NMR-baseret metabolomisk profilering til radikal opfangning og anti-aldringsegenskaber Del 2

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

2.5. Klassificering af urteekstrakter ved hovedkomponentanalyse

Metabolitvariationen mellem bladene af de testede urter blev yderligere analyseret ved hjælp af multivariat dataanalyse (MVDA). Principal component analysis (PCA), en mønstergenkendelsesmetode, er en uovervåget MVDA, der giver en større forståelse af sammenhængen mellem prøverne. PCA-score-plottene viste adskillelsen af ​​urter i klynger, hvorimod loading-plots fremhævede de metabolitter, der giver adskillelsen [85,86]. PCA-modellen udviste god kondition (R2X=0.997) og høj forudsigelighed (Q2=0.993), hvor variationen mellem R2X(cum) og Q2(cum) var mindre end 0 .3, hvilket indikerer, at hver af urteekstrakterne ligeligt og jævnt bidrog til den observerede gruppeadskillelse. Denne observation var i overensstemmelse med Wheelock et al. [87].

Klik venligst her for at vide mere

Hovedkomponentanalyse-scoreplot viste, at de udvalgte urter blev adskilt i to klynger uden nogen bemærkelsesværdige outliers som vist i figur 4A. Hovedkomponent (PC)1 udviste den største prøvevariation, derefter efterfulgt af PC2. PC1 og PC2 bidrog til procentdelen af ​​varians på henholdsvis 29,7 procent og 24,9 procent. Derfor blev en total varians på omkring 54,6 procent beskrevet af disse pc'er. Resultater fra indlæsningssøjlen afslørede de metabolitter, der er ansvarlige for adskillelsen af ​​urterne i den positive side af PC1 (V.negundo og C.longa) og den negative side af PC1 (P. minus, P. indica, O.javanica og C. caudatus) (Figur 4B).

Data fra indlæsningssøjlen af ​​PC1 opdagede, at phenolforbindelserne, hovedsageligt flavonoidgruppen og phenolsyrer, var ansvarlige for adskillelsen af ​​de udvalgte urter. Quercetin (1), quercetin-3-O-rhamnosid (2), quercetin-3-O-glucosid (3), quercetin-3-O-glucuronid (4), quercetin-3- O-arabinofuranosid (5), rutin (6), mvricetin-derivater (7), catechin (8), epicatechin (9), isorhamnetin (10), astragalin (11), chlorogensyre (12), gallussyre (13), indholdet af coumarsyre (14), ascorbinsyre (15), myresyre (21), fumarsyre (22), 3-methylxanthin (26) og apigenin (28) var for det meste højere i P. minus, P. indica , C. caudatus og O.javanica, da de var beliggende i den negative side af plottet. I modsætning hertil blev V.negundo og C.longa differentieret fra de andre urter ved tilstedeværelsen af ​​serotonin (27) og D-limonen (29) i deres ekstrakter.

2.6. Korrelation mellem bioaktivitet og metabolitter ved hjælp af partiel mindste kvadraters analyse (PLS)

For at forstå sammenhængen mellem de målte bioaktiviteter og metabolitter fundet i de testede urter, blev PLS, som en overvåget MVDA-metodologi, implementeret til at korrelere de uafhængige variable data (NMR kemiske skift af metabolitterne) til dataene for afhængige variabler, som var inhiberingen af ​​DPPH-, ABTS- og ORAC-assays, samt anti-elastase- og anti-collagenase-aktiviteter. Denne metode blev anvendt, fordi PLS har en stor præstation for at forbinde de testede bioaktiviteter med metabolitter, og dermed kan give en model til forudsigelse [88]. Gennem PLS-analysen kunne forholdet mellem bioaktiviteter såsom radikalopfangende aktiviteter og anti-aldringsegenskaber med metabolitter i prøverne etableres. Derfor kunne metabolitter, der var ansvarlige som bioaktive markører, foreslås.

Biplotten er en blanding af score og belastningsplot, der er et resultat af PLS-analysen, som rapporteret af Mediani et al. [80]. Et delvist mindste kvadraters biplot for radikalopfangende aktivitet (Figur 5A) og anti-ældningsegenskaber (Figur 5B) viste, at alle prøver var godt adskilt og klyngede uden nævneværdige outliers. PC1'et adskilte bladene af P. minus, C.caudatus og P. indica fra V. negundo, O.jaoanica og C.longa. Baseret på de radikale rensende aktiviteter og anti-aldringsegenskaber af biplots, præsenterede modellen god fitness (R'Y) værdier på henholdsvis {{10}}.988 og 0.966. I mellemtiden var forudsigeligheden (Q4) for radikalopfangende aktiviteter og anti-aldringsegenskaber på henholdsvis 0,984 og 0,951.

