Optogenetisk frekvensforvrængning af hippocampale thetaoscillationer adskiller arbejdshukommelseshentning fra hippocampus spatiotemporale koder, del 3

Optogenetisk pacing af MS-neuroner fører til ikke-fysiologisk theta-synkroni

Overraskende nok førte 8 Hz optogenetiske stimulationer, der er forbundet med pacing af theta-oscillationer, til nedsat ydeevne, når de blev anvendt under enten kodning eller hentning af episodisk hukommelse i NPOR-opgaven, såvel som rumlig arbejdshukommelseshentning i DNMTStask. For yderligere at forstå virkningerne af pacing theta på hippocampalfysiologien analyserede vi faselåsning af theta-oscillation før og under 8 Hz optogenetiske stimulationer (Supplerende Fig. 7a) og fandt ud af, at en sådan stimulering førte til øget fasesynkroni på tværs af stimulationsepoker (Supplerende Fig. 7b). Desuden analyserede vi krydskorrelationen af ​​theta-oscillationer over dorsale CA1 (~1 mm afstand mellem elektroder langs den septotemporale akse (Supplerende Fig. 7c) og fandt ud af, at pacing af theta-rytmer ved 8 Hz førte til en øget krydskorrelation mellem disse to elektroder( Supplerende Fig. 7d).

Genetik er den videnskab, der studerer genetisk arv og variation, og hukommelse er et aspekt af stor bekymring. Så hvad har genetik med hukommelse at gøre? Denne artikel vil udforske problemer relateret til hukommelse fra et genetisk perspektiv.

Først og fremmest ved vi, at genetiske gener er grundlaget for menneskets fysiske og intellektuelle udvikling, og hvorvidt disse gener er overlegne vil påvirke folks hukommelse. Den seneste forskning viser, at folks IQ og hukommelse er påvirket af genetiske faktorer. Forskning viser, at genetiske gener spiller en afgørende rolle for intelligens og hukommelse. Derfor er nogle mennesker født med stærkere minder, mens andre skal arbejde hårdt og træne for at forbedre deres hukommelse.

For det andet er miljøfaktorer også vigtige faktorer i hukommelsesudviklingen. Vi har ikke kun brug for støtte fra genetiske gener, men har også brug for at forbedre vores hukommelse gennem videnskabelig træning og gode levevaner. Vi kan for eksempel insistere på at træne hver dag, få nok søvn, følge principper om måltidsmatchning osv., hvilket kan være med til at forbedre vores hjernefunktion og hukommelse.

Endelig, almindelige mennesker, overbetoner ikke genetiske faktorers indflydelse på hukommelsesudviklingen. Fordi genetiske faktorer ikke er absolutte, kan folks hukommelse og intelligens stadig forbedre sig selv ved at forbedre deres indsats og træning. Vi bør altid opretholde en positiv og kontinuerlig læringsindstilling og konstant udforske og udvikle vores hukommelsespotentiale. Jeg tror på, at kun på denne måde kan vi blive klogere og få en større følelse af præstation. For at opsummere er forholdet mellem genetik og hukommelse meget tæt, men vi bør ikke overbetone genetiske faktorer, men bør konstant forbedre vores hukommelse og intelligens gennem selvforbedring og træning.

Det kan ses, at vi skal forbedre vores hukommelse. Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen markant, fordi Cistanche deserticola er et traditionelt kinesisk medicinsk materiale med mange unikke effekter, hvoraf den ene er at forbedre hukommelsen. Effektiviteten af ​​hakket kød kommer fra de forskellige aktive ingredienser, det indeholder, herunder syre, polysaccharider, flavonoider osv. Disse ingredienser kan fremme hjernens sundhed på forskellige måder.

Klik på kend 10 måder at forbedre hukommelsen på

Diskussion

Within the septohippocampal system, the exact causal relationships between (1) MS activity, (2) hippocampal oscillations, (3) hippocampal neuron activity, and (4) behavior, including memory, remain an active area of research. In particular, whether and how the MS supports encoding of place and time in the hippocampus, as well as its specific contribution to memory function, remain unclear. Here, we leveraged more recent techniques that allowed us to record >1000 neuroner, mens de udfører optogenetisk stimulering af MS-neuroner med en sub-sekundopløsning for at kontrollere theta-rytmer og vurdere deres rolle i hippocampus fysiologi og hukommelse. Det er vigtigt, at vi ved hjælp af en excitatorisk opsin og enten forvrænget eller 8 Hz stimuleringer var i stand til konsekvent og robust at afskaffe henholdsvis hippocampus theta.

