Optogenetisk hæmning af mediale entorhinale cortex-input til Hippocampus i løbet af en kort periode lige efter indlæring forstyrrer dannelsen af ​​kontekstuel frygthukommelse

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstrakt

Dannelsen af ​​tidsmæssig foreninghukommelseog kontekstspecifik frygthukommelsemenes at kræve mediale entorhinal cortex (MEC) input tilhippocampusunder læringsarrangementer. Hvorvidt MEC-indgangene også er involveret i hukommelsesdannelse i en post-læringsperiode er dog ikke blevet direkte testet endnu. For at undersøge denne mulighed hæmmede vi optogenetisk axoner og terminaler, der stammer fra bilaterale dorsale MEC excitatoriske neuroner i dorsalehippocampusi 5 min lige efter kontekstuel frygtkonditionering (CFC). Mus, der udtrykte eNpHR3.0, udviste signifikant mindre frysning sammenlignet med kontrolmus, der udtrykte EGFP alene under genfindingstest i den konditionerede kontekst 1 dag efter indlæring. I modsætning hertil påvirkede den samme optogenetiske hæmning af MEC-input udført 30 minutter før genfindingstesten ikke frysning under genfindingstesten, udelukket muligheden for den uspecifikke skadelige effekt af optisk hæmning på genfindingsprocessen. Disse resultater understøtter, at kontekstuel frygthukommelsesdannelse kræver MEC-input til hippocampus i en post-læringsperiode.

Nøgleord: Medial entorhinal cortex, Hippocampus, Contextual fear conditioning

Min Soo Kang og Jin-Hee Han

Hippocampus-entorhinal cortex-systemet er afgørende for episodiskhukommelsedannelse [1]. Beviser tyder på, at input fra medial entorhinal cortex lag III (MECIII) tilhippocampus, hovedsageligt til CA1-underfelt, er afgørende for tidsmæssig associativ læring, såsom spore frygtkonditionering, men ikke for kontekstuel og forsinket frygtkonditionering [2, 3]. I modsætning hertil svækker optogenetisk hæmning af mediale entorhinal cortex layer II (MECII) celler, der projicerer til dentate gyrus (DG) og CA3, men ikke celler, der projicerer til CA1, under CFC hukommelsesdannelse [4]. Derfor menes input fra MECII til DG eller CA3 at være påkrævet til kontekstuel frygtindlæring. Ikke kun i læring, men MEC input til hippocampus er også involveret i unikke fysiologiske aktivitetsmønstre observeret i hippocampus under hvile og søvn, såsom krusninger og dentate pigge, der er forbundet medhukommelsekonsolideringsproces [5-10]. Derfor MEC input tilhippocampuskan have en rolle i hukommelsesdannelsen i en post-læringsperiode. Denne mulighed er dog ikke afprøvet endnu. For at teste, om MEC-input til hippocampus er nødvendig i post-læringsperioden, vedtog vi en optogenetisk tilgang til at dæmpe MEC-inputaktivitet i 129/C57Bl/6 hybridmus [11, 12]. For at manipulere MEC-input blev adeno-associeret virus (AAV) indeholdende gener, der koder for eNpHR3.0 fusioneret med fluorescerende protein EYFP under CaMKII-promotoren (AAV-CaMKII - eNpHR3.0-EYFP) injiceret i den bilaterale MEC målrettet mod lag II og III (0,5 µL pr. side; AP: – 4,65 mm; ML:±3,4 mm; DV: – 3,3 mm) (fig. 1a). Som kontrol injicerede vi AAV, der mangler eNpHR3.0 (AAV CaMKII -EGFP), som kun udtrykker det fluorescerende protein. AAV-ekspression var begrænset til MEC-lag II og III, som sender projektion til hippocampus (fig. 1b). I hippocampus blev MEC aksonale projektioner, der udtrykker EYFP, detekteret i DG og CA3, der stammer fra MECII, og også i CA1, der stammer fra MECIII (fig. 1a). Tre uger efter AAV-injektionsoperationen blev mus igen bedøvet til optisk fiberimplantatoperation.

