Neurobeskyttende virkning af Bu-Shen-Huo-Xue-ekstrakt mod høj glukose-induceret apoptose i PC12-celler

For mere information:ali.ma@wecistanche.com

Shao-Yang Zhao, Xin Dong, Peng-Fei Tu, Ke-Wu Zeng, Xue-Mei Wang

1Research Studio of Integration of Traditional and Western Medicine, First Hospital, Peking University, Beijing, Kina.

2State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing, Kina.

Højdepunkter

Høj glucose (HG)-induceret neurotoksicitet er impliceret i patologien afdiabetikerencefalopati (DE). I vores undersøgelse udviser Bu-Shen-Huo-Xue-ekstrakt (BSHX), en polyurteformel,neurobeskyttendeaktivitet på HG-inducerede PC12-celler, og de mulige mekanismer kan være forbundet med undertrykkelse af generering af reaktive oxygenarter (ROS) såvel som mitokondrier-medieret caspase og JNK/p38 MAPK-signalveje. Denne undersøgelse giver et lovende middel til behandling af DE i kliniske applikationer.

Klik for at cistanche ekstrahere fordele og Cistanche til nyre

Cistancheer en velkendt styrkende urt, der kan nære og beskyttenyrer. I traditionel kinesisk medicin teori,Cistancheer den bedste urt tilnyrer.Cistancheer rig på echinacosid, acteosid og flavonoider. Disse effektive ingredienser iCistanchekan reducerenyrecelleapoptose og stigningnyrecelleproliferation. Derfor,Cistancheer ennaturligt nyretilskud.

Abstrakt

Formål: At undersøge den neurobeskyttende effekt af Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX) ekstrakt, en polyurteformel, mod høj glukose (HG)-induceret neurotoksicitet i PC12-celler. Metoder: Cellelevedygtighedsassay, Lactat Dehydrogenase (LDH) assay, Reactive Oxygen Species (ROS) detektion, Hoechst 33258, Acridine Orange (AO)/Ethidium Bromide (EB) dobbeltfarvning og Mitochondrial Membrane Potential (MMP) assay blev udført. Derudover blev Bax, Bcl-2, caspase-3, spaltet caspase-3, PARP, spaltet PARP, cytochrom c og mitogen-aktiverede proteinkinaser (MAPK'er) påvist ved western blot. Resultater: BSHX-ekstrakt øgede cellelevedygtighed og reducerede LDH-lækage på en koncentrationsafhængig måde i HG-inducerede PC12-celler. Desuden reducerede BSHX-ekstrakt niveauet af intracellulær ROS, øgede mitokondrielle membranpotentiale, regulerede udtryk for Bax og Bcl-2 og hæmmede frigivelsen af ​​cytokrom c fra mitokondrier. Ydermere svækkede BSHX-ekstrakt aktiveringen af ​​caspase-3 og PARP og hæmmede phosphoryleringerne af c-Jun N-terminal kinase (JNK) og p38 MAPK'er. Konklusion: BSHX-ekstrakt udviste en signifikant neurobeskyttende effekt på HG-induceret apoptose i PC12-celler. Denne effekt kan være forbundet med undertrykkelsen af ​​ROS-generering såvel som mitokondrier-medieret caspase og JNK/p38 MAPK-signalveje.

Nøgleord:diabetisk encefalopati, traditionel kinesisk medicin, Bu-Shen-Huo-Xue ekstrakt,neurobeskyttendehøj glukose

Forkortelse: AO: acridin orange; BSHX: Bu-Shen-Huo-Xue; DE: Diabetisk encefalopati; DM: Diabetes Mellitus; DMSO: Dimethylsulfoxid; EB: Ethidiumbromid; ERK: Ekstracellulært regulerede proteinkinaser; HG: Høj glukose; JNK: c-Jun N-terminal kinase; LDH: Lactat Dehydrogenase; MAPK'er: mitogen-aktiverede proteinkinaser; MWP: Wu-Zi-Yan-Zong-recept; MTT: 3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl] 2, 5-diphenyltetrazoliumbromid; PBS: Phosphat Buffer Saline; PBST: Phosphate-bufret saltvand, 0,1 procent Tween 20; ROS: Reaktive iltarter; T2DM: Type 2 Diabetes Mellitus; TCM: Traditionel kinesisk medicin

Baggrund

I de senere år har diabetisk encefalopati (DE), en komplikation til diabetes mellitus (DM), som opstår i centralnervesystemet (CNS), fået bred opmærksomhed. DE kan være forbundet med flere risikofaktorer såsom alder, varighed og glykæmisk kontrol af diabetes [1, 2]. De kliniske manifestationer af DE er morfologiske og fysiologiske ændringer i hjernen og deraf følgende kognitiv dysfunktion. Hyperglykæmi, oxidativt stress og kronisk inflammation kan være de vigtige patogene årsager til DE [3]. Selvom et stigende antal eksperimenter har vist, at langvarig vedvarende hyperglykæmi kan fremskynde hjernens aldring, er den præcise patogenese af DE uudforsket.

Apoptose er en programmeret celledød, der styres af gener for at opretholde stabiliteten af ​​mikromiljøet. Proteinerne involveret i apoptose omfatter Bcl-2-familien, caspaser, p53 osv. Bcl-2-familien er opdelt i to kategorier, en der fremmer celledød, såsom Bax, og den anden modstår apoptose, såsom Bcl-2. De kan regulere apoptose via caspase-signalvejen, som er en kaskadeamplifikationsreaktion af irreversibelt finit hydrolysesubstrat af caspase [4-6]. Derudover har undersøgelser vist, at høj glukose (HG)-induceret apoptose er forbundet med mitokondriel dysfunktion, DNA-skader og overdreven produktion af reaktive iltarter (ROS) [7]. En undersøgelse af diabetiske mus viste, at Adenosin 5'-monophosphat (AMP)-aktiveret proteinkinase (AMPK), en intracellulær energi- og stressreceptor, kunne hæmme ROS-medieret apoptose. Desuden har stigende beviser vist, at inhibering af mitogen-aktiverede proteinkinaser (MAPK'er) kan være gavnlig for inhibering af neuronal apoptose. En anden rapport viste, at c-Jun N-terminal Kinase (JNK), Extracellular Regulated Protein Kinases (ERK), p38 MAPK signalveje potentielt kan regulere neuronal apoptose [8,9].

Baseret på traditionel kinesisk medicin teori,nyreessensmangel og blodstase betragtes som grundlæggende patogenese af DE. Derfor er strategien for nærendenyrerog aktiverende blod er almindeligt anvendt i kliniske applikationer til DE. Tidligere undersøgelser kunne bekræfte, at modificeret Wu-Zi-Yan-Zong-recept (MWP), en recept, der sigter mod nærendenyrer, kan forbedre kognitiv svækkelse og beskytte neuroner ved at reducere A-toksicitet [10, 11]. Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX) recept, hvor igle er tilføjet baseret på MWP, er specifikt formuleret tilnærenyrerog aktivere blod. Nylige undersøgelser har vist, at BSHX-recept kan forbedre DM-patienters hukommelsesforringelsessyndrom, hvilket tyder på kraftige neurobeskyttende egenskaber [12]. Den detaljerede farmakologiske mekanisme