Sammenlignet med MS-hæmning ved brug af enten en hæmmende opsin eller farmakologiske forbindelser (f.eks. muscimol), muliggør vores tilgang en sammenligning af to modsatrettede tilstande inden for emnet (paced vs abolishedtheta), mens aktivitetsniveauer i MS-PV-celler opretholdes. Vi kombinerede atone-cued lineær sporopgave, der sammen med informationsteoretiske tilgange tillod os at skille rumlige og temporale hippocampale koder ad. Denne metode afhjælper behovet for vilkårlige tærskler, hvilket muliggør en standardiseret tilgang til calcium-billeddannelsesanalyse. Mens en stor del af CA1 pyramidale neuroner udtrykte en blanding af spatiotemporale koder, fokuserede vi vores analyser på neuroner, der var specifikt rettet mod sted, tid eller tilbagelagt afstand.

Mens rumlig kodning er blevet grundigt undersøgt i CA1, har tids- og afstandskoder for nylig vundet mere interesse.Temporal28,35–37 og distance37-koder er blevet udtrukket ved at klemme visuospatiale signaler eller uddraget analytisk ved hjælp af generaliserede lineære modeller i virtual reality-paradigmer26,27,38. Her foreslår vi en tilgang til at adskille rumlige, tidsmæssige og afstandskoder ved hjælp af en informationsteoretisk tilgang, som sammen med vores cuedalternation-opgave muliggør analyse af den virkelige verden spatiotempora og multipleksede koder i frit bevægende dyr. En stor mængde CA1-pyramidale neuroner koder for multiplekset information om placering, afstand og tid som tidligere rapporteret26,27,38 ud over selvbevægelsessignaler såsom acceleration, hastighed og orientering60.

Vi fandt ud af, at frekvensforvrængning og 8 Hz optogenetiske stimuleringer drastisk ophævede eller fremskyndede theta-rytmer, og førte til nedsat samlet aktivitet i en subpopulation af CA1-pyramideceller, mens de ikke forårsagede signifikante ændringer i stedcelleaktivitet, svarende til tidligere rapporter ved brug af enten farmakologisk hæmning36, 46,47 eller optogenetisk 9,48 pacing af MS eller septale input til hippocampus. Da MS-neuroner er kendt for at være den primære drivkraft for hippocampus-oscillationer, forventede vi, at MS-stimulering ville være forbundet med forstyrret tids- eller distancecelleaktivitet under forhold med reducerede theta-rytmer, men der skete ingen ændringer, når theta blev afskaffet eller pacet. Derudover førte pacing af hippocampus-oscillationer til 8 Hz ikke til ændringer i kvaliteten af ​​rumlige koder som tidligere rapporteret9 og ændrede ikke tidsmæssige koder som observeret i vores adfærdsparadigme.

Selvom det blev rapporteret, at tid (men ikke sted) celler kunne afhænge direkte af de mediale entorhinale cortex (MEC) input61, tyder nylige eksperimentelle beviser på, at MEC læsioner ikke fører til nogen ændringer i hippocampus tidscellefysiologi62. Navnlig fandt en nyere undersøgelse, at optogenetisk pacing af MS ikke forstyrrede de rumlige koder for gitterceller i entorhinalcortex63, hvilket yderligere tyder på, at MS-aktivitet ikke er direkte involveret i rumlige koder i hippocampus-formationen. Sammen med vores resultater indikerer dette, at tidsmæssige koder enten kan være resultatet af MS-afhængige beregninger i entorhinalcortex63 (1) eller genereres iboende i selve hippocampus (2).

Mens tidlige undersøgelser viste, at MS spillede en væsentlig rolle ved at opretholde tidsceller og understøtte arbejdshukommelsen36, viser nyere eksperimentelle beviser, at det nøjagtige bidrag fra tidsceller til arbejdshukommelsens ydeevne kan være mindre end tidligere antaget62. Da MS-PV-neuroner sandsynligvis opretholder betydelige aktivitetsniveauer under optogenetisk stimulering med frekvensforvrængning (i modsætning til inhiberingsmetoder), understøtter vores resultater kraftigt den rolle, som præcist timet septalaktivitet har til at understøtte arbejdshukommelsen, som tidligere antaget. Selvom vi observerede reduceret hukommelsesydelse ved brug af optogenetisk stimulation under genfinding, var stimulering under kodningsfasen af ​​DNMTS-opgaverne ikke forbundet med reduceret hukommelse i DNMTS-opgaven. Pacing af taoscillationerne ved 8 Hz under enten indkodnings- eller genfindingsfasen af ​​NOPR-opgaven førte til svækket hukommelseshentning. Vores elektrofysiologiske analyser afslører yderligere, at en sådan stimulering forårsagede, at fjerne regioner af dorsal CA1 blev medtaget i samme fase med ikke-fysiologisk faselåsning. Selvom vi ikke direkte undersøgte årsagssammenhængen mellem faseændringer og hukommelsesydelse, blev spiketiming og fasepræcession også fundet at være forbundet med ændret arbejdshukommelsesfunktion på trods af, at stedet var kodet intakt64. Desuden har faselåsning af pyramidale neuroner til thetaoscillationer tidligere vist sig at være en forudsigelse for hukommelsesydelse65.