Cistanchekan forbedrehukommelse

Optiske fibre blev implanteret i dorsale hippocampus (AP: − 2,0 mm; ML:±1,3 mm; DV: − 1,5 mm) til optisk undertrykkelse af dorsale MEC-input med en 561-nm-laser. Optiske fiberspidser var placeret lige over CA1 stratum lacunose-molekylære lag, og derfor kunne 561-nm laseren dække både MECII afferenter i DG molekylært lag/CA3 stratum radiatum og MECIII afferenter i CA1 stratum lacunose-molekylært lag ( Yderligere fil 1: Fig. S1). I løbet af en uges restitutionsperiode efter implantatoperationen gik mus gennem fibertilvænning i 3 dage. De blev forbundet til en lysafgivende optisk plasterledning og anbragt i tilvænningsburet i 5 minutter uden lyslevering. Efter 3 dages tilvænning blev EGFP- og eNpHR3.0-mus trænet til CFC.

Mus kom ind i konditioneringskammeret og modtog et fodchok ({{0}},5 mA, 2 s) 3 minutter senere. Et minut efter fodchokket blev musene straks overført til det vantede bur og modtog kontinuerligt 561-nm lys (5 mW ved fiberspidsen) i 5 minutter (fig. 1b). Efter inhibering efter læring vendte mus tilbage til deres hjemmebure. For at teste, om kontekstuel hukommelse var korrekt dannet, blev langtidshukommelsen (LTM) testet. Mus kom igen ind i konditioneringskammeret 24 timer efter CFC. Fryseniveauer blev målt som et indeks for LTM, overvåget i 3 min. Mus i eNpHR3.0-gruppen udviste signifikant mindre frysning sammenlignet med mus i EGFP-kontrolgruppen (fig. 1c), hvilket indikerer 24-h LTM-underskud ved post-learning-hæmning af MEC-input til hippocampus. Denne reduktion af frysning skyldtes ikke en ikke-specifik skadelig virkning af den optiske inhiberingsproces. Når den samme optiske inhibering blev leveret 30 minutter før LTM-testen, var der ingen signifikant forskel i frysning mellem grupperne (fig. Id, e).

Hårdt flertal af MEC afferente mål hippocampus, MEC er kendt for at sende projektioner til mediale præfrontale kortikale områder såsom prælimbisk og infralimbisk cortex [13]. Da AAV-ekspression var tilfældig i MEC, er det muligt, at vores optiske hæmning påvirkede MEC-axonerne, der passerer gennem hippocampus, hvis nogen, for at producere dens effekt på kontekstuel frygthukommelsesdannelse. For at udelukke denne mulighed mærkede vi retrogradt MEC-neuroner, der projicerer til hippocampus. Vi injicerede CAV2-Cre-virussen i hippocampus, som optages retrograd af neuroner, der rager ud til hippocampus gennem axonterminaler (fig. 1f).

AAV-Ef1 - DIO-eNpHR3.0-EYFP eller AAV-Ef1 -DIO-EYFP blev injiceret i MEC, så MEC-neuroner, der har optaget CAV2-Cre kan express eNpHR3.0-EYFP eller EYFP (Yderligere fil 1: Fig. S2). Ti formåede vi at hæmme MEC-input i hippocampus lige efter CFC. I lighed med de tidligere resultater forstyrrede optisk inhibering kontekstfrygthukommelsesdannelsen (fig. 1g, h) i denne tilstand. Således styrker disse data yderligere vores konklusion om, at MEC-input til hippocampus er afgørende for kontekstuel hukommelsesdannelse i en post-læringsperiode. En begrænsning i denne undersøgelse er manglen på rumlig specificitet i brugt optisk inhibering.