Som vist fra PLS-biplotten af ​​radikalopfangningsaktiviteter (Figur 5A), blev bioaktiviteterne (DPPH, ABTS og ORACassay) rettet mod den positive side af biplotten, som var de mest aktive områder og tættest på P.minus, P. indica og C.caudatus. I modsætning hertil blev V. negundo, O.javanica og C. longa rettet mod de negative sider af biplotten, som blev betragtet som de mindst aktive områder og var længere fra DPPH-, ABTS- og ORAC-assayene og viste en negativ korrelation med bioaktiviteter. I denne situation har P. mimus, P. indica og C.caudatus samlet sig adskilt fra de mindst aktive urter, hvilket indikerer, at disse urter udviste en stærkere radikal-fjernende effekt, hvilket antyder, at disse urteekstrakter kan have indeholdt højere niveauer af phenolsyre forbindelser. Blandt de tre mest aktive urter blev P. minus fundet at være stærkere korreleret med DPPH- og ABTS-analysen, efterfulgt af ORAC-analysen.

Dette fund var i overensstemmelse med in vitro-resultaterne af radikale opfangningsaktiviteter, der var blevet udført. Resultaterne viste, at P. minus udviste en potent fri radikal-fjernende virkning sammenlignet med de andre urter. Resultaterne afslørede således, at P. minus er den mest aktive urt til udrydderen af ​​reaktive iltarter. Signifikante sekundære metabolitter, der bidrog til P. minus' radikalopfangende aktivitet, blev identificeret som quercetin, quercetin-3-O-rhamnosid, catechin, isorhamnetin, astragalin og apigenin.oteflavonoidAlle disse metabolitter var lokaliseret tættere på P. minus og også DPPH og ABTS radikalopfangende assays. En tidligere undersøgelse af Mediani et al.[80] opdagede også, at en frysetørret prøve af planter viste en højere mængde af -glucose, -glucose, catechin og chlorogensyre, hvilket kunne have bidraget til urtens potente DPPH-radikalopfangende kapacitet. Imidlertid kunne den høje radikalopfangende effekt af P.minus også være bidraget af de uidentificerede metabolitter i ekstraktet.

Lignende resultater blev også fundet for anti-aging egenskaber. Figur 5B viser biplotten opnået fra PLS'en af ​​anti-aldringsegenskaber. Bioaktiviteterne (anti-elastase og anti-collagenase aktiviteter) blev projiceret på den positive side af biplotten, som var det mest aktive område og var tættere på P.minus, P. indica og C.caudatus. I modsætning hertil blev V.negundo, O.javanica og C.longa rettet mod den negative side af biplotten, som blev betragtet som det mindst aktive område og var længere væk fra anti-elastase- og anti-collagenase-aktiviteterne. Dette viste en negativ eller svagere korrelation til bioaktiviteterne. I denne situation blev P.mimus, P.indica og C. caudatus grupperet adskilt fra de mindst aktive urter, hvilket indikerer, at disse urteekstrakter udviste større elastase- og kollagenasehæmning. Blandt de tre mest aktive urter blev P. minus igen fundet at have en stærk korrelation med disse anti-aging egenskaber sammenlignet med de andre urter.

Dette fund var i overensstemmelse med in vitro-resultaterne af anti-aldringsegenskaber, der var blevet udført tidligere. Resultaterne afslørede, at P.minus var den mest aktive urt til at hæmme elastase- og collagenase-enzymer. Signifikante sekundære metabolitter, der bidrog til anti-aldringsegenskaberne af P. minus, blev identificeret som quercetin, quercetin-3-O-rhamnosid, myricetinderivater, catechin, isorhamnetin, astragalin og apigenin. Andre metabolitter såsom -glucose, -glucose, fumarsyre og fedtsyre kan også være ansvarlige for bioaktiviteterne. Alle disse metabolitter var placeret tættere på P. minus og anti-elastase- og anti-collagenase-aktiviteterne.