Navnlig er en begrænsning af vores tilgang til at etablere tempora- og distancetuningsegenskaber, at det kræver fire gange mere sampling end et almindeligt lineært spor, hvilket øger chancerne for fotoblegning, når der tilføjes stimuleringsbetingelser til den eksperimentelle tidslinje. Mens vi fandt ud af, at rumlige koder forblev upåvirket af optogenetiske stimulationer inden for samme session, kunne nyere billeddannelseshardware, der inkluderer sensorer med øget følsomhed, hjælpe med at forhindre fotoblegning og give mulighed for længere optagelsessessioner, og dermed prøveudtagning af tids- og distanceceller sammen med stimuleringer. Vi fandt også, at puljen af ​​neuroner, der signifikant og specifikt koder for kun én variabel, er lille i forhold til antallet af konjunktive neuroner, hvilket gør prøveudtagningskravene til disse meget specifikke neuroner meget højere.

Vi leverer eksperimentelt bevis for, at manipulation af MS ikke ændrer bevægelseshastigheden, og at omvendt bevægelseshastighed dikterer theta-frekvensen. Selvom sted- og tidskoderne blev bevaret under vores MS-stimuleringer, blev en del (~6%) af cellerne direkte moduleret og kunne tage højde for hukommelsessvækkelser observeret i vores adfærdsassays. PV interneuroner i hippocampus er tidligere blevet rapporteret at være en del af et mikrokredsløb, der er afgørende for regulering af hukommelseskonsolidering66,67, og vores optogenetiske manipulationer kan være forbundet med dæmpning af en del af disse celler. Desuden, selvom vi ikke observerede ændringer i andre frekvensbånd end theta, kan vi ikke udelukke, at CA1 pyramidalneuron spike timing kunne blive drastisk ændret ved scrambling theta oscillationer, mens 8 Hz stimulation viste sig ikke at resultere i øget hippocampus aktivitet18, hvilket kunne forklare de differentielle virkninger af disse stimulationsmønstre på arbejdshukommelsens ydeevne. De hukommelsessvækkelser, vi observerede, var sandsynligvis ikke-cholinerge: For det første fandt vi i vores immunhistologiske eksperimenter stort set ingen ekspression af ChrimsonR i ChAT-neuroner i MS. For det andet var vores optogenetiske stimulationer ikke forbundet med ændringer i hippocampus krusninger, mens tidligere rapporter indikerer, at stimulering af ChAT-neuroner er forbundet med reduceret bølgefrekvens45,57. ChrimsonR-transfektion af MS VGLUT2-neuroner er også usandsynlig, da aktivering af disse neuroner er forbundet med en direkte stigning i lokomotorisk aktivitet 68, som vi ikke observerede.

Selvom det præcise tidsmæssige arrangement af CA1-pyramidespidser i det mindste delvist kunne forklare virkningerne af MS-stimulering på hukommelsen, bør alternative mekanismer tages i betragtning. Navnlig ud over hippocampus og entorhinal cortex projicerer MS PVneurons til retrosplenial cortex3 og kan være ansvarlige for nogle af de hukommelsessvækkelser, der er observeret her.

Sammenfattende fandt vi, ved hjælp af calcium-billeddannelse, optogenetik og elektrofysiologi, at theta-rytmer kan pacedes eller afskaffes ved hjælp af stimulering af MS. Sådan stimulering svækkede episodisk såvel som arbejdshukommelseshentning. Disse virkninger var ikke-cholinerge og forstyrrede ikke hippocampus krusningsaktivitet. Endelig, mens en lille del af hippocampale neuroner reagerede direkte på optogenetisk stimulering af MS, blev sted, tid og afstandsceller ikke forstyrret af manipulationer af theta-oscillationer. Sammen antyder disse resultater, at mens MS input til hippocampus spiller en væsentlig rolle i hukommelsen, er multipleksede koder i CA1 pyramidale neuroner muligvis ikke det direkte substrat for sådanne funktioner.

Metoder

Dyr

Alle procedurer blev godkendt af McGill University Animal CareCommittee og Canadian Council on Animal Care (protokol 2015-7650). I alt n=41 han- (n=20) og hun- (n=21) 8-16 uger gamle,B6;129P2 PV-Cre-mus (Jackson Laboratory, RRID: IMSR{{ 10}}JAX:017320) blev brugt i denne undersøgelse. n=5 mus blev brugt til at kombinere optogenetik med calcium-billeddannelse; n=3 mus blev implanteret til calciumbilleddannelse, optogenetik og elektrofysiologiske kontroller; n=4 mus blev brugt i elektrofysiologiske undersøgelser; n=29 mus blev transficeret og implanteret til adfærdsanalyser. Musene blev anbragt individuelt i en 12-t lys/mørke-cyklus ved 22 grader og 40 % luftfugtighed med mad og vand ad libitum. Alle eksperimenter blev udført under den lyse del af lys/mørke-cyklussen.

