Nikotin forværrer tacrolimus-induceret nyreskade ved programmeret celledød

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yu Ji Jiang, Sheng Cui, Kang Luo, Jun Ding

INTRODUKTION

På trods af opdagelsen af ​​nye immunsuppressiva er tacrolimus (TAC) fortsat hjørnestenen i immunsuppressive regimer ved solid organtransplantation. Langtidsbrug af TAC øger imidlertid risikoen for bivirkninger (f.eks. nefrotoksicitet, neurotoksicitet, infektioner, maligniteter, diabetes og gastrointestinale lidelser) [1]. Blandt disse, akuttenyreskadeeller kronisk TAC nefrotoksicitet er blevet rapporteret hos 46 procent af lungetransplanterede [2] og 22,4 procent af nyretransplanterede [3]. Mens akutnyreskadeanses for reversibel efter TAC-dosisreduktion eller fuldstændig seponering, er kronisk nefrotoksicitet, som fører til allotransplantattab, irreversibel. Kronisk TAC nefrotoksicitet er karakteriseret ved glomerulopati, hyalinose af afferente arterioler og stribet tubulointerstitiel fibrose (TIF) [4]. Selvom den nøjagtige mekanisme for dette kliniske dilemma forbliver ukendt, har vi for nylig demonstreret, at oxidativ stress-oprindelig inflammation, transformerende vækstfaktor 1 (TGF- 1) og programmeret celledød kan være vigtige spillere [5]. Cigaretrygning er en kritisk folkesundhedsudfordring og samfundsøkonomisk byrde, som reducerer livskvaliteten. Epidemiologiske rapporter viser, at der i øjeblikket er mere end en milliard cigaretrygere på verdensplan og seks millioner dødsfald årligt på grund af tobaksbrug. Disse rater er begge stigende, især i udviklingslande eller uudviklede lande [6]. Det er velkendt, at cigaretrygning er en risikofaktor for forskellige kræfttyper, kardiovaskulære hændelser (myokardieinfarkt og slagtilfælde) og obstruktive lungesygdomme. I nyrerne øger rygning sværhedsgraden af ​​nyreinsufficiens hos patienter med diabetes, hypertension, polycystisknyresygdomog post-nyretransplantation [7]. Ydermere kan rygning også forårsage de novo nyreskade, selv i en rask befolkning uden forudeksisterende kronisk nyresygdom (CKD) [8]. Denne undersøgelse søgte at evaluere: (1) omnikotin(NIC), en primær toksisk komponent i cigaretrygning, forværrer TAC-induceret nyreskade; og, hvis ja, (2) hvilken mekanisme tegner sig for NIC(nikotin)-accelereret nefrotoksicitet.

cistanches herba kan lindre nyrefunktionen

RESULTATER

Effekt af NIC(nikotin)på grundlæggende parametre

Tabel 1 skitserer virkningerne af NIC(nikotin)om grundlæggende parametre i forsøgsgrupperne. Både NIC(nikotin)og TACincrease UV(polyuri), som blev yderligere øget af NIC(nikotin)og TAC-behandling. Hverken NIC(nikotin)heller ikke TAC forhindrede BW-tab. Urinproteinudskillelse, Scr, BUN og Cys-C var markant højere i begge NIC(nikotin)og TAC-grupper sammenlignet med VH-gruppen; disse niveauer steg yderligere med kombinationen af ​​de to lægemidler, hvilket antyder, at NIC(nikotin)accelererer TAC-induceret nyreinsufficiens. Der var ingen signifikante SBP-forskelle mellem grupper. Fire ugers TAC-behandling øgede blodets TAC-koncentration til 11.0±og ng/mL, mens NIC(nikotin) did not influence blood TAC concentration(12.8±15 ng/mL,p>o.o5 vs. TAC).Derudover behandling af normale rotter med NIC(nikotin)resulterede i en stigning i koncentrationen af ​​cotinin i serum og urin med henholdsvis 56,5±17 ng/mL og 8;6±192,6 ug/dag. Disse serum- og urinkotininkoncentrationer efterligner dem, der er observeret hos mennesker, der er aktive rygere [13].