Cistanche kan anti-aging

Diskrimineringen af ​​disse udvalgte urter stemte især overens med prøverne med høj radikalfjernende aktivitet. minus, P.India og C.caudatus, som forventedes at blive skelnet fra de andre på grund af deres høje koncentration af sekundære metabolitter, især flavonoider. Tilstedeværelsen af ​​disse phenoliske forbindelser menes også at bidrage til de større elastase- og kollagenase-hæmmende aktiviteter af disse urter [67-79,89-92].

Bidraget fra bioaktive forbindelser af planteekstrakter til frie radikalers evne til at fjerne frie radikaler og anti-aldringsaktivitet er blevet dokumenteret af forskellige undersøgelser [66,72,75,79,92-101]. Derudover har metabolitter såsom flavonoider (quercetin, kaempferol, myricetin, epicatechin og catechin) og andre phenoler såsom resveratrol og procyanidin B2 vist sig at hæmme elastase og collagenase signifikant [69-71,79].

I denne undersøgelse blev metabolitsignalerne for variabel betydning i projektions(VIP) værdierne identificeret og gennemgået for at opnå de mest signifikante metabolitter, der var korreleret med de testede bioaktiviteter. Dette blev gjort for at øge integriteten af ​​resultaterne præsenteret her, som undersøgte det diskriminerende potentiale af de identificerede metabolitter.puritaner c-vitaminGenerally, the metabolites signal with VIP>{{0}}.5 blev taget i betragtning for at have betydning for diskrimination [102]. I denne undersøgelse kunne alle de metabolitter, der bidrager til radikalopfangende aktiviteter og anti-aldringsegenskaber, klassificeres som signifikante diskriminerende metabolitter, da deres VIP-værdier var over 1,0 (tabel 2). De to PLSbiplots-modeller blev valideret ved hjælp af 100 tilfældige permutationer for at bekræfte validiteten (R2) og forudsigelige (Q2) evner af den originale model med flere modeller, sammenlignet med godheden af ​​pasform. R2 illustrerede, at modellens egnethed var signifikant og forklarede graden af ​​Y-variable i modellen, hvorimod Q2 tilbød modellens prædiktive kvalitet svarende til den, der blev rapporteret af Eriksson et al. [103].

Generally, when the values of R2 and Q² are nearing 1, it reflects an improved presentation of the model in relation to goodness of fit and predictive quality [80]. In this study, R2 and Q2 values for both of the PLS models fell in the range of 0.951-0.988, which indicated outstanding goodness of fit(R2Y(cum)>0.8)and superior predictive ability (Q2(cum)>0.8). Resultater afslørede, at alle Y-aksen opsnapper R< and="" q-="" for="" the="" assays="" in="" radical="" scavenging="" activities="" and="" anti-aging="" properties="" were="" within="" the="" limits="" of=""><0.3 and=""><0.05.>sistancheR2- og Q2-skæringsværdierne lå i intervallet 0.0367-0.0872 og -0.444 til -0.492, henholdsvis, hvilket tyder på, at begge PLS-modeller var gyldige og viste ikke overfit. Derfor kunne disse to PLS-modeller kategoriseres som modeller med god ydeevne, og disse resultater øgede modellernes pålidelighed.

2.7. Relativ kvantificering af sekundære metabolitter

Den relative kvantificering af nogle af de sekundære metabolitter, der var blevet identificeret fra de udvalgte urter, er vist i figur 6. Disse metabolitter blev fundet for det meste højere i de mest aktive urter såsom P. minus, var placeret på den positive side af biplots, og var tættere på næsten alle de testede bioaktiviteter.hvad er cistancheDisse resultater afslørede, at sekundære metabolitter, især fra flavonoidgruppen af ​​forbindelser, der er til stede i høje mængder i P. minus, kunne have bidraget til denne urts frie radikalers udrydder og anti-aldringsegenskaber?

Ved sammenligning med de forskellige strukturer af flavonoidet, der kunne have bidraget til deres effektivitet, blev det bemærket, at hydroxyleringsmønsteret i B-ringen kan være en af ​​de vigtige faktorer for metabolitternes hæmmende virkning på aldrende enzymaktivitet[80] . Sim et al.[104] afslørede også, at på både protein- og mRNA-niveau blev den hæmmende effekt af disse flavonoider kraftig med et voksende antal grupper i B-ringen, og de undersøgte struktur-aktivitetsassocieringen af ​​nogle flavonoider på MMP-1 genekspression i UV-bestrålede humane dermale fibroblaster.