Det er således uklart, i hvilket omfang og præcis hvor i hippocampus-kredsløbet de udbredte MEC-input blev undertrykt med den optiske hæmning i vores tilstand. Præcis inhibering af MEC-input rettet mod et specifikt underfelt, såsom CA1 eller DG af hippocampus, kan være nødvendig for at belyse den mekanisme, hvormed MEC-input bidrager til dannelsen af ​​kontekstuel frygthukommelse i den fremtidige undersøgelse. Selvom vi ikke testede effekten af ​​optisk hæmning af MEC-input til hippocampus på forskellige tidspunkter efter kontekstuel frygtkonditionering i denne undersøgelse, rapporterer tidligere undersøgelser en tidsafhængig rolle af post-læring hjerneaktiviteter for konsolidering af hippocampus-afhængige minder som f.eks. kontekstuel frygtkonditionering. For eksempel ved hjælp af en optogenetisk strategi manipulerede en tidligere undersøgelse kunstigt induktionen af ​​langsom bølgesøvn (SWS) på forskellige tidspunkter efter forskellige læringsopgaver, og det så ud til, at der er et kritisk tidsvindue (inden for 30 minutter), hvor SWS inducerede ved lys kan forbedre hippocampus-afhængige minder [14].

Fig. 1 hæmning af MEC-input til hippocampus umiddelbart efter optjening forringer langsigtet kontekstuel frygthukommelsesdannelse. en skematisk afbildning af bilateral AAVinektion og optisk ferrule-implantatsted (eft). Repræsentative conkocalmikroscopk-billeder, der skubber EGFP- og eNpHR0-EYFP-udtryk i MEC-top) og i hippocampus (nederst). Asterisk angiver den omtrentlige position af den optiske fiberspids. b Behavioar scheme.histogram, der viser fryseniveau under testeNpHR30 omkring（3589主 3,21 procent ,n=】1】 viste signifikant mindre brusende juvel sammenlignet med EGFP-kontrolgruppen (53,13±265 procent ,n=12) i LTM-test.**s<00005; students="" t-test.behavior="" scheme.e="" histogram="" shoving="" freezing="" level="" during="" the="" test.enphr3.0(5031±290%,n="1l)and" egfp(4831±427%,n="10group" showed="" similar="" feinglevelin="" utm="" tes.p="">005:Studenter t-test.er ikke signifikant,f CAV og AAV inigctign-strategi eller retrograd mærkning af MEC-neuonsproilcting til hippocampus(f) Skematisk afbildning af bilateral CW-injektion AW-injektion og optisk ferrule-implantatsted (højre) adfærdsskema. h Histogram, der viser fryseniveau under testen.eNpHR3.0-gruppen(33.71±4.06 procent ,n=11) ​​viste signifikant mindre fryseniveau sammenlignet med EYFP-kontrolgruppe(50.13±3.18 procent,n=12) i LIM-testen .**s<0005; student's="" t-test="" data="" are="" presented="" as="">

Interessant nok viste en anden undersøgelse i rotter, at selektive elektrolytiske læsioner af den direkte entorhinale projektion (temporoammonisk, TA) til hippocampus-området CA1 24 timer, men ikke 3 uger efter Morris vandlabyrint-træning, forstyrrede dannelsen af ​​rumlig hukommelse på en fjern tid, hvilket tyder på, at MEC-hippocampus interaktion gennem TA input pathway i løbet af denne periode er påkrævet for systemkonsolidering [15]. I betragtning af disse resultater er det højst sandsynligt, at MEC-input til hippocampus har en tidsafhængig rolle i dannelsen af ​​nyere og fjern kontekstuel frygthukommelse.

Det er interessant i vores undersøgelse, at en så kort periode (5 min) med optogenetisk hæmning efter træning var nok til at forringe konteksthukommelsesdannelsen. En fortolkning er, at vores resultater kan afspejle en delvis blok af konsolideringsbegivenheder, som er nødvendige for normal hukommelsesdannelse. I overensstemmelse med denne beretning var hukommelsen delvist svækket i vores tilstand. En anden mulighed er, at der kan være en kritisk begivenhed, der opstår i løbet af dette korte tidspunkt, der kræves for dannelsen af ​​kontekstuel frygthukommelse. En mulighed er, at MEC-input kan være afgørende for at udløse krusninger eller dentate pigge i hippocampus, der er korreleret med en gentagelse af tidligere oplevede hændelser [7, 9, 10, 16], og optogenetisk hæmning af MEC-input kan forstyrre sådanne aktivitetsmønstre. Alternativt kan kort inhibering af MEC-input have påvirket den efterfølgende slow-wave søvn, som også har et afgørende tidsvindue med hensyn til hippocampus-afhængig hukommelseskonsolidering [14].