Adeno-associerede virale vektorer

Adeno-associeret virus AAV5.CamKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 (Addgene# 100834, opnået fra University of Pennsylvania Vector Core) blev anvendt i alle calcium-billeddannelsesforsøg. Adeno-associeret virus (AAV) af serotype dj (hybrid capsid skabt ud fra otte forskellige AAVserotyper) AAVdj-hSyn-ChrimsonR-tdTomato blev opnået fra Vector Core Facility ved Oregon Health and Science University i Portland, Oregon. Selvom han er et husholdningsgen, observerede vi ikke transfektion i cholinerge celler (se "Resultater" og fig. 2b-e). En eYFP-konstruktion uden ChrimsonR-sekvensen blev brugt som en kontrol (benævnt YFP-kontrol i dette manuskript).

Kirurgiske indgreb

Mus blev bedøvet med isofluran (5 % induktion, 0,5-1 % vedligeholdelse) og anbragt i en stereotaksisk ramme (David Kopf Instruments). Kropstemperaturen blev holdt med en varmepude, øjnene blev hydreret med gel (Optixcare) og Carprofen (10 ml/kg) blev indgivet subkutant. Kraniet blev fuldstændig renset for alt bindevæv, og små kraniotomier blev udført med en tandbore til efterfølgende injektion eller implantation.

Virale injektioner. Alle virale injektioner blev udført ved hjælp af en glaspipette forbundet til en Nanoject III (Drummond) injektor. 500 nl af AAVdjhSyn-ChrimsonR-tdTomato (eller eYFP-kontrol) blev leveret til MS med en hastighed på 1 nL/s med følgende koordinater baseret på referencemuse stereotaksisk atlas69 (afstand fra Bregma i mm): anteroposterior (AP) 0,85, mediolateral (ML) 0, dorsoventral (DV) -4,50 ved brug af en 5 graders vinkel i ML-planet. Efter operationen blev dyrene overvåget indtil bedring.

Fiberoptisk implantat. To uger efter injektion blev mus bedøvet til implantation efter den samme kirurgiske procedure. En 200 μm diameter fiberoptik med keramisk ferrule (Thorlabs) blev implanteret ved de samme koordinater. Implantater blev cementeret på plads ved hjælp af C&B-Metabond® (Patterson dental). Sort neglelak blev påført over dentalcementen for at blokere lysemission under optogenetisk stimulering.

Elektrodeimplantater. En række af 7 wolfram-mikroelektroder (~1 MΩimpedans) blev sænket i dorsale CA1, der spænder gennem stratumpyramidale (pyr), stratum radiatum (rad) og stratum lacunosummoleculare (lm). Skruer placeret i knoglen over frontal cortex og cerebellum tjente som henholdsvis jord og reference. Efter elektrode-, jord- og referenceplacering blev dental cement påført for at fastgøre implantatet permanent til kraniet.

Implantat til billeddannelse af calcium. Vi injicerede AAV5.CamKII.GCaMP6fvirus (200 nL ved 1 nl s−1) i hippocampus CA1 ved hjælp af følgende koordinater: anteroposterior (AP) - 1,86 mm fra bregma, mediolateral (ML) 1,5 mm, dorsoventral (DV) 1,5 mm. To uger efter injektionen blev mus bedøvet med isofluran, og kraniet blev renset. EN<2 mm diameter craniotomy was performed in the skull above the injection site. An anchor screw was placed on the posterior plate above the cerebellum. The dura was removed, and the portion of the cortex above the injection site was aspirated using a vacuum pump until the corpus callosum was visible. These fiber bundles were then gently aspirated without applying pressure on the underlying hippocampus, and a 1.8 mm diameter gradient index (GRIN; Edmund Optics) lens was lowered at the following coordinates: AP − 1.86 mm from bregma, ML 1.5 mm, DV 1.2 mm. The GRIN lens was permanently attached to the skull using C&B-Metabond (Patterson Dental), and Kwik-Sil (World Precision Instruments) silicone adhesive was placed on the GRIN to protect it. Four weeks later, the silicone cap was removed and CA1 was imaged using a miniscope mounted with an aluminum base plate while mice were under light anesthesia (<0.5% isoflurane) to allow the visualization of cell activity. When a satisfying field of view was found (large neuronal assembly, visible landmarks), the base plate was cemented above the GRIN lens, the mini scope was removed, and a plastic cap was placed on the base plate to protect the GRIN lens.