3. Materialer og metoder

3.1. Kemikalier og reagenser

Deutereret methanol-d4(CH3OH-d4), ikke-deutereret KH2PO4, natriumdeuteriumoxid (NaOD), trimethylsilylpropionsyre-d4-natriumsalt (TSP), ethanol og methanol blev leveret af Merck Millipore International (Darmstadt, Tyskland). Quercetin, phosphatbuffer, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH),2,2-azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyre)[ABTS ],Trolox,kaliumpersulfat,2,2'-azobis(2-amidinopropan)[AAPH, epigallocatechin gallat (EGCG),HEPES-buffer, elastaseenzymer,N-methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro,N -Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilid og deuteriumoxid (D2O) blev leveret af Sigma (Aldrich, Tyskland).

3.2. Plantemateriale og prøveudtagning

Friske blade af O.jacanica, P. minus og C.longa blev indsamlet fra Felda Sungai Koyan Satu, Raub og Pahang. V.negundo-blade blev opnået fra Institute of Bioscience, Universiti Putra Malaysia. Friske blade af P. indica blev høstet i University Agriculture Park, Universiti Putra Malaysia, og friske blade af C. caudatus-blade blev indsamlet på Agricultural Institute, Serdang, Selangor. En kuponprøve af disse urter blev placeret på herbariet, Institute of Bioscience, Universiti Putra Malaysia, og hver prøve blev valideret af botanikeren.Anti-aging cistancheAlle bladene blev høstet konsekvent om morgenen på solrige dage for at sikre pålideligheden af ​​metabolitterindholdet. Plottet ved det åbne felt for hver urt blev adskilt i seks dele, og hver prøve blev opsamlet fra hvert segment som seks replikater.

3.3. Prøveforberedelse

Når de var høstet, blev de friske blade vasket under rindende postevand for at fjerne alle rester, tørret med laboratorievævspapir og øjeblikkeligt frosset med flydende nitrogen for at stoppe alle de enzymatiske reaktioner og bevare metabolitterne før lyofilisering. Prøverne blev derefter tørret i en LABCONCO (Kansas City, MO, USA) frysetørrer, indtil ensartet vægt og fugtindhold nåede under 10 procent. Alle de tørrede prøver blev formalet under anvendelse af en laboratorieblender til et fint pulver og sigtet ved anvendelse af en laboratorietestsigte (ENDECOTTS LTD. London, England) med en størrelse på 300 um for at opnå den ensartede størrelse. De pulveriserede prøver blev vakuumpakket i en aluminiumsemballage for at beskytte dem mod lyspåvirkning og fugt og opbevaret i -80 grad før analyser.

3.4. Udvinding

Ekstraktionsproceduren beskrevet af Mediani et al. [105] blev fulgt med nogle modifikationer. Kort fortalt blev 10 g af hver pulveriseret prøve nedsænket i 100 ml 60 procent ethanol i en ravfarvet konisk kolbe og sonikeret i 1 time ved hjælp af en ultralydsbadsonicator (WiseClean, model WUC-D10H, Seoul, Korea) under kontrolleret temperatur (under 40 grader) . Prøverne blev filtreret gennem Whatman-filterpapir nr. 1, og resterne blev genekstraheret to gange og filtreret, efter at den første ekstraktion var afsluttet. Ekstrakterne blev derefter samlet og koncentreret under anvendelse af en rotationsfordamper under vakuum ved 40 grader. De afledte tyktflydende stoffer blev derefter frysetørret ved hjælp af en LABCONCO frysetørrer for at sikre en omfattende eliminering af vand og opbevaret ved -80 grad indtil videre brug. Til sidst blev de tørrede råekstrakter fortyndet til de nødvendige koncentrationer til alle de udførte undersøgelser.

3.5. DPPH Radical Scavenging Activity

Den radikalopfangende aktivitet af prøverne blev bestemt ved at følge teknikken udviklet af Kong et al.[106], som blev udviklet ud fra en modificeret metode af Brand-Williams et al. [107]med en lille ændring. Kort fortalt blev 50 uL prøveekstrakter i methanol i forskellige koncentrationer (0 til 500 ug/ml) tilsat 195 uL frisk fremstillet 0,2 mMmethanolisk2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)opløsning og opbevaret. Alle testprøver blev fremstillet i en plade med 96 brønde. Affarvningsprocessen blev registreret ved 515 nm ved hjælp af et spektrofotometer (Biotek EL 800 mikropladelæser, Bio-Tek, Winooski, VT, USA) efter 60 minutters inkubation i mørke og sammenlignet med positiv kontrol og blindprøver. Procentdelen af ​​radikalopfangende aktivitet blev målt i henhold til følgende ligning:

hvor A kontrol er absorbansen af ​​kontrol uden planteekstrakter og Simple er absorbansen af ​​planteekstrakter.