Tabel 1. Effekt af NIC(nikotin)på funktionelle parametre

Effekt af NIC(nikotin)om histopatologi i kronisk TAC nefrotoksicitet

Kronisk TAC nefrotoksicitet er karakteriseret ved unikke histologiske træk, herunder stribet TIF og glomerulopati. Ved histologisk farvning og elektronmikroskopi fandt vi ud af, at TAC-forårsaget glomerulær skade manifesteres af glomerulær kælderfortykkelse og udslettelse af podocytfodprocesser (fig. IA, IC og D), dette kan være forbundet med øget urinproteinudskillelse. På kvantitative analyser, både NIC(nikotin)og TAC øgede det fraktionelle mesangiale areal, med en yderligere stigning observeret i NIC(nikotin)og TAC-gruppe. De største ændringer i kronisk TAC nefrotoksicitet var begrænset til tubulointerstitielle områder, som afgrænset af tubulointerstitiel fibrøs aflejring, tubulær atrofi og stribet fibrose (fig. 1B, 1E og F). Tallene viser tydeligt, at TIF-scoren i NIC(nikotin)plus TAC-gruppen var højere end i begge NIC(nikotin)gruppen eller TAC-gruppen.

Figur 1. Repræsentative mikrofotografier af periodic acid-Schiff(PAS)(A), Masson trichrom (B), transmissionselektronmikroskopi (CF) og kvantitativ analyse af glomerulær skade og tubulointerstitiel fibrose (TIF); (C) glomerulær basalmembranfortykkelse (pile); (D) udslettelse af podocytfod processer (pile);(E)hævelse af tubulointerstitium og omfattende kollagenaflejring (scatters);(F) atrofierede tubuli (pile).VH, vehikel; NIC(nikotin), nikotin; TAC, tacrolimus. s< o.05="">(nikotin),$p<0.05 vs.tac="" or="">(nikotin).

Effekt af NIC(nikotin)om profibrotisk cytokinekspression i kronisk TAC nefrotoksicitet

Den foreliggende undersøgelse søgte at sammenligne ekspressionen af ​​det profibrotiske cytokin TGF- 1 og CTGF og den ekstracellulære matrix (ECM)-komponent af ig-h; mellem forsøgsgrupperne. I overensstemmelse med TIF-resultaterne, NIC(nikotin)forøget TAC-induceret overekspression af pro-fibrotisk TGF- 1og CTGF og ECM ig-h3(fig.2)

Figur 2. Repræsentative mikrofotografier af immunoblotting-analysetil(A)transformering af vækstfaktor 1 (TGF-B1),(B TGF- -induceret gen-h(ig-h3) og (C) bindevævsvækstfaktor(CTGF). Værdier for proteinekspression er repræsenteret ved at bruge vehikelgruppen (VH) som 1oo procent reference og normaliseret til -actin.NIC(nikotin), nikotin;TAC, tacrolimus. 3 s<0.05 vs.="" nic,="">(nikotin).

Effekt af NIC(nikotin)om inflammation ved kronisk TAC nefrotoksicitet

For at definere effekten af ​​NIC på inflammation i TAC-induceret nyreskade, studerede vi ekspressionen af ​​proinflammatoriske mediatorer og pyroptose-relaterede gener ved immunblotting og immunhistokemi. Fig. 3 viste, at TAC-behandling opregulerede ekspressionen af ​​pyroptose-relaterede cytokiner (ⅡL-1, IL-18 og NLRP3) og MCP-1, hvilket resulterede i ED-1-positiv celleinfiltration, og yderligere stigninger blev fundet ved en kombineret behandling af NIC(nikotin)og TAC.

Figur 3. Repræsentative mikrofotografier af immunhistokemi for ektodermal dysplasi-1 (ED-1)(A) og immunoblot-analyse for proinflammatoriske cytokiner (B). VH, køretøj; NIC(nikotin), nikotin; TAC, tacrolimus; MCP-1, monocytkemotaktisk protein-1;IL, interleukin; NLRP3, NOD-lignende receptor pyrin domæne-holdigt protein3. s(nikotin), cp(nikotin).