Samtidig calcium billeddannelse og elektrofysiologiske optagelser. For at kontrollere virkningerne af GRIN-implantater på hippocampus-thetaas samt krydstale mellem mini-scope og optogenetiske excitationslys, fastgjorde vi wolfram-mikroelektroder til GRIN-linser. Til dette formål placerede vi GRIN-linser vandret under et mikroskop med lav forstørrelse i et støvfrit miljø. En wolfram-mikroelektrode blev forsigtigt placeret på den øverste kant af GRIN-linsen ved hjælp af en mikromanipulator. Vi brugte den kendte diameter af GRIN-linsen som referenceenhed til at estimere det ønskede fremspring af elektroden (~50 µm, yderligere vurderet digitalt efter at have taget et mikrofotografi af præparatet) ved vores planlagte implantationskoordinater. Små mængder (~50 µL) superlim blev afsat på den øverste kant af GRIN-linsen med elektroden på plads og efterladt til tørre i ~10 minutter, før det næste lag lim blev påført. Fem tynde lag blev brugt til at fastholde elektroden fastgjort til GRIN-linsen. Efter implantation af disse GRIN-elektrodesamlinger ved hjælp af den ovenfor beskrevne protokol, blev de udragende ledninger forsigtigt bøjet og skjult under en beskyttende hætte (1-1,5 cm høj) hentet fra pæren af ​​amanuel sugepipette som erstatning for Kwik-Sil.

In vivo adfærdsmæssige procedurer

Tilvænning. Mus blev forsigtigt håndteret i ~ 5 minutter over en uge, med progressiv tilvænning til tilslutningsproceduren (fiberoptik, miniskop og elektrofysiologiske præ-forstærkede bånd). Dyrene blev derefter vandplanlagt (2 timers adgang pr. dag).

Miniscope optagelser. Miniskoper (V3) blev samlet ved hjælp af open source-instruktioner (miniscope.org). Billeddata blev erhvervet ved hjælp af en CMOS-billedsensor (Aptina, MT9V032) og multiplekset gennem et letvægts koaksialkabel. Data blev indsamlet ved hjælp af en dataindsamlingsboks (DAQ) forbundet via en USB-værtscontroller (Cypress, CYUSB3013). Dyreadfærd blev registreret ved hjælp af et webkamera (Logitech) af forbrugerkvalitet, monteret over miljøet. Calcium og adfærdsdata blev registreret ved hjælp af miniscope.org, kilde til DAQ customacquisition software. DAQ'en erhvervede samtidig adfærdsmæssige og cellulære billedstrømme ved 30 Hz som ukomprimerede.avi-filer på 1000 frames til 15-minutters optagelsessessioner sammen med tilsvarende tidsstempler for at muliggøre præcis tidsmæssig justering af adfærds- og calciumbilleddata.

In vivo elektrofysiologiske optagelser. Efter 1 uges postkirurgisk opsving og en uges tilvænning til tøjringsopsætningen blev LFP fra implanterede mus registreret. Alle optagede signaler fra implanterede elektroder blev forstærket af tether-forforstærkeren, før de blev digitaliseret ved 22 kHz ved hjælp af et digitalt optagelsessystem (Neuralynx, USA). Optagelser af hvert kanalsignal blev gemt sammen med videooptagelser og TTL-signaler fra laserdioden til efterfølgende analyse.

Optogenetisk stimulation. Laserstimulering blev leveret gennem en fiberoptisk ledning (200 μm diameter) ved hjælp af en laserdiodefiberlyskilde (doriske linser). Lysintensiteten blev kalibreret og bølgelængden korrigeret ved hjælp af Power Meter Bundle med PM100D Console og S130C Slim Photodiode Sensorlight (Thorlabs). Hver pacingstimulering (inklusive 8 Hz) blev udført ved hjælp af 5 ms firkantimpulser. For at anvende krypteret lysstimulering brugte vi en Arduino-mikrocontroller til at generere et hvidt støjoscillationssignal, der føres direkte ind i laserdiodedriverens analoginput. For at udføre tilfældigt udvalgt frekvensstimulering brugte vi en standard 5 s ON, 5 s OFF protokol, men for hver stimuleringsepoke brugte vi en Arduino mikrocontroller for tilfældigt at vælge en stimulationsfrekvens i theta-båndet. Ved anvendelse af optogenetisk stimulation under adfærd, blev et løst stykke varmekrympeslange monteret omkring krydset mellem patchcorden og musens ferruleimplantat for at begrænse synlig lysemission. Lysintensiteter udtrykkes som nominel effekt, som målt ved spidsen af ​​den fiberoptiske implantat-ledningssamling (før kirurgisk placering), og korrigeret for den passende bølgelængde.

Adfærdsanalyser

Lineært spor i sekventiel tone. Musene var vandplanlagt og kunne kun få adgang til vand i 2 timer om dagen fra kl. 18-20. For at adskille rumlige, tidsmæssige og afstandskoder bygger vi en 134 cm lang lineær bane ved hjælp af mellemgrå Lego® klodser, som muliggør lette modifikationer og implementeringer uden behov for permanent at ændre strukturen af ​​labyrinten. Pyroelektriske sensorer blev placeret i hver ende af det lineære spor og var forbundet til en Arduino mikrocontroller. Hver detektion udløste en ny tone i rækkefølge, der indikerer fremskridt for levering af belønning. Følgende toner blev brugt og leveret ved hjælp af apiezo-højttaler: 1 s bip ved 2000 Hz, 250 ms bip ved 3000 Hz og en kontinuerlig tone ved 4000 Hz. Da den sidste, kontinuerlige tone blev udløst, blev en belønning (10 % saccharose i vand) leveret i starten af ​​det lineære spor i hætten på et 15 ml Falcon-rør. Ændringer i løberetningen før udløsning af den næste tone blev betragtet som fejl og udløste ikke belønning. Ydeevne blev målt som antallet af korrekte forsøg (uden fejl) divideret med antallet af samlede forsøg.