Referencer

1. Eichenbaum H. Et kortikalt-hippocampalt system til deklarativ hukommelse. Nat Rev Neurosci. 2000;1(1):41-50.

2. Suh J, Rivest AJ, Nakashima T, Tominaga T, Tonegawa S. Entorhinal cortex layer III input til hippocampus er afgørende for temporal association

3.hukommelse. Videnskab. 2011;334(6061):1415–20.Kitamura T, Pignatelli M, Suh J, Kohara K, Yoshiki A, Abe K, et al. Ø-celler styrer tidsmæssig associationshukommelse. Videnskab. 2014;343(6173):896-901.

4. Kitamura T, Sun C, Martin J, Kitch LJ, Schnitzer MJ, Tonegawa S. Entorhinale kortikale oceanceller koder for specifikke kontekster og driver kontekstspecifik frygthukommelse. Neuron. 2015;87(6):1317–31.

5. Buzsaki G, Horvath Z, Urioste R, Hedtke J, Wise K. Højfrekvent netværk

6.oscillation i hippocampus. Videnskab. 1992;256(5059):1025–7.Bragin A, Jando G, Nadasdy Z, Vanlandeghem M, Buzsaki G. Dentate EEG-spidser og tilhørende interneuronale befolkningsudbrud i hippocampus hilar-regionen af ​​rotten. J Neurophysiol. 1995;73(4):1691-705.

7. Chrobak JJ, Lorincz A, Buzsaki G. Fysiologiske mønstre i hippocampus-entorhinal cortex-systemet. Hippocampus. 2000;10(4):457-65.

8. Girardeau G, Zugaro M. Hippocampale krusninger og hukommelseskonsolidering. Curr Opin Neurobiol. 2011;21(3):452–9.

9. Yamamoto J, Tonegawa S. Direkte medial entorhinal cortex input til hippocampus CA1 er afgørende for forlænget stille vågen gentagelse. Neuron. 2017;96(1):217–27.

10. Nokia MS, Gureviciene I, Waselius T, Manila H, Penttonen M. Hippocampus elektrisk stimulation forstyrrer associativ læring, når den er målrettet mod tandspidser. J Physiol-London. 2017;595(14):4961-71.

11. Wehner JM, Silva A. Betydningen af ​​stammeforskelle i evalueringer af indlærings- og hukommelsesprocesser i nulmutanter. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 1996;2(4):243–8.

12. Vetere G, Kenney JW, Tran LM, Xia F, Steadman PE, Parkinson J, et al. Kemogenetisk forespørgsel af et hjernedækkende frygthukommelsesnetværk hos mus. Neuron. 2017;94(2):363–74.

13. Insausti R, Herrero MT, Witter MP. Entorhinal cortex af rotten: cytoarkitektoniske underafdelinger og oprindelse og fordeling af corticale afferenter. Hippocampus. 1997;7(2):146-83.

14. Lu Y, Zhu ZG, Ma QQ, Su YT, Han Y, Wang X, et al. Et kritisk tidsvindue for selektiv induktion af hippocampus hukommelseskonsolidering ved en kort episode med langsom bølgesøvn. Neurovidenskabsbulletin. 2018;34(6):1091–9.

15. Remondes M, Schuman EM. Rollen af ​​cortical input til hippocampus område CA1 i konsolideringen af ​​langtidshukommelsen. Natur. 2004;431(7009):699-703.

16. O'Neill J, Boccara CN, Stella F, Schoenenberger P, Csicsvari J. Overfladiske lag af den mediale entorhinale cortex afspiller uafhængigt af hippocampus. Videnskab. 2017;355(6321):184–8.