Effekt af NIC(nikotin)om oxidativ stress i kronisk TAC nefrotoksicitet

Som vist i fig. 4, kronisk(nikotin)TAC-behandling er tæt forbundet med en ubalance mellem oxidant- og antioxidantenzymer [12,14. Immunoblotting-analyse viste, at NIC opregulerede TAC-induceret NOX-2- og NOX-4-ekspression, men undertrykte SOD1- og SOD2-ekspressioner. Derudover var serum- og urinniveauer af 8-OHdG, en oxidativ stressmarkør, højere i NIC- og TAC-grupperne sammenlignet med VH-gruppen og højest i NIC plus TAC-gruppen. Disse resultater antyder en synergistisk effekt af NIC og TAC på oxidativ stress i denne model.

Figur 4. Repræsentative mikrofotografier af immunoblotting-analyse af en række oxidativ stress-relaterede proteiner (A) og serum (B) og urin (C)8-hydroxy-2'-deoxyguanosin (8-OHdG) koncentrationer. VH, køretøj; NIC(nikotin), nikotin; TAC, tacrolim-us; SOD, superoxiddismutase; NOX,NADPH oxidase.Bp(nikotin).

Effekt af NIC(nikotin)om programmeret celledød ved kronisk TAC nefrotoksicitet

Enten type I (apoptose) eller type II (autofagi) programmeret celledød er involveret i patogenesen af ​​kronisk TAC-induceret nyreskade [1s]. Ved at bruge TUNEL-assay observerede vi, at de fleste TUNEL-positive celler eller apoptotiske legemer var lokaliseret til tubulære epitelceller og interstitielle vaskulære endotelceller, hvor tubulær atrofi og typisk TIF udviklede sig (fig. 5A). Kvantitativ analyse viste, at både NIC(nikotin) og TAC øgede signifikant TUNEL-positive celler sammenlignet med VH-grupperne; dette var mere udtalt i NIC plus TAC-gruppen. På et molekylært niveau, tilføjelse af NIC(nikotin)til TAC-behandlede rotter resulterede i en signifikant dysregulering af Bcl-2/Bax og spaltet caspase-3-ekspression mod celledød (fig. 5B). Derudover viste elektronmikroskopi, at TAC-behandling inducerede en rigelig dannelse af autofagiske rum, såsom initiale autofagiske vakuoler (AVi), nedbrydende autofagiske vakuoler (Avd) og mitofagi (en form for selektiv autofagi) i NIC, TAC og NIC plus TAC-grupper (fig. 6). Kvantitativ immunblotting afslørede, at overekspression af p62-, LC3B-, PINK1- og Parkin-proteiner set i TAC-behandlede rottenyrer blev yderligere øget med NIC (fig. 6G og 6H).

Figur 5. Repræsentative mikrofotografier af TdT-medieret dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) assay(A) og immunblotting-analyse for apoptose-kontrollerende gener (B).Nikotinbehandling øger TUNEL-positive celler (pile) i de tacro-limus-behandlede rottenyrer.VH, vehikel; NIC(nikotin),nikotin; TAC, tacrolimus; Bcl, B-cellymfom; Bax, Bcl2-associeret X. p<0.05vs.tacor>

Effekt af NIC(nikotin)om mitokondriel dysfunktion i kronisk TAC nefrotoksicitet

Ved transmissionselektronmikroskopi observerede vi tydeligt, at både NIC(nikotin)og TAC ødelagde mitokondrielle arkitekturer, som illustreret ved reduceret mitokondriel størrelse og antal, uorganiserede cristae, vakuolisering, fusion, mitofagidannelse og mitokondrier opdelt i to eller tre datterorganeller fission)(Fig.6). Kvantitative analyseresultater viste, at NIC(nikotin) behandling reducerede antallet og størrelsen af ​​mitokondrier yderligere sammenlignet med NIC- eller TAC-behandling alene. Immunoblotting-analyse afslørede, at dysregulering af mitokondrie-relaterede proteiner (OPA1 og Drpi) induceret af enten Nicor ​​TAC blev forværret ved samtidig administration af NIC og TAC (fig. 6).