Ny genkendelse af objekter. På den første dag fik mus lov til frit at udforske et 45 × 45 cm mørkegrå åbent felt, der indeholdt visuelle tegn (store hvide vandrette og lodrette gitre) på dets vægge i 10 minutter. På den anden dag blev to identiske genstande (hjælpehåndsbase) præsenteret i 10 min. På den tredje dag fik mus lov til at udforske det samme åbne felt, mens placeringen af ​​et af de to objekter blev fortrængt. For at kontrollere for potentielle rumlige præferencebiaser blev både den indledende såvel som den forskudte position af objekter randomiseret. Mus har tilskrevet en tilfældig testrækkefølge, der blev holdt identisk i løbet af de tre testdage. Adfærd blev optaget med et videokamera (Logitech) og analyseret offline. Adfærdsanalyse blev udført blindt for genotypen og behandlingen. Objektudforskning blev defineret som epoker, hvor mus har deres næse inden for 1 cm fra et objekt. RI blev beregnet som følgende:

Automatiseret forsinket ikke-match til prøveopgave. Mus blev vandplanlagt og trænet i en kontinuerlig T-labyrint til en forsinket prøveopgave, der ikke matchede. Kort fortalt blev hvert forsøg opdelt i to faser: prøve og test. I prøvefasen blev den ene arm blokeret, og mus blev tvunget til at udforske den modsatte arm, hvor de modtog en belønning på 50 µL 10% saccharosevand. Efter at have afsluttet prøvefasen, blev mus udsat for en forsinkelse (10 s) i startrummet. Derefter, under testfasen, kunne begge arme udforskes, men kun den modsatte (uudforskede) arm blev lokket, så musene skulle skifte placering mellem prøve- og testfaserne. Mus blev udsat for 10 forsøg (prøve + test) pr. dag i 10 på hinanden følgende dage, og den daglige succesrate blev beregnet som antallet af korrekte forsøg divideret med det samlede antal forsøg.

Post-mortem histologiske analyser

Efter afslutning af adfærdstestning blev mus dybt bedøvet med en blanding af ketamin/xylazin/acepromazin (henholdsvis 100, 16, 3 mg/kg, intraperitoneal injektion) og perfunderet transkardialt med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS. Hjerner blev ekstraheret og efterfikseret natten over i PFA ved 4 grader og efterfølgende vasket i PBS i yderligere 24 timer ved 4 grader. Hjerner og sektioner blev kryobeskyttet i opløsning af 30 % ethylenglycol, 30 % glycerol og 40 % PBS, indtil de blev brugt. Hver hjerne blev derefter sektioneret ved 50 µm ved hjælp af en vibratom: hver sektion blev sekventielt opsamlet i 4 forskellige 1,5 ml rør for at muliggøre forskellige analyser (elektrodeplacering, immunhistokemi).

Immunhistologi. Ved at bruge et rør med opsamlede hjernesektioner (25% prøveudtagning) til hver analyse blev sektioner vasket i 3 x 5 minutter i PBS for at fjerne den kryobeskyttende opløsning. Sektioner blev inkuberet natten over med PGT (0,45% Gelatine og 0,25% Triton i PBS) ved 4 grader. Dernæst blev skiverne inkuberet med primære antistoffer: enten 1:200 gedeanti-cholin-acetyl -transferase fra Millipore eller 1:500 muse anti-PVmonoklonal IgG1 fra Sigma-Aldrich i PGT ved stuetemperatur i henholdsvis 48 timer eller 2 timer. Efter vask på 10, 20 og 30 minutter blev sektioner derefter inkuberet med sekundære antistoffer [1:2000 æselanti-ged koblet med Alexa 488 eller 1:500 gede-anti-mus IgG1 koblet til Alexa 488 (Life Technologies)] i PGT for 45 min. Efter 10, 20 og 30 minutters vask i PBS blev sektioner derefter monteret på glas og permanent dækglas med Fluoromount monteringsmedium, der indeholdt DAPI. Kun mus med den histologisk bekræftede placering af implantater blev inkluderet i denne undersøgelse. For GRIN-linser skulle overfladen af ​​linsen være<100 µm above stratum pyramidale, and GCaMP6f expression was validated using fluorescence microscopy. Electrophysiological implants had to include at least one microelectrode in CA1 stratum radiatum or stratum pyramidale. Finally, the tips of fiber optics had to be within 100 µm of the MS region, and proper construct expression was assessed using fluorescence microscopy.

Dataanalyse

Except for analyses of SWRs and the explicit impact of locomotion on physiological recordings, electrophysiological and calcium imaging analyses were performed only on periods of locomotion (>2 cm s−1 in the open field; >5 cm s−1 på det lineære spor).