Planteekstrakterne eller positive kontrolkoncentrationer, der opfangede 50 procent af stabilt frit radikal DPPH, blev beregnet som IC'erne ved at bruge den lineære graf over procentdelen af ​​radikalopfangende aktivitet mod

planteekstrakter/positive kontrolkoncentrationer. Lavere ICso indikerede højere antioxidantaktivitet. Alle eksperimenter blev kørt i seks replikater med Trolox og quercetin som positive kontroller.

3.6.ABTS-radical scavenging assay

For ABTS-radical scavenging-assay blev analysen udført efter proceduren beskrevet af Arnao et al.[108] med nogle ændringer. De fremstillede stamopløsninger var 7 mM ABTS plus opløsning og 2,45 mM kaliumpersulfatopløsning. For at fremstille arbejdsopløsningen blev de to stamopløsninger blandet i de samme mængder og efterladt til at reagere i mørke i 16 timer ved stuetemperatur. Derefter blev arbejdsopløsningen fortyndet med destilleret vand for at opnå en absorbans på 0.700±0,005 enheder ved 734 nm ved anvendelse af et spektrofotometer (UV-1650PC-spektrofotometer, Shimadzu, Kyoto, Japan) og kendt som ABTS plus løsning. ABTS plus-opløsningen blev frisklavet til hver analyse. Denne ABTS plus-opløsning (900 μL) fik lov til at reagere med 100 μL urteekstrakter i 2 min. Absorbansen blev derefter aflæst ved 734 nm under anvendelse af spektrofotometeret. Standardkurven omfattende 3,1 ug/mL til og 50 ug/mL Trolox blev udviklet, og resultaterne blev udtrykt som mg Trolox-ækvivalent antioxidantkapacitet/g prøve (mg TEAC/g prøve).

3.7. ORAC Radical Scavenging Assay

Et ORAC-assay til måling af peroxyl-radikal-fjernende effektivitet blev implementeret som angivet af Huang et al. [109] ved hjælp af FLUOstar OPTIMA mikropladefluorescenslæser (BMG LABTECH, Ortenberg, Tyskland). Hvert urteekstrakt og Trolox (standard) blev fremstillet i 75 mM fosfatbufferopløsning (PBS) pH 7,4. I 96-brøndsort mikroplade blev i alt 150 μL fluorescein (10 nM opløst i PBS) tilsat efterfulgt af 25 μL Trolox, planteekstrakter eller PBS som en blindprøve. Disse opløsninger blev pipetteret i tredobbelte brønde. Mikropladen blev inkuberet i 15 minutter ved 37 grader og dækket med et låg. Fluorescensen blev målt med excitationsbølgelængde ved 458 nm og emissionsbølgelængde ved 520 nm. Baggrundssignalet blev bestemt ved at tage målingen hver 90 s.

Derefter blev 25 µl frisk fremstillet 2,2'-azobis(2-amidinopropan)(AAPH, 240 mM i PBS) indført med injektorer om bord. Nedbrydningen af ​​fluorescens blev derefter taget op til 90 minutter under anvendelse af de samme excitations- og emissionsbølgelængder. Evalueringen blev udført for områderne under kurven for prøver (fluorescens versus tid) minus arealet under kurven for blindprøven og sammenlignet med en standardkurve （25-400 μM Trolox）. ORAC-værdierne relateret til Trolox blev beregnet ved hjælp af ligningen som følger:

3.8. Elastaseinhiberingsassay

Den elastaseinhiberende aktivitet blev bestemt ifølge teknikken beskrevet af Krause et al.[110], med mindre modifikationer af Ndlovu et al. [75]. Prøvebrøndene indeholdt 25 μL 0,1 M HEPES-buffer (pH7,5), 25 μL urteekstrakt (100 ug/mL) og 25 μL elastaseenzym (1 ug/mL). Blanke brønde indeholdt kun 75 μL HEPES-buffer, og de negative kontrolbrønde indeholdt 50 μL HEPES-buffer og 25 μL elastaseenzym. De positive kontrolbrønde indeholdt 25 μL HEPES-buffer, 25 μL N-methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro (10 ug/mL) og 25 μL elastaseenzym. Opløsningsmiddelkontrolbrøndene indeholdt 25 μL HEPES-buffer, 25 μL 10 procent methanol og 25 μL elastaseenzym. Blanke kontroller for urteekstraktet (til farvekontroller af hvert testet ekstrakt) indeholdt 150 μL HEPES-buffer og 25 µl af urteekstraktet. Mikrobrøndspladen blev derefter inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur. Efter dette blev 100 μL substrat (N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilid, 1 mM) tilsat. Derefter blev pladerne inkuberet i yderligere 40 minutter ved 25 grader. Efter inkubation blev absorbansen aflæst ved anvendelse af et spektrofotometer (Biotek EL800 mikropladelæser) ved 405 nm. Den procentvise hæmning af urteekstrakterne blev beregnet ved hjælp af ligningen som følger:

hvor A kontrol er absorbansen af ​​buffer med elastase og opløsningsmiddel, og Atest er absorbansen af ​​buffer, elastase og urteekstrakt eller N-Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Chloro.

3.9. Kollagenaseinhiberingsassay

Kollagenaseinhiberingsaktiviteten blev udført ved at følge fremgangsmåden ifølge Van-Wart og Steinbrink [111] (1981) med modifikationer af Madrone et al. [92]. Testen blev implementeret i 50 mM TES-buffer (pH7,4 med 0,36 mM CaCl2). Kollagenaseenzym fra Clostridium histolyticum (ChC-EC.3.4.23.3) blev fremstillet i en koncentration på 0,8 enheder/ml (opløst i TES-bufferstamopløsning). Det syntetiske substrat N-[3-(2-furyl)acryloyl]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) blev fremstillet i en koncentration på 2 mM i TES-bufferstamopløsning. Det samlede volumen på 15 0 μL for den endelige reaktionsblanding indeholdt 46,3 μL TESbuffer, 60 μL FALGPA (0,8 mM FALGPA slutkoncentration), 18,7 μL collagenaseenzym (0,1 enheder/mL) og hendes 25 μl slutkoncentration (2b) 100 ug/ml). Urteekstrakter og enzymer i TES-buffer blev inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter før tilsætning af substratet for at starte den kemiske reaktion. Negative kontroller blev udført med en TES-buffer. Efter tilsætning af substratet blev absorbansen straks aflæst ved 340 nm ved anvendelse af et spektrofotometer (Benchmark Plus Microplate, Bio-Rad 170-6930, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) i 96-brønds mikrotiterplader og kontinuerligt målt i endnu en 20 min. Positiv kontrol blev udført ved anvendelse af epigallocatechingallat (EGCG) ved 12,5 ug/ml. Procentvis inhibering af prøver blev beregnet ved hjælp af ligningen som følger:

hvor A kontrol er absorbansen af ​​TES buffer, og Atest er absorbansen af ​​TES buffer, collagenase enzym og planteekstrakt eller FALGPA.

3.10. Metabolitprofilering ved hjælp af 'H-NMR-måling

Metabolitprofileringen ved hjælp af H-NMR af udvalgte urter blev udført baseret på protokollen beskrevet af Kim et al. [47] med små ændringer. Rå urteekstrakter (25 mg) blev overført til et ml mikrocentrifugerør. En blanding af methanol-d4 og KHPO4 buffer i Dao (pH 6.0) indeholdende 0,1 procent trimethylsilypropionsyrenatriumsalt (TSP) blev tilsat til urteprøverne med et samlet volumen på { {10}},7 ml i (1:1)-forhold. Mikrocentrifugerørene indeholdende urteekstrakter blev derefter vortexet i 1 min ved stuetemperatur efterfulgt af ultralydbehandling i 15 min. Derefter blev blandingen centrifugeret i 1 0 min ved 5678 g for at adskille supernatanten fra eventuelle uopløselige materialer. Derefter blev 0,6 ml klar supernatant inkorporeret i NMR-rør og underkastet 'H-NMR-analyse. Analysen af ​​'H-NMR blev udført via et 500 MHz Varian INOVA NMR-spektrometer (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA), som fungerede ved en frekvens på 499,887 MHz og spektre blev optaget ved 26 grader. Hvert enkelt spektrum omfattede 64 scanninger med 3,53 minutters optagelsestid og en bredde på 20 ppm. Dataene blev analyseret ved hjælp af Chenomx-software (v.6.2) (Clhenomx Inc, Edmonton, AB, Canada) for at udføre faseinddeling og baseline-korrektion med en ensartet indstilling. Multivariat dataanalyse blev udført ved hjælp af SIMCA-software (version 13.0, Umetrics, Umea, Sverige). 3.11. Bucking af 'H-NMR Spectra

Indsamling af H-NMR-spektre blev implementeret ved at bruge Chenomxsoftware (v.6.2, Edmonton, AB, Canada). Alle spektre blev gemt fra 0.5-10.0 pprn-region med de samme parametre. Parametrene inkluderede en spektral bredde på §0.04, som opnåede i alt 245 integrerede områder for hvert NMR-spektrum. Det kemiske skift for vand og resterende methanol-d ved henholdsvis δ4.70-4.90 og δ3.27-3.35 blev elimineret. De ensartede arkiverede data blev derefter udsat for multivariat dataanalyse (MVDA).

3.12. Relativ kvantificering af metabolitter

De identificerede metabolitter blev undersøgt for deres relative kvantificering, som blev beregnet baseret på signalernes gennemsnitlige topareal efter binning af LH-NMR-spektre.

3.13. Statistisk analyse

Alle resultater af seks replikater blev udtrykt som middel ± standardafvigelse. Til målingerne af radikalopfangende aktiviteter, inhibering af elastase- og kollagenaseaktiviteter og relativ kvantificering af metabolitter, blev statistiske analyser udført under anvendelse af Minitab 16 (version 16, Minitab Inc., State College, PA, USA). Variansanalyser (ANOVA) blev anvendt til at undersøge for de signifikante forskelle mellem middelværdierne med p<0.05 considered="" as="" significantly="" different.="" principal="" component="" analysis="" (pca)="" and="" partial="" least="" square="" (pls)="" from="" the="" multivariate="" data="" analysis="" （mvda）,="" were="" implemented="" using="" simca-p="" software（v.="" 13.0,="" umetrics,="" umeå,="" sweden）using="" the="" pareto="" scaling="" method="" after="" the="" binning="" of="" nmr="" spectra="" was="" completed.="" the="" correlation="" between="" metabolites="" components="" and="" ics0="" values="" for="" dpph="" radical="" scavenging="" activity="" was="" converted="" to="" 1/ic5so="" in="" order="" to="" acquire="" the="" same="" trend="" as="" the="" functional="" properties="">

4 konklusioner

Anvendelsen af ​​H-NMR-analyser kombineret med MVDA var vellykket til at undersøge variationen i metabolitterne af de udvalgte urter. PCA-score-plottet viste en tydelig adskillelse af urterne i henhold til deres klynger. Denne undersøgelse afslørede, at P. minus havde den højeste radikalopfangende effekt gennem DPPH- og ABTS-assays og udviste de højeste anti-aldringsaktiviteter. De to biplots af PLS-analyse validerede dette resultat yderligere, da der blev fundet en stærk sammenhæng mellem metabolitterne identificeret i P. minus og de testede bioaktiviteter. De aktive metabolitter, der menes at bidrage til P.minus' radikalopfangende aktiviteter og anti-aldringsegenskaber, har inkluderet quercetin, quercetin-3-O-rhamnosid, myricetinderivater, catechin, isorhamnetin, astragalin og apigenin. Derfor kan det antages, at disse metabolitter var ansvarlige for P. minus' kraftige radikalopfangende effekt og høje anti-aldringsegenskaber. Disse metabolitter var hovedsageligt fra flavonoidgruppen, især flavonoler. Derfor kan det foreslås, at metabolitterne fra P. minus kunne være en lovende frie radikal-udrydder og hæmmer af aldringsenzymer, der kan bruges til at forsinke aldringssymptomer og til behandling af aldringsassocierede kroniske sygdomme. Disse resultater vil hjælpe med at fastslå styrken af ​​P. minus som en potentiel naturlig kilde til anti-aldringsmidler og som en naturlig udrydder af frie radikaler.

Denne artikel er uddraget fra Molecules 2019, 24, 3208; doi:10.3390/molecules24173208 www.mdpi.com/journal/molecules