Figur 6. Repræsentative transmissionselektronmikrofotografier af autofagi og mitokondriel morfologi(AF), immunoblot-analyse (G, H) og kvantificering af mitokondrielt antal og størrelse i hver behandlingsgruppe. (A) Autofagidannelse i nyrerne af tacrolimus (TAC) og/ellernikotin(NIC) behandlede rotter (pil);(B) et autofagisk rum indeholdende mitokondrier nyrerne fra 'TAC og/eller NIC(nikotin)behandlede rotter (mitofagi, pil); (C) normale mitokondrier; (D) reduceret mitokondrietal i nyrerne af TAC og/eller NIC(nikotin)behandlede rotter;(E) mitokondriel fusion set i nyrerne hos TAC- og/eller NIC-behandlede rotter (cirkel);(F) mitokondrier opdelt i to eller flere datterorganeller i nyrerne af TAC- og/eller NIC-behandlede rotter (fission, cirkel) . VH, vehikel;LC3B, let kæde 3B;PINK1, phosphat- og spændingshomolog deleteret på kromosom ti-induceret kinase 1;OPA, optisk atrofiprotein; Drp, dynamin-relateret protein.p(nikotin).

fisetinomnyre

Effekt af NIC(nikotin)om endoplasmatisk retikulumstress i kronisk TAC nefrotoksicitet

Som vist i Fig. 7 inducerede Nicor ​​TAC degranulering af ribosomer, afbrudte og dilaterede cisterner og peroxisomvakuolisering i det ru endoplasmatiske reticulum (ER), hvorimod glat ER-struktur forblev næsten normal (Fig. 7B). Immunoblotting-analyse afslørede, at enten NIC(nikotin)eller TAC øgede ekspressionen af ​​ER-stress-relaterede gener inklusive CHOP, Bip, IRE-1 og ATF-6, men deres ekspression blev yderligere forøget ved kombinationen af ​​de to (fig. 7C).

Figur 7. Repræsentative mikrofotografier af transmissionselektronmikroskopi (A, B) og immunoblotting-analyse af endoplasmatisk reticulum (ER) stress-relaterede gener (C).(A) Normal ru ER (pile); (B) degranulering af ribosomer, afbrudte og dilaterede cisterner og vesikeludvidelse af ru ER inikotin(NIC) og/eller tacrolimus(TAC)-behandlet rottenyre. VH, vehikel;CHOP, C/EBP homologt protein;Bip, bindende immunoglobulinprotein; IRE-1c,inositol-krævende protein-1c; ATF, aktiverende transkriptionsfaktor. s< o.01="" vs.vh,="">(nikotin), cp(nikotin).

DISKUSSION

Cigaretrygning er en vigtig modificerbar risikofaktor for progression af CKD i både raske populationer og patienter med underliggende sygdomme (f.eks. diabetes, hypertension). Kliniske forsøg viser, at cigaretrygning øger udskillelsen af ​​albumin i urinen og påvirker nyrefunktionen negativt [16]; desuden kan rygestop forbedre proteinuri hos patienter med kronisk nyreinsufficiens og type 2-diabetes og bremse udviklingen til nyresygdom i slutstadiet[1-,18]. Desuden bidrager enten modtager- eller donorrygning til afstødningsepisoder og kronisk allotransplantat nefropati, hvilket fører til allotransplantattab ved nyretransplantation [19,2o]. Disse skadelige virkninger af rygning (NIC(nikotin)) er afspejlet af undersøgelser i gnavermodeller af s/6 nefrektomi[2al og diabetisk nefropati [o]. I denne undersøgelse fandt vi, at NIC(nikotin)forværret TAC-induceret fraktioneret mesangiale område og TIF. Disse patologiske ændringer førte til mere udtalt nedsat nyrefunktion og øget proteinudskillelse i urinen. Baseret på disse resultater og andre rapporter foreslår vi, at cigaretrygning kan fremskynde nyreallotransplantattab hos transplanterede, som modtager TAC-baserede immunsuppressiva.