Automatiseret sporing af adfærd. For at udtrække information om muses position, hastighed og hovedretning brugte vi DeepLabCut70,71. Kort fortalt trænede vi en model til at opdage muses ører, næse, krop og halebasis. Hovedretningen blev estimeret ved hjælp af vinklen mellem enten hvert øre eller næse og krop, afhængigt af målingens tilgængelighed. Lokationsdata blev interpoleret til calcium-billeddannelsesprøvetagningsfrekvens ved brug af lineær interpolation. Hastigheden blev ekstraheret ved at beregne Δd/Δt, hvor d er afstanden og t-tiden, og efterfølgende udjævnede resultatet ved at anvende et Gauss-filter med sigma=33 ms for at fjerne detektionsartefakter. Hastighedssignaler blev brugt til at identificere perioder med lokomotorisk aktivitet og beregne sted, tid og afstandsmodulation af aktivitet specifikt for disse perioder.

Calcium billeddannelsesanalyse. Calcium billeddannelsesdataanalyse blev udført ved hjælp af MATLAB 2020a og Python 3.8.4. Videooptagelser blev analyseret ved hjælp af Miniscope Analysis pipeline (https://github.com/etterguillaume/MiniscopeAnalysis). Kort fortalt blev stiv (rotation og oversættelse) bevægelseskorrektion anvendt ved hjælp af NoRMCorre72, og videoer blev rumligt nedsamplet (3×) før sammenkædning. Calciumspor blev ekstraheret ved hjælp af CNMFe51 ved hjælp af følgende parametre: gSig=3 pixels (bredde af gaussisk kerne), gSiz=20 pixels (omtrentlig neurondiameter), baggrund_model='ring', rumlig_algoritme='hals', min_korr=0.8 (minimum pixel korrelationstærskel), min_PNR {{17 }} (minimum tærskel for peak-til-støj-forhold).

Rå calciumspor blev filtreret for at fjerne højfrekvente udsving og binariseret: Kort fortalt blev neuroner anset for at være aktive, når den normaliserede calciumsignalamplitude oversteg to standardafvigelser, og førsteordens afledte var over 0 (se ref. 52 for yderligere detaljer om metoden52). For at udtrække neuroner, der var indstillet til specifikke variabler, blev placering, tid og afstand gemt (placering: 3 cm-beholdere; tid: 1 s-beholdere; afstand: 3 cm-beholdere). Ud fra binariserede signaler beregnede vi den marginale sandsynlighed for, at celler er aktive P Að Þ, som vi bruger som en proxy for neuronal aktivitet. Endnu vigtigere er det, at vi så udleder sandsynligheden for aktivitet eller 'sandsynligheden for at være aktiv givet tilstanden tilgængelig' PA j Si ved at bruge indskrevne variable:

hvor M er det samlede antal mulige adfærdstilstande, og P(Si∩Aj) er den fælles sandsynlighed for, at dyret er i bin I samtidig med aktivitetsniveau j (0 eller 1). For at vurdere betydningen af ​​den opnåede MI-værdi genererede vi derefter 1000 blandede surrogater ved hjælp af tilfældige cirkulære permutationer. Vi valgte cirkulære permutationer, fordi de fjerner det tidsmæssige forhold mellem neuronal aktivitet og adfærd, mens de stadig bevarer den tidsmæssige struktur af calciumtransienter og dermed fører til mere konservative resultater (i modsætning til fuldstændig randomisering af hvert datapunkt, hvilket puster resultaternes signifikansværdi op). Fordi blandede surrogater ikke var systematisk normalfordelte, brugte vi en ikke-parametrisk tilgang, hvor p-værdien (pN) svarer til antallet af datapunkter fra den blandede fordeling, der er større end de faktiske data for hver bin, divideret med antallet af permutationer52, 73.

For at bestemme moduleringen af ​​celler ved optogenetiske stimulationer brugte vi en lignende tilgang, men beregnede MI mellem neuronal aktivitet og de binariserede stimuleringssignaler (således behandlet som en adfærdstilstand). Den samme cirkulære blandingsprocedure blev derefter brugt til at udtrække statistisk signifikans.

where P(S|A) is the posterior probability distribution of states given neuronal activity. Using only epochs with velocity >5 cm s−1 blev et træningsdatasæt genereret ved hjælp af 90% af dataene. De resterende 10% af dataene blev brugt til test. En afkodningsfejl blev beregnet ved hjælp af 50 bootstrapped surrogater og en pulje på 160 celler ved hjælp af tilfældigt udvalgte datapunkter med erstatning. Hver neuron antages at være afhængig af hinanden, hvilket i praksis ikke er tilfældet og fører til større rekonstruktionsfejl, men reducerer beregningstiden. Populationens posteriore sandsynlighed blev afledt af følgende ligning:

Sporing af celler over flere dage. Neuroner blev sporet over flere dage ved hjælp af CellReg74: https://github.com/zivlab/CellReg (v1.5.3). Kort fortalt blev rumlige fodspor justeret ved hjælp af stiv justering for at korrigere for rotationer og translationer. Efter justering anså vi kandidatsæt af celler for at være den samme neuron, hvis deres maksimale afstand var<12 µm, and used the modeled spatial correlation threshold (usually in the range 0.6–0.8) to determine the identity of cell pairs across days. Finally, we assessed the stability of the spatial representation using pairwise field correlation (Pearson correlation of tuning curves).

