individuelle medfødte immunmekanismer [3-6]. Efter at man støder på patogener, vil truslen om sygdom hos sociale insekter afhænge af effektiviteten af ​​det medfødte frontlinjeforsvar, som omfatter fysiske barrierer for infektion. Mange svampepatogener producerer aseksuelle sporer (konidier), der direkte kan trænge ind i insektets neglebånd. Socialt immunforsvar, der hjælper med at beskytte neglebåndet, inklusive allogrooming og udskilte svampedræbende midler, synes at være særligt vigtigt i termitter til forsvar mod Metarhizium spp [7-9]. Metarhizium conidia er allestedsnærværende i jorden, som mange termitter bevæger sig igennem, mens de søger føde og når koncentrationer, der opretholder en konstant trussel om infektion [10]. Forsøgende termitter, såsom arter af slægten Reticulitermes, bevæger sig gennem jorden for at udvide deres koloniers rækkevidde og få adgang til flere fødesteder, som normalt er træressourcer, der hviler på jordoverfladen [11]. Deres koloniers underjordiske netværk kan strække sig over snesevis af meter, indeholde over hundrede tusinde individer og nå tætheder på over hundrede kolonier pr. hektar [12]. De udviklede sig fra en forfader med kolonier begrænset til et enkelt stykke træ [13,14]. Denne overgang ville have resulteret i øgede møder med rovdyr, patogener og konkurrenter og faldt sammen med udviklingen af ​​en dedikeret ægte arbejderkaste, der normalt giver afkald på direkte reproduktion. Forbedret hygiejne har sandsynligvis været afgørende for denne overgang og den efterfølgende stråling og nuværende økologiske succes for termitter, hvis bidrag til trænedbrydning kan overstige mikrobiel nedbrydning [15,16] og som ser ud til at være klar til hurtigt at ekspandere globalt, når temperaturerne stiger [17] . Under overgangen til fouragering faldt en afslapning af det selektive pres på medfødte immungener sammen med dets intensivering på to gener, der producerer udskilte antifungale proteiner [6]. Disse proteiner ser ud til at være essentielle for fjernelse af svampekonidier med allogrooming. Det kontrasterende selektive pres på komponenter af individuelle medfødte og sociale forsvarsmekanismer i fortiden tyder på, at der fortsat er en adaptiv afvejning i termitters afhængighed af individuel medfødt og social immunitet til beskyttelse mod svampesygdomme. Dette understøttes af den observation, at medfødt immungenekspression er lavere i grupper end individer af Reticulitermes-arbejdere, der har været udsat for Metarhizium conidia [18]. Allogrooming reducerer behovet for at aktivere det indre immunsystem. I denne undersøgelse undersøgte vi forskelle i social og medfødt immunitet hos to arter af underjordiske termitter mod to lokale arter af Metarhizium, der møder hinanden naturligt. Metarhizium-arterne blev isoleret fra jorden under eller ved siden af ​​stammer, hvor termitter blev opsamlet. De to termitarter, Reticulitermes virginicus og Reticulitermes flavipes, blev indsamlet fra samme sted i Maryland. Selvom de ser ud til at være agonistiske, findes de ofte fouragerende ved siden af ​​hinanden eller endda lejlighedsvis i samme træstamme. Interspecifik aggression mellem arbejdere resulterer ofte i dødelige sår i petriskålagonismeassays [19]. Den svampedræbende aktivitet af kutikulære vask af R. virginicus-arbejdere har tidligere vist sig at være mere effektiv til at inaktivere Metarhizium conidia end vask fra R. flavipes-arbejdere [20]. Dette tyder på, at selvom disse to termitter er nært beslægtede og støder på de samme patogener, kan de være forskellige i deres afhængighed af individuel medfødt eller social immunitet. Vi brugte en komparativ tilgang til at undersøge, om der er forskel mellem afhængigheden af ​​og integrationen af ​​social og medfødt immunitet, og om der er en potentiel afvejning mellem de to. Forstærket social immunitet kan være forbundet med mindre effektive medfødte immunmekanismer, som kan omfatte styrken af ​​udskilte svampedræbende midler og vice versa. Svagere individuel immunitet kan kompenseres af mere effektiv social immunitet. Overlevelsen af ​​termitarbejdere fra sent instar i grupper på tolv, par eller singletoner blev undersøgt, efter at de var blevet udfordret med svampe fra enten Metarhizium robertsii eller Metarhizium brunneum. Grupper på 12 arbejdere blev kortvarigt udsat for en høj dosis af svampen. Denne potentielt dødelige koncentration forårsager lignende adfærdsreaktioner som den, der observeres, når termitter støder på et sporulerende kadaver, hvilket i nogle tilfælde fremkalder en væsentlig stigning i en alarmreaktion, der resulterer i hurtige langsgående oscillerende bevægelser, LOM'er [21-23]. Hyppigheden af ​​LOM'er i de første 12 minutter efter termitter er blevet udsat for konidier af forskellige stammer og arter af Metarhizium er positivt korreleret med hyppigheden af ​​anfald af allogrooming. LOM'er, som er nemmere at måle end allogrooming, kan derfor bruges som et indirekte mål for allogrooming-niveauer. Detektion af svampen ser ud til at blive forsinket, indtil overfladen af ​​termitter er forurenet med konidier, hvilket tyder på, at genkendelsesreceptorer forbundet med munddele er kritiske for begyndelsen af ​​forhøjet alarm og allogrooming. Par og singletons blev udsat for en lav dosis af svampen, der er mere tilbøjelig til at afspejle de eksponeringsniveauer, som termitter møder, når de konstruerer gallerier gennem jorden, i modsætning til direkte møder med spordannende kadavere. I modsætning til enkelte termitter er termitpar næsten fuldstændigt resistente over for dødelige infektioner ved denne dosis over 10 dage. For at pirre social og medfødt immunitet fra hinanden ved denne lave dosis, blev par af termitter adskilt på forskellige tidspunkter kort efter udfordringer med svampekonidier, og overlevelsen af ​​disse par blev sammenlignet med singletoner, der ikke havde muligheder for sociale interaktioner efter svampeudfordringer. Allogrooming og LOM'er blev observeret før adskillelsestidspunkterne for termitpar. Derudover blev den antifungale aktivitet af råekstrakter af hele termitter testet for yderligere at vurdere forskelle i medfødt immunitet mellem de to termitarter som reaktion på de to svampearter.