Inflammation spiller en central rolle i udviklingen af ​​kronisk TAC-nefrotoksicitet, fordi den går forud for igangværende nyreardannelse. Øgede proinflammatoriske mediatorer som reaktion på skadelige stimuli kan rekruttere inflammatoriske celler, som igen overudtrykker pro-inflammatoriske og profibrotiske cytokiner såsom kemoattraktanter, adhæsionsmolekyler og TGF- 1. Vi har for nylig påvist, at NLRP3-afhængige og uafhængige inflammasomer er involveret i patogenesen af ​​kronisk TAC nefrotoksicitet [s]. Vores resultater viser, at administration af NIC(nikotin)til TAC-behandlede rotter forstærker ekspressionen af ​​pyroptose-relaterede gener (NLRP3, IL-1 og I-18), proinflammatoriske mediatorer MCP-1 og profibrotiske cytokiner TGF- og CTGF, hvilket fører til til overdreven ED-1-positiv celletilstrømning og ig-h opregulering; disse reaktioner afspejler sværhedsgraden af ​​glomerulære og tubulære skader. Vores resultater er i overensstemmelse med dem fra Arany et al.[22] og Agarwal et al.[23], som viste virkningerne af NIC på nyrebetændelse og fibrose.

Selvom NIC(nikotin)-baseret forværring af kronisk TAC nefrotoksicitet i denne model kan være multifaktoriel, det er sandsynligvis relateret til virkningen af ​​oxidativt stress. Det er velkendt, at kronisk TAC-behandling er tæt forbundet med afferent arteriolopati-relateret hypoxi, som efterfølgende forbindes med oxidativt stress, som igen aktiverer profibrotisk TGF- 1-overekspression, hvilket fører til fibrose. Denne konstruktion understøttes af den observation, at antioxidantterapier (f.eks. coenzym Q10) dæmper TGF- 1-ekspression og TIF via bevarelse af mitokondriel integritet i kronisk TAC nefrotoksicitet 24]. For nylig har overvældende beviser fra in vitro-undersøgelser vist en indbyrdes sammenhæng mellem kronisk NIC-eksponering og oxidativt stress i en række forskellige nyreskader [o,25,26. Heri fandt vi ud af, at NIC øger serum- og urin-8-OHdG-niveauer og øget oxidantproteinekspression, mens det undertrykker antioxidantproteinekspression og derved booster TAC-induceret oxidativ stress samt fibrose. Faktisk kan NIC-forværring af TAC-behandlede nyrer i denne undersøgelse tilskrives oxidativt stress.

cistanche erektil dysfunktion

Det er også muligt, at både apoptose (type I programmeret celledød) og autofagi (type II programmeret celledød) er involveret i NIC(nikotin)-accelereret kronisk TAC nefrotoksicitet. Som tidligere illustreret inducerer NIC direkte podocyt- og renal proksimal tubulicelle-apoptose [27,28]; det inducerer også indirekte apoptotisk celledød via oxidativt stress[2g] eller aktivering af TGF- 1[22].NIC(nikotin)kan også inducere autofagi i pancreas stellate celler Bo], neonatale muse hjertemyocytter 31] og vaskulære glatte muskelceller 32]. Oxidativt stress og programmeret celledød hænger således sammen. Ved hjælp af TUNEL-assay og elektronmikroskopi observerede vi tydeligt, at NIC signifikant øgede antallet af TUNEL-positive celler i tubulære epitelceller, interstitielle vaskulære endotelceller og autofagiske rum i TAC-behandlede rottenyrer. Disse morfologiske ændringer blev ledsaget af dysregulering af apoptose- eller autofagi-relaterede gener i rottenyrer, hvilket førte til celledød. Dette kumulative bevis tyder på, at NIC(nikotin)i sig selv inducerer ikke kun oxidativt stress og programmeret celledød, men fremmer også den negative virkning af TAC på nyrerne, hvilket resulterer i nyreinsufficiens og arkitektonisk skade, som tidligere rapporteret i modeller af streptozotocin (STZ)-induceret diabetisk nefropati [o] og CKD ( s/6 nefrektomi) B3].