Elektrofysiologisk analyse. Elektrofysiologisk dataanalyse blev udført ved hjælp af MATLAB 2020a ved hjælp af både signalbehandlingen og wavelet-værktøjskassen. Wavelet-foldning blev anvendt på LFP-signaler ved hjælp af komplekse Morlet-bølger ('cmor1-1,5' i MATLAB), når både tids- og frekvensdomænets nøjagtighed var påkrævet. Movingwindow Fourier-foldning (2 s-vindue i theta-båndet, 5 s-vindue i gamma-båndet, 10 ms bevægelige trin) blev brugt, når frekvensdomænets nøjagtighed var privilegeret i forhold til tidsdomænets nøjagtighed (f.eks. toplot-dominant frekvens ved pacing ved brug af optogenetik). Analyse af effektspektraltætheder blev udført, når mus løb ved 5 cm s-1 eller derover, medmindre andet er beskrevet.

Oscillationsstyrke. OS blev beregnet som forholdet mellem kumulativ effektspektraltæthed omkring spidsoscillationsfrekvensen ±1 Hz og den kumulative båndeffekt i theta (4-12 Hz) båndet. Denne metrik bliver 1, når al effektspektraltæthed falder inden for spidsoscillationsfrekvensen (f.eks. 8 Hz, hvis der stimuleres ved denne frekvens).

SWR-detektion og analyse. For at overvåge SWR'er fik mus lov til frit at udforske et åbent felt i 1 0 min, mens de optog. Stimuleringer (forvrænget eller 8 Hz) blev udført med et 5 s ON, 5 s OFF paradigme. Kun perioder med stille hvile blev taget i betragtning til analyse. Til dette formål beregnede vi z-score-forholdet mellem theta/delta-effekt efter filtrering for hvert frekvensbånd, udførte en Hilbert-transformation og betragtede kun perioder, hvor den resulterende værdi var under 0. For at detektere SWR'er filtrerede vi LFP-signaler i 150-250 Hz frekvensbånd og efterfølgende z-scoret. Ripples blev detekteret ved hjælp af findpeaks-funktionen i MATLAB med følgende parametre: threshold=4 sd, minpeakwidth=0 s, minpeakdistance=0.03 s.

Referencer

1. Colgin, LL Rytmer af hippocampus-netværket. Nat. Rev. Neurosci. 17, 239-249 (2016).

2. Tóth, K., Freund, TF & Miles, R. Disinhibering af rotte hippocampalpyramidale celler af GABAerge afferenter fra septum. J. Physiol. 500, 463-474 (1997).

3. Unal, G., Joshi, A., Viney, TJ, Kis, V. & Somogyi, P. Synaptiske mål for mediale septalprojektioner i hippocampus og ekstrahippocampus cortex af mus. J. Neurosci. 35,15812-15826 (2015).

4. Simon, AP, Poindessous-Jazat, F., Dutar, P., Epelbaum, J. & Bassant, M.-H. Affyringsegenskaber af anatomisk identificerede neuroner i den mediale septum af bedøvede og ikke-bedøvede tilbageholdte rotter. J. Neurosci. 26, 9038-9046 (2006).

5. Scotty, F. et al. Særskilte elektrofysiologiske egenskaber af glutamaterge, kolinerge og GABAerge rotteseptohippocampale neuroner: nye implikationer for hippocampus rytmicitet. J. Physiol. 551.927-943 (2003).

6. Manseau, F., Danik, M. & Williams, S. Et funktionelt glutamatergicneuron-netværk i det mediale septum og det diagonale båndområde. J. Physiol. 566, 865–884 (2005).

7. Amilhon, B. et al. Parvalbumin interneuroner af hippocampus tunepopulationsaktivitet ved theta-frekvens. Neuron 86, 1277-1289 (2015).

8. Etter, G. et al. Optogenetisk gamma-stimulering redder hukommelsessvækkelser i en musemodel med Alzheimers sygdom. Nat. Commun. 10, 1-11 (2019).

9. Zutshi, I. et al. Hippocampale neurale kredsløb reagerer på optogenetisk pacing af theta-frekvenser ved at generere accelererede oscillationsfrekvenser. Curr. Biol. 28, 1179-1188.e3 (2018).

10. Bender, F. et al. Theta-oscillationer regulerer bevægelseshastigheden via en hippocampus-til-lateral septumbane. Nat. Commun. 6.8521 (2015).

For more information:1950477648nn@gmail.com