Fordele ved cistanche tubulosa-styrke immunsystemet

2. Metoder

2.1. Undersøg organismer

Termitterne R. flavipes og R. virginicus, og svampene M. brunneum og M. Roberts, blev indsamlet fra sekundærvækst løvskov i Baltimore County (Pleasant Hills og Monkton), Maryland. Termitarter blev identificeret ved hjælp af intra- og interspecifikke agonismeassays [19] og mitokondrielle rRNA-sekvenser [4]. Metarhizium-arterne blev isoleret fra jordprøver nær termitindsamlingssteder (<30 cm) using a baiting technique with Tenebrio molitor larvae [24]. The conidia and mycelia of two clonal lines of the species were used for DNA purification with a QIAGEN DNeasy Blood and Tissue kit. The 50 regions of translation elongation factor 1-alpha were PCR-amplified using PCR primers EF1T and EF2T [25]. These regions were Sanger-sequenced (Psomagen, Rockville, MD) for species identification. Foraging groups of R. flavipes and R. virginicus (>1000), og det træ, de fodrede i, blev opsamlet og opbevaret i plastikbeholdere under mørke, fugtige forhold ved 25 ◦C. Termitter tilhørende samme art blev indsamlet fra lokaliteter, der var adskilt med mindst 60 m, hvilket normalt er tilstrækkeligt til at sikre, at samlinger er fra forskellige kolonier [12]. Disse separate samlinger omtales som kolonier nedenfor. Termitter blev indsamlet i sommeren 2018 og 2019 til forsøgene med grupperne på 12 samt in vitro forsøg med termit råekstrakter og i 2021 og 2022 til forsøgene med par og singletons. Termitter blev brugt i deres respektive eksperimenter inden for 4 måneder efter indsamling. Arbejderne blev forsigtigt fjernet fra træstykker og holdt i grupper med 12 55 mm diameter petriskåle foret med fugtet filterpapir (Whatman 1) i 24 timer i omgivende lys, før de blev brugt til vores eksperimenter. Dette gjorde det muligt for dem at akklimatisere sig til lys og rense deres kutikulære overflader for partikelaffald før svampeeksponeringerne. Vi inkluderede ikke soldater, da de ikke plejer redekammerater, repræsenterer 1-2 % af kolonien og ikke konsekvent findes i fourageringsgrupper.

2.2. Overlevelse og alarmreaktion for grupper på tolv

Grupper på 12 R. flavipes- eller R. virginicus-arbejdere blev udsat for en høj dosis af 10 6 konidier mL−1 af 0.05 % Tween 80 (MilliporeSigma , Burlington, MA, USA) eller 0,05 % Tween 80 for kontroller. Tween 80 blev inkluderet for at hjælpe med at opbryde klumper af konidier ved fremstilling af suspensionerne. Dagen før disse behandlinger blev alle 12 termitter mærket med en lille prik farvet emaljemaling på den dorsale side af deres underliv, så de kunne identificeres individuelt. Allogrooming fjernede malingen fra nogle få individer, men disse individer kunne stadig identificeres individuelt på dødstidspunktet ved at undersøge de overlevende og ved naturlig individuel variation hos arbejderne, såsom graden af ​​mørk farve i maven. Termitterne anvendt til hver replikat af 12 udfordrede termitter og kontroller var fra forskellige kolonier. Fem kolonier blev brugt til både R. flavipes og R. virginicus (n=480 arbejdere). Eksperimenter med M. Roberts-kolonier blev gentaget efter tre måneder for at teste for konsistens i overlevelse. I alt var der 60 replikater af 12 eller 11 termitter (n=709). I 11 replikater døde en termit før svampeeksponering, hvilket så ud til at skyldes håndtering ved maling. Termitter blev udsat for konidier fremstillet fra en klonal kultur af enten M. Roberts eller M. brunneum. Arbejdere blev tilsat til 1,5 ml rør indeholdende 500 µL af konidiefortyndingerne eller 0,05 % Tween 80 til kontroller med en lille plastiktragt og forsigtigt omrørt i 10 s for at sikre fuldstændig nedsænkning. Arbejderne blev derefter deponeret på filterpapir for at absorbere overskydende væske, overført til petriskåle med en diameter på 55 mm foret med fugtet filterpapir (Whatman 1) og videooptaget i 12 minutter. Dødeligheden blev overvåget dagligt i to uger. Døde individer blev fjernet, overfladesteriliseret med 70 % ethanol og anbragt på fugtigt filterpapir i petriskåle (55 mm) holdt ved 24 ◦C og 100 % fugtighed til bekræftelse af Metarhizium-infektion (grøn muscardinvækst efter 3-4 dage). Det samlede antal LOM'er observeret i videoerne over 12 minutter blev bedømt for hver termit. LOM'er varede mellem 2-7 s og skulle have stoppet og derefter genoptaget for at blive scoret som separate begivenheder [23].

2.3. Survivorship og Allogrooming for par og singletoner

Overlevelsen af ​​termitpar blev sammenlignet med singletons efter eksponering for en lav dosis (104 konidier mL−1) af konidier, der ikke forårsagede overdreven dødelighed og sandsynligvis afspejler koncentrationer, som termitter møder, når de bevæger sig gennem jorden [10] . Par og singletoner blev sammenlignet for at måle overlevelse givet af sociale forsvarsmekanismer. Grupper på 12 arbejdere blev indledningsvis udfordret med eller uden svampe som beskrevet ovenfor, bortset fra at konidiesuspensioner på ca. 107 konidier ml-1 blev fremstillet i 0,1 % Tween 80 og kraftigt vortexet før fortyndinger med sterilt vand til 104 konidier ml-1. Tween 80 blev ikke inkluderet i fortyndingerne, fordi suspensioner af individuelle konidier kunne holdes i lave koncentrationer, og fordi det overfladeaktive middel kan interferere med vedhæftningen af ​​konidier til neglebåndet. Disse personer var ikke malingsmærkede. Umiddelbart efter behandlinger og før termitter havde mulighed for at interagere, blev de opdelt i par eller singletons i brøndene på 24-brønds plastcellekulturplader (CELLTREAT Scientific, Pepperell, MA). Hver brønd blev foret med fugtet filterpapir (Whatman 1). For hver termit/svampekombination (n=4) blev fire termitpar adskilt i singletons efter 15 min, 2 timer, 5,5 timer, 8 timer og 27 timer (n=160), og for hver termit/svampe-kombination 12 termitter, der aldrig havde mulighed for at interagere, blev adskilt i svampebehandlede eller kontrol-single (n=96). Disse individuelle termitter blev også opdelt i 24-brøndplader foret med filterpapir. Termitternes dødelighed blev efterfølgende overvåget over ti dage, og døde individer blev fjernet for bekræftelse af infektion med Metarhizium. En enkelt koloni blev brugt til både R. flavipes behandlet med M. robertsii eller M. brunneum og R. virginicus behandlet med M. robertsii eller M. brunneum (n=256). Seks ubehandlede par blev også holdt i 24-brøndplader i 10 dage for hver art. Et separat eksperiment med de samme kolonier fokuserede på registrering af allogrooming før adskillelsestiderne for parrene ved 15 minutter, 2 timer, 5,5 timer, 8 timer og 27 timer. Seks forskellige par af hver termitart blev behandlet med hver svamp eller vand for kontroller og scoret for allogrooming i 15 minutter før adskillelsestidspunkterne (n=180). Allogrooming-hændelser blev scoret, når mund-til-krop-kontakt mellem to termitter involverede bevægelse af munddele (palper), og varigheden af ​​hver uafbrudt allogrooming-hændelse blev registreret. Allogrooming blev scoret af en enkelt observatør, som var blind for, hvilken behandling termitter havde modtaget. LOM'er blev også scoret, men var ubetydelige og blev ikke brugt i analysen. Selvpleje blev ikke observeret.

Fordele ved cistanche tubulosa-styrke immunsystemet

2.4. In vitro antifungal aktivitet

Tolv arbejdere fra 5 R. flavipes- eller R. virginicus-kolonier blev koldimmobiliseret i 1,5 ml Eppendorf-rør, og 12 0 µL koldt, sterilt vand blev tilsat til hvert rør. Arbejderne fra begge arter brugt i denne undersøgelse var omtrent lige store (længde 4-5 mm). Termitterne blev homogeniseret med en plastpistil, og ekstrakten blev centrifugeret ved 16,000 g i 2 min. Supernatanten blev filtersteriliseret med 0,22 µm Ultrafree-filtre (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA). Ti µL af filtratet blev inkuberet i 24 timer med 10 µL indeholdende 100 konidier af M. robertsii eller M. brunneum og 20 µL 100 µg ml-1 ampicillin for yderligere at undgå bakteriel kontaminering. Kontroller inkluderede 10 µL sterilt vand i stedet for det rå ekstrakt. To replikater for hver inkuberet blanding blev spredt på kartoffeldextrose-agar (PDA) suppleret med 50 µg ml-1 ampicillin (60 mm petriskåle) og inkuberet ved stuetemperatur i mørke i 4-5 dage. Antifungal aktivitet blev målt ved at sammenligne kolonidannende enheder (CFU'er) i råekstraktbehandlinger med kontroller.

2.5. Statistikker

Kaplan-Meier estimater af gennemsnitlige overlevelsestider blev brugt til parvise sammenligninger af overlevelse. Hazard ratios of death (HRs) blev beregnet med Cox regressionsanalyse. Vi brugte Cox-regression til at undersøge forskelle i dødelighed mellem individer, der udviser LOM'er eller ikke udviser LOM'er, mens vi kontrollerer for andre kategoriske variabler (svampebehandling eller -kontrol, svampearter, termitarter, oprindelseskoloni). LOM'er blev kategoriseret som fraværende eller til stede hos individer på grund af hyppigheden af ​​afvigelser og mangel på normalitet. I overlevelsesanalysen med termitpar og singletons var HR baseret på en sammenligning mellem konidierbehandlede par (adskilt på forskellige tidspunkter) og konidiebehandlede singletons. Disse HR'er giver derfor et mål for overlevelse, der tilbydes af sociale forsvarsmekanismer, mens de kontrollerer for individuelle forsvarsmekanismer. Sammenhængen mellem tid brugt som et par og ændring i HR blev målt med Pearson-korrelationer. Fordelingen af ​​LOM'er mellem forskellige behandlinger blev sammenlignet med en Kruskal-Wallis-test med Bonferroni-korrektioner for flere tests for parvise sammenligninger. Den gennemsnitlige CFU eller varigheden af ​​allogrooming-hændelser blev sammenlignet med en ANOVA-test med Bonferroni-korrektioner for parvise sammenligninger. Vi brugte IBM SPSS Statistics (version 28) til de statistiske tests.

3. Resultater

3.1. Overlevelse og alarmering af udfordrede grupper på tolv

The Cox regression model of survivorship that included categorical variables for fungal treatment, LOMs, termite species, fungi species, and a colony of origin was significant (Chi-square = 246.29, df = 12, p < 0.001). Challenged termites were 9.28 times more likely to die than untreated termites (Wald = 143.05, p < 0.001) while controlling for the other variables. Termites that displayed LOMs (n = 422) were 1.52 times more likely to survive (Wald = 8.30, p = 0.004) than individuals that did not display LOMs (n = 286). R. virginicus workers were 2.08 times more likely to die than R. flavipes workers (Wald = 6.31, p = 0.012). Fungal species did not contribute significantly to the model (Wald = 0.841, p = 0.359). The colony of origin contributed significantly to the model (Wald = 50.16, p < 0.001), which is consistent with previously reported colony variation in Reticulitermes resistance to Metarhizium infections [24]. Survivorship did not differ between the same colony when the experiment was repeated 3 months later with workers that were exposed to M. Roberts (Breslow pairwise comparison, Chi-square = 0.342, p = 0.559). Most deaths in the challenged termites were attributable to Metarhizium infection (>9 0 % bekræftelse). For udfordrede termitter med M. Roberts blev der observeret 129 dødsfald blandt 237 individer, og den gennemsnitlige overlevelsestid for R. virginicus (9,10 dage) var signifikant lavere end for R. flavipes (10). 98 dage)(Breslow=10.05, df=1, s=0.002) (Figur 1). For udfordrede termitter med M. brunneum blev der observeret 79 dødsfald blandt 120 individer, og den gennemsnitlige overlevelsestid for R. flavipes (9,70 dage) var lavere end for R. virginicus (10,68 dage), men ikke signifikant (Breslow=2 .74, df=1, s.=0.098). Fordelingen af ​​LOM'er (figur 2) blandt svampe- og kontrolbehandlinger var signifikant forskellig (Kruskal–Wallis=176.897, df=5, p < 0,001). Hyppigheden af ​​LOM'er var ikke signifikant forskellig mellem M. brunneum-behandlinger og deres respektive kontroller for R. flavipes (justeret p=0.097) og R. virginicus (justeret p=1.000 ). Hyppigheden af ​​LOM'er var imidlertid signifikant større for M. Roberts-behandlinger sammenlignet med deres respektive kontroller for R. flavipes (justeret p < 0,001) og R. virginicus (justeret p < 0,001) (figur 2). For M. Roberts-behandlingen var frekvensen af ​​R. flavipes LOM'er signifikant større end R. virginicus LOM'er (justeret p < 0,001). Men for M. brunneum-behandlingen var frekvensen af ​​R. flavipes LOM'er ikke signifikant forskellig fra R. virginicus LOM'er (justeret p=1.000). I modsætning til M. brunneum resulterede grupper på 12 termitter udfordret med M. Roberts konidier i en signifikant adfærdsmæssig reaktion.

3.2. Overlevelse af udfordrede par og singletoner

Overlevelsen af ​​termitpar adskilt på forskellige tidspunkter kort efter patogenchallenge blev sammenlignet med overlevelsen af ​​angrebne singletons med hazard ratios of death (HR'er). En HR på 1 svarer til ligelig overlevelse i de adskilte par og singletoner over ti dage. Værdier mindre end én indikerer, at der er reduceret dødelighed i de adskilte par sammenlignet med singletonerne. Korrelationen mellem tid brugt som et par og reduktionen i HR var kun signifikant for R. flavipes behandlet med enten M. Roberts (r=−0.978, p=0.{ {7}}04) eller M. brunneum (r=−0.983, s.=0.003), og ikke for R. virginicus behandlet med enten M. Roberts (r=−0,643, s=0.242) eller M. brunneum (r=−0,812, s.=0.095). Dette afspejles også i R2-værdierne fra lineære regressioner vist i figur 3 (tiden blev log-transformeret til beregning af Pearson-korrelationerne og R2-værdierne). Der blev ikke observeret dødsfald hos ubehandlede par (6 par for hver termitart) og et dødsfald hos 16 behandlede par (4 par for hver termit/svampe-kombination), som aldrig blev adskilt i løbet af 10 dage.

Figur 1. Overlevelse for grupper på 12. Rf svarer til R. flavipes, Rv med R. virginicus, Mr med M. robertsii og Mb med M. brunneum. Signifikante overlevelsesforskelle for parvise sammenligninger var baseret på Breslow-tests (generaliserede Wilcoxon-test). * Signifikant forskel mellem behandlinger, NS ingen signifikant forskel mellem behandlinger (s< 0.025 Bonferroni adjusted α). The distribution of LOMs (Figure 2) among fungal and control treatments was significantly different (Kruskal–Wallis = 176.897, df = 5, p < 0.001). The frequency of LOMs was not significantly different between M. brunneum treatments and their respective controls for R. flavipes (adjusted p = 0.097) and R. virginicus (adjusted p = 1.000). However, the frequency of LOMs was significantly greater for M. robertsii treatments compared to their respective controls for R. flavipes (adjusted p < 0.001) and R. virginicus (adjusted p < 0.001) (Figure 2). For the M. robertsii treatment, the frequency of R. flavipes LOMs was significantly greater than R. virginicus LOMs (adjusted p < 0.001). However, for the M. brunneum treatment, the frequency of R. flavipes LOMs was not significantly different from R. virginicus LOMs (adjusted p = 1.000). In contrast to M. brunneum, groups of 12 termites challenged with M. robertsii conidia resulted in a significant behavioral response. 

Figur 1. Overlevelse for grupper på 12. Rf svarer til R. flavipes, Rv med R. virginicus, Mr med M. robertsii og Mb med M. brunneum. Signifikante overlevelsesforskelle for parvise sammenligninger var baseret på Breslow-tests (generaliserede Wilcoxon-test). * Signifikant forskel mellem behandlinger, NS ingen signifikant forskel mellem behandlinger (s< 0.025 Bonferroni adjusted α). For the survivorship of pathogen-challenged single termites (Figure 4), 47 deaths were observed among 48 individuals, and the mean survival time for R. flavipes (4.21 days) was significantly lower than for R. virginicus (6.17 days)(Breslow, chi-square = 33.927, df = 1, p < 0.001). This relationship held for both species of fungi: For M. robertsii exposure, the mean survival time for R. flavipes (4.25 days) was significantly lower than for R. virginicus (5.83 days) (chi-square = 16.133, df = 1, p < 0.001); For M. brunneum exposure, the mean survival time for R. flavipes (4.17 days) was significantly lower than for R. virginicus (6.50 days) (chi-square = 20.994, df = 1, p < 0.001). 3.3. Antifungal Activity of Crude Extracts The two species of fungi were analyzed separately (the viability of conidia on PDA differs between the two species). For M. robertsii, mean colony-forming units (CFUs) among fungal and control treatments were significantly different (F = 18.08, df = 2, p < 0.001) (Figure 5a). Crude extracts of R. virginicus but not R. flavipes workers showed significant antifungal activity against M. robertsii compared to the control (adjusted p < 0.001 and p = 1.000, respectively). The antifungal activity of R. virginicus extracts against M. robertsii was significantly greater than the antifungal activity of R. flavipes extracts against M. robertsii (adjusted p < 0.001). For M. brunneum, mean CFUs (Figure 5b) among fungal and control treatments were significantly different (F = 27.26, df = 2, p < 0.001). Crude extracts of R. virginicus but not R. flavipes showed significant antifungal activity against M. brunneum compared to the control (adjusted p < 0.001 and p = 0.072, respectively). The antifungal activity of R. virginicus extracts against M. brunneum was significantly greater than the antifungal activity of R. flavipes against M. brunneum (adjusted p < 0.001).

3.3. Antifungal aktivitet af råekstrakter

De to arter af svampe blev analyseret separat (levedygtigheden af ​​konidier på PDA er forskellig mellem de to arter). For M. robertsii var gennemsnitlige kolonidannende enheder (CFU'er) blandt svampe- og kontrolbehandlinger signifikant forskellige (F=18.08, df=2, p < 0 .001) (Figur 5a). Råekstrakter af R. virginicus, men ikke R. flavipes-arbejdere, viste signifikant antifungal aktivitet mod M. robertsii sammenlignet med kontrollen (justeret p < 0.001 og p=1.{{ 10}}). Den antifungale aktivitet af R. virginicus-ekstrakter mod M. robertsii var signifikant større end den antifungale aktivitet af R. flavipes-ekstrakter mod M. robertsii (justeret p < 0,001). For M. brunneum var gennemsnitlige CFU'er (figur 5b) blandt svampe- og kontrolbehandlinger signifikant forskellige (F=27.26, df=2, p < 0.001). Råekstrakter af R. virginicus men ikke R. flavipes viste signifikant antifungal aktivitet mod M. brunneum sammenlignet med kontrollen (henholdsvis justeret p < 0,001 og p=0}.072). Den antifungale aktivitet af R. virginicus-ekstrakter mod M. brunneum var signifikant større end den antifungale aktivitet af R. flavipes mod M. brunneum (justeret p < 0,001).

Figur 2. Alarmreaktion på svampeangreb. Boxplots repræsenterer fordelingen af ​​LOM'er (LOM'er scoret i 709 malingsmærkede individer). Bokser svarer til afstanden mellem øvre og nedre kvartil fra medianen (IQR). Whiskers svarer til 1,5 × IQR. Cirkler og asterisker viser afvigelser ud over henholdsvis 1,5 × IQR eller 3 × IQR. Forskellige bogstaver angiver væsentlige forskelle mellem fordelinger for svampe- og kontrolbehandlinger (Bonferroni justeret). Rf svarer til R. flavipes, Rv med R. virginicus, Mr med M. robertsii og Mb med M. brunneum.

3.4. Allogrooming blandt udfordrede par

Hyppigheden af ​​allogrooming-anfald faldt signifikant med svampeudfordringer (udfordringsgennemsnit {{0}}.55, kontrolmiddel=8.80, t=−4.461, p. < {{20}}.001). Den gennemsnitlige varighed af allogrooming steg dog signifikant med svampeudfordringer (udfordringsgennemsnit=19,01 s, kontrolmiddel=5,62 s, t=4.876, p < 0,001). Varigheden af ​​allogrooming-anfald for hver interaktion mellem termitpar var signifikant forskellig på tværs af behandlinger og kontroller (F=7.166, df=5, p < 0,001) (figur 6). Allogrooming-varigheden pr. hændelse var signifikant forhøjet i R. flavipes-par behandlet med M. robertsii (justeret p < 0,001) eller M. brunneum (justeret p=0.037) i forhold til kontroller, men ikke i R. virginicus-par behandlet med M. robertsii (justeret p=1.000) eller M. brunneum (justeret p=1.000) i forhold til kontroller.

Figur 3. Overlevelsen af ​​to termitter versus én blev sammenlignet med risikoforhold for død (n=80 par, 96 singletons). Rf svarer til R. flavipes, Rv med R. virginicus, Mr med M. robertsii og Mb med M. brunneum. Tiden blev logtransformeret til beregning af R2-værdierne.

Figur 4. Overlevelse af enkelte termitter efter en svampeangreb (n=96). Rf svarer til R. flavipes, Rv med R. virginicus, Mr med M. robertsii og Mb med M. brunneum. Se teksten for detaljer om statistiske forskelle mellem behandlinger. Signifikante overlevelsesforskelle for parvise sammenligninger var baseret på Breslow-tests (generaliserede Wilcoxon-test). * Signifikant forskel mellem behandlinger (p < 0.025 Bonferroni justeret).

Figur 5. Råekstrakt antifungal aktivitet mod M. robertsii (a) og M. brunneum (b). Værdier over søjler repræsenterer gennemsnitlige CFU'er (±SD), og forskellige bogstaver indikerer signifikante forskelle (Bonferroni justeret). Rf svarer til R. flavipes og Rv med R. virginicus. Analysen anvendte to replikater fra 5 kolonier fra hver termitart, 6 replikater for Rf-kontrollen og 2 replikater for Rv-kontrollen.

Figur 6. Varighed af allogrooming pr. interaktion (n=161 allogroominghændelser). Værdier over søjler repræsenterer den gennemsnitlige varighed af allogrooming-interaktioner (±SD), og distinkte bogstavkombinationer indikerer signifikante forskelle (Bonferroni justeret). Rf svarer til R. flavipes, Rv med R. virginicus, Mr med M. robertsii og Mb med M. brunneum.

4. Diskussion

R. flavipes er afhængig af sociale forsvarsmekanismer mod lokale svampepatogener i højere grad end R. virginicus. For R. flavipes-arbejdere udfordret med begge Metarhizium-arter var der en stærk negativ sammenhæng mellem den tid, to termitter tilbragte sammen, og deres sandsynlighed for død i forhold til udfordrede enkelte termitter. Fareforholdet for død i forhold til udfordrede enkelte termitter blev halveret på ca. to timer (figur 3). Tidlige sociale interaktioner ser derfor ud til at være kritiske for overlevelse, når R. flavipes-arbejdere møder lave koncentrationer af Metarhizium conidia. I modsætning hertil viste R. virginicus-arbejdere en svag sammenhæng mellem den tid, to termitter tilbragte sammen, og deres sandsynlighed for død. I modsætning til R. virginicus øgede R. flavipes arbejderpar signifikant varigheden af ​​allogrooming anfald efter en svampeangreb (figur 6). Påvisning af konidier på en redefælles neglebånd har sandsynligvis ført til denne stigning. Mere effektiv fjernelse af konidier fra kutikulære overflader ved at øge varigheden af ​​allogrooming-anfald ser ud til at tage højde for R. flavipes' overlegne sociale immunitet. Vores resultater indikerer også, at R. virginicus er afhængig af individuelle medfødte forsvarsmekanismer mod lokale svampepatogener i højere grad end R. flavipes. Dødeligheden af ​​enkeltstående R. flavipes-arbejdere udsat for en af ​​Metarhizium-arterne var signifikant højere end dødeligheden af ​​R. virginicus-arbejdere (figur 4). Den svampedræbende aktivitet af R. virginicus worker kutikulære vaske mod Metarhizium conidia har tidligere vist sig at være signifikant stærkere end aktiviteten af ​​R. flavipes arbejdere [20]. Den antifungale aktivitet af råekstrakter af hele termitter var også stærkere hos R. virginicus end i R. flavipes (figur 5). Disse ekstrakter omfatter forbindelser fra tarmsymbionter, som sammen med termit-svampemidler også kan bidrage til at eliminere indtagne konidier [26]. Variationen i risikoforhold for død og deres svage korrelation med separationstider hos R. virginicus-arbejdere er i overensstemmelse med en større afhængighed af medfødte immunforsvarsmekanismer, der varierer mellem individer frem for sociale immunmekanismer. R. flavipes viste også en større afhængighed af social immunitet, når grupper på 12 arbejdere kortvarigt blev udsat for høje koncentrationer af M. robertsii conidia. Umiddelbart efter eksponering for M. robertsii conidia viste begge termitarter forhøjede LOM'er. Denne alarmaktivitet var signifikant højere hos R. flavipes end hos R. virginicus (Figur 2), og modstanden mod dødelige infektioner var også signifikant højere hos R. flavipes end hos R. virginicus (Figur 1). Derimod var der en forhøjet, men svag alarmreaktion på M. brunneum conidia. I overensstemmelse med dette resultat er det tidligere blevet vist, at forhøjet alarm i R. flavipes som reaktion på konidier af forskellige Metarhizium-stammer og arter er korreleret med forhøjet allogrooming og overlevelse [23]. R. flavipes-arbejdere kan have en lavere tærskel end R. virginicus-arbejdere for at genkende og reagere kollektivt og effektivt på kutikulær kontaminering med M. robertsii conidia. M. robertsii, som er den mest udbredte Metarhizium-art i vores undersøgelsessted [24], kan repræsentere en trussel mod R. flavipes, der kræver et stærkt socialt immunrespons, fordi denne termit har relativt svagt medfødt immunforsvar mod sig. Effektiviteten af ​​svampedræbende forbindelser forbundet med spytkirtelsekretioner er sandsynligvis essentiel for de individuelle forsvar observeret i denne undersøgelse [20]. Disse forbindelser er til stede på overfladen af ​​arbejderne før svampeudfordringer, da de udtrykkes konstitutivt og konstant udbredes af basale niveauer af allogrooming, som derfor integrerer individuelle og sociale forsvar. Denne gestalt inkluderer sandsynligvis det lille defensin-lignende svampedræbende peptid termicin, som udskilles i spytkirtlen og er kritisk vigtigt for forsvar mod dødelige infektioner af Metarhizium [27]. En undersøgelse af R. flavipes og R. virginicus fra det samme indsamlingssted i Maryland, som blev brugt i denne undersøgelse, afslørede, at termiciner for nylig stod over for et selektivt sweep, der resulterede i en reduktion i nukleotidpolymorfi, og denne reduktion var større i R. flavipes end R. virginicus [28].

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Sweep kan have været og muligvis fortsætter med at være mere alvorlig for R. flavipes, fordi R. virginicus har mere effektive medfødte immunmekanismer, der reducerede dens afhængighed af termiciner til forsvar mod en nylig svampeepidemi. Alternativt kan adaptive begrænsninger på termitudvikling (manglende genetisk variation) have efterladt R. flavipes med svagere våben i lyset af en ny svampeepidemi. Begrænsning af adaptive ændringer i termiciner under stærkt selektivt pres er også tydelig i australske Nasutitermes [29]. Den stokastiske proces med genduplikation ser ud til at have frigivet denne begrænsning i forskellige nasute afstamninger, hvilket resulterede i den gentagne udvikling af to termiciner med forskellige molekylære ladninger. Dette kan have gavnet antifungalt forsvar, fordi to terminaler med forskellige ladningsegenskaber begrænser mulighederne for udvikling af svamperesistens over for dem. Termitter, der udviser alarm (LOM'er) efter eksponering for en høj dosis konidier, var mindre tilbøjelige til at dø i løbet af to uger end personer, der ikke viste nogen alarm. LOM'er er positivt korreleret med R. flavipes arbejderaggregering og allogrooming [23], hvilket tyder på, at individer, der udviser alarm i denne undersøgelse, anmodede om mere pleje fra redekammerater. LOM'er er sjældent rapporteret i forskning, der undersøger Metarhizium-infektioner i termitter og er blevet udelukket som at spille en rolle i signalering af patogeneksponering [30]. De kan dog blive savnet, fordi de ikke forekommer i isolerede individer, ikke i væsentlig grad fremkaldes af visse stammer og arter af Metarhizium, tager cirka 3 minutter efter en udfordring, før de eskalerer, og aftager efter cirka 30 minutter [22,23]. Vores resultater tyder på, at LOM'er kommunikerer en nødalarm efter eksponering for en høj dosis konidier, som detekteres under allogrooming. LOM'er er dog ikke nødvendige for en proaktiv adfærdsreaktion, da varigheden af ​​allogrooming steg efter en lavdosis eksponering, når LOM'er var ubetydelige.

5. Konklusioner

LOM'er ser ud til at være en del af en nødreaktion på kraftig kutikulær kontaminering, der bruger netværkskommunikation til hurtigt at eskalere fjernelse og ødelæggelse af de fleste konidier, før de har en chance for at sætte sig fast og spire, hvilket tager cirka 12 timer [31]. Denne nødberedskab vil sandsynligvis være energisk dyr. Forstærket social immunitet i R. flavipes som reaktion på M. robertsii kan være en adaptiv afvejning, som R. virginicus ikke behøver at foretage i samme omfang, fordi den har mere effektive medfødte immunmekanismer. Når de står over for lave niveauer af patogeneksponering, som fouragerende arbejdere rutinemæssigt skal modstå, ser det ud til, at allogrooming også kompenserer for svage medfødte immunmekanismer.

Referencer

1. Cremer, S.; Træk, CD; Fuerst, MA Social immunitet: Fremkomst og udvikling af sygdomsbeskyttelse på koloniniveau. Annu. Rev. Entomol. 2018, 63, 105-123. [CrossRef] [PubMed] 2. Cremer, S.; Armitage, SA; Schmid-Hempel, P. Social immunitet. Curr. Biol. 2007, 17, R693-R702. [CrossRef] [PubMed]

3. Evans, JD; Aronstein, K.; Chen, YP; Hetru, C.; Imler, JL; Jiang, H.; Kanost, M.; Thompson, GJ; Zou, Z.; Hultmark, D. Immunveje og forsvarsmekanismer hos honningbier Apis mellifera. Insekt Mol. Biol. 2006, 15, 645-656. [CrossRef] [PubMed]

4. Harpur, BA; Zayed, A. Accelereret evolution af medfødte immunitetsproteiner i sociale insekter: Adaptiv evolution eller afslappet begrænsning? Mol. Biol. Evol. 2013, 30, 1665-1674. [CrossRef] [PubMed]

5. Han, S.; Sieksmeyer, T.; Che, Y.; Mora, MAE; Stiblik, P.; Banasiak, R.; Harrison, MC; Šobotník, J.; Wang, Z.; Johnston, PR; et al. Beviser for reduceret immungendiversitet og aktivitet under udviklingen af ​​termitter. Proc. R. Soc. Ser. B 2021, 288, 20203168. [CrossRef]

6. Bulmer, MS; Stefano, AM Termit-eusocialitet og kontrasterende selektivt pres på social og medfødt immunitet. Opfør dig. Ecol. Sociobiol. 2022, 76, 1-12. [CrossRef]

7. Yanagawa, A.; Shimizu, S. Termittens modstand, Coptotermes formosanus Shiraki mod Metarhizium anisopliae på grund af pleje. BioControl 2007, 52, 75-85. [CrossRef]

8. Rosengaus, RB; Traniello, JF; Bulmer, MS Økologi, adfærd og udvikling af sygdomsresistens hos termitter. In Biology of Termites: A Modern Synthesis; Bignell, DE, Roisin, Y., Lo, N., Eds.; Springer: London, Storbritannien, 2011; s. 165–192.

9. Zhukovskaya, M.; Yanagawa, A.; Forschler, BT Soigneringsadfærd som en mekanisme til forsvar af insektsygdomme. Insekter 2013, 4, 609–630. [CrossRef]

10. Milner, RJ Udvælgelse og karakterisering af stammer af Metarhizium anisopliae til bekæmpelse af jordinsekter i Australien. I biologisk bekæmpelse af græshopper og græshopper; Lomer, CJ, Prior, C., red.; CAB International: Wallingford, Storbritannien, 1991; s. 200–207.

11. Traniello, JF; Leuthold, RH Adfærd og økologi ved fouragering hos termitter. I termitter: Evolution, socialitet, symbioser, økologi; Abe, T., Bignell, DE, Higashi, M., Higashi, T., Abe, Y., red.; Springer: Dordrecht, Holland, 2000; s. 141–168.

12. Vargo, E.; Husseneder, C. Biologi af underjordiske termitter: Indsigt fra molekylære undersøgelser af Reticulitermes og Coptotermes. Annu. Rev. Entomol. 2009, 54, 379-403. [CrossRef]

13. Abe, T. Udvikling af livstyper hos termitter. I Evolution og Coadaptation i Biotiske Fællesskaber; Kowana, S., Connell, JH, Hidaka, T., red.; University of Tokyo Press: Tokyo, Japan, 1987; s. 128–148.

14. Shellman-Reeve, JS Spektret af eusocialitet hos termitter. I The Evolution of Social Behaviour in Insects and Arachnids; Choe, JC, Crespi, BJ, red.; Cambridge University Press: Cambridge, Storbritannien, 1997; s. 52–93.

15. Griffiths, HM; Eggleton, P.; Hemming-Schroeder, N.; Swinfield, T.; Woon, JS; Allison, SD; Coomes, DA; Ashton, LA; Parr, CL Carbon flux og skovdynamik: Øget nedbrydning af dødt ved i tropiske regnskovs træfaldskroner. Glob. Chang. Biol. 2001, 27, 1601-1613. [CrossRef]

16. Guo, C.; Tuo, B.; Ci, H.; Yan, ER; Cornelissen, JH Dynamisk feedback blandt træfunktionelle egenskaber, termitpopulationer og omsætning af dødt ved. J. Ecol. 2021, 109, 578-1590. [CrossRef]

17. Zanne, AE; Flores-Moreno, H.; Powell, JR; Cornwell, WK; Dalling, JW; Austin, AT; Classen, AT; Eggleton, P.; Okada, KI; Parr, CL; et al. Termitfølsomhed over for temperatur påvirker den globale trænedbrydningshastighed. Science 2022, 377, 1440-1444. [CrossRef] [PubMed]

18. Liu, L.; Wang, W.; Liu, Y.; Sun, P.; Lei, C.; Huang, Q. Indflydelsen af ​​allogrooming adfærd på individuel medfødt immunitet i den underjordiske termit Reticulitermes chinensis (Isoptera: Rhinotermitidae). J. Insect Sci. 2019, 19, 6. [CrossRef] [PubMed]

19. Polizzi, JM; Forschler, BT Intra- og interspecifik agonisme i Reticulitermes flavipes (Kollar) og R. virginicus (Banks) og virkninger af arena og gruppestørrelse i laboratorieanalyser. Insectes Sociaux 1998, 45, 43-49. [CrossRef]

20. Hamilton, C.; Lay, F.; Bulmer, MS Profylaktiske sekreter fra underjordiske termit og eksternt antifungalt forsvar. J. Insect Physiol. 2011, 57, 1259-1266. [CrossRef]

21. Rosengaus, RB; Jordan, C.; Lefebvre, ML; Traniello, JFA Patogenalarmadfærd i en termit: En ny form for kommunikation hos sociale insekter. Sci. Nat. 1999, 86, 544-548. [CrossRef]

22. Myles, TG Alarm, aggregering og forsvar af Reticulitermes flavipes som reaktion på et naturligt forekommende isolat af Metarhizium anisopliae. Sociobiologi 2002, 40, 243-256.

23. Bulmer, MS; Franco, BA; Fields, EG Socialalarm for underjordiske termitter og hygiejniske reaktioner på svampepatogener. Insekter 2019, 10, 240. [CrossRef]

24. Denier, D.; Bulmer, MS Variation i underjordiske termitters modtagelighed for dødelige infektioner fra lokale Metarhizium-jordisolater. Insectes Sociaux 2015, 62, 219-226. [CrossRef]

25. Bischoff, JF; Rehner, SA; Humber, RA En multilocus-fylogeni af Metarhizium anisopliae-slægten. Mycologia 2018, 101, 512-530. [CrossRef]

26. Rosengaus, RB; Schultheis, KF; Yalonetskaya, A.; Bulmer, MS; DuComb, WS; Benson, RW; Thottam, JP; Godoy-Carter, V. Symbiont-afledte -1, 3-glucanaser i et socialt insekt: Mutualisme hinsides ernæring. Foran. Microbiol. 2014, 5, 607. [CrossRef] [PubMed]

27. Hamilton, C.; Bulmer, MS Molekylært svampedræbende forsvar i underjordiske termitter: RNA-interferens afslører in vivo roller af terminus og GNBP'er mod et naturligt stødt patogen. Dev. Comp. Immunol. 2012, 36, 372-377. [CrossRef] [PubMed]

28. Bulmer, MS; Lay, F.; Hamilton, C. Adaptiv evolution i underjordiske termit antifungale peptider. Insekt Mol. Biol. 2010, 19, 669-674. [CrossRef] [PubMed]

29. Bulmer, MS; Crozier, RH Duplikering og diversificeret udvælgelse blandt termit antifungale peptider. Mol. Biol. Evol. 2004, 21, 2256-2264. [CrossRef]

30. Moran, MN; Aguero, CM; Eyer, PA; Vargo, EL Redningsstrategi i en termit: Arbejdere, der er udsat for et svampepatogen, genintegreres i kolonien. Foran. Ecol. Evol. 2022, 10, 840223. [CrossRef]

31. Davis, HE; Meconcelli, S.; Radek, R.; McMahon, DP Termitter former deres kollektive adfærdsmæssige reaktion baseret på infektionsstadiet. Sci. Rep. 2018, 8, 14433. [CrossRef]