Derudover spiller oxidativ stress-oprindede intracellulære organeller såsom mitokondriel dysfunktion og ER-stress en kritisk rolle i kronisk TAC nefrotoksicitetsintegritet, udløser ER-stress og dysregulerer mitokondrielle og ER-stresskontrollerende gener, og virkningerne forværres af kombineret behandling med de to . Forringelse af mitokondriel fitness og ER-stress kan således forklare effekten af ​​NIC(nikotin) på TAC-induceret nyreskade

Vores undersøgelse afslørede, at NIC(nikotin)ved en dosis på 15 mg/kg forværrer TAC-induceret nyreskade gennem oxidativt stress, inflammation og programmeret celledød, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [27,37,38]. Andre har dog observeret modsatte resultater. Sadis et al.Bg] viste, at NICat en dosis på o.s mg/kg beskytter nyren mod iskæmi/reperfusionsskade gennem den kolinerge antiinflammatoriske vej. En anden undersøgelse af Agarwal et al.[23] rapporterede, at langvarig oral behandling med NIC(nikotin)(28 uger) giver renobeskyttende virkninger i en rottemodel af spontan proteinuri (München-Wistar-Frömter-rotter). Årsagerne til denne uoverensstemmelse i rollen som NIC på nyren er ukendte, men kan afhænge af NIC-dosis, lægemiddelbehandlingsvarighed eller gnavermodel. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at løse disse problemer. Denne undersøgelse viser klart, at NIC forværrer TAC-induceret nyreskade i en rottemodel med kronisk TAC nefrotoksicitet. Forværring af oxidativt stress og programmeret celledød kan være en mekanisme, der ligger til grund for de skadelige virkninger af NIC. Vores resultater giver større indsigt i virkningerne af rygning blandt transplanterede modtagere.

cistamche i funktionen af ​​nyre

REFERENCER

1. Bentata Y. Tacrolimus: 2o års brug i voksen nyretransplantation: hvad vi bør vide om dets nefrotoksicitet. Artif-organer 202044140-152.

2. Sikma MA, Hunault CC, van de Graaf EA, et al. Høje tacrolimus-blodkoncentrationer tidligt efter lungetransplantation og risiko for nyreskade. Eur J Clin Pharmacol 201773:573-58o.

3. Yagisawa T, Omoto K, Shimizu T, Ishida H, Tanabe K. Arteriosklerose i nultidsbiopsi er en risikofaktor for tacrolimus-induceret kronisk nefrotoksicitet. Nephrology (Carlton)201s;2o Suppl2:s1-57.

4. Nankvell BJ, P'Ng CH, O'Connell PJ, Chapman JR. Calcineurin-hæmmer nefrotoksicitet gennem linsen af ​​langsgående histologi: sammenligning af cyclosporin og tacrolimus epoker. Transplantation 2016;1oo:1723-171.

5. Lim SW, Shin Y, Luo K, et al. Effekt af Klotho på autophagy clearance i tacrolimus-induceret nyreskade. FASEB J 2o193:2694-2706.

6. Lim SS, Vos T, Flaxman AD, et al. En sammenlignende risikovurdering af sygdomsbyrde og skader, der kan tilskrives 67 risikofaktorer og risikofaktorklynger i 21 regioner, 199o-201o:en systematisk analyse for Global Burden of Dis-ease Study 201o.Lancet 2o12;38o:2224-226o.

7. Formanek P, Salisbury-Afshar E, Afshar M. At hjælpe patienter med ESRD og tidligere stadier af CKD med at holde op med at ryge. Am J Kidney Dis 2018;72:255-266.

8. Jain G, Jaimes EA.Nikotinsignalering og progression af kronisk nyresygdom hos rygere. Biochem Pharmacol 2013;861215-1223.

9. Zhang LY, Jin J, Luo K, et al. Shen-Kang beskytter mod tacrolimus-induceret nyreskade. Koreansk JIntern Med 2019341078-1090.

10. Ibrahim ZS, Alkafafy ME, Ahmed MM, Soliman MM. Curcumins genbeskyttende virkning mod det kombinerede oxidative stress af diabetes ognikotinhos rotter. Mol Med Rep 2016;13:3O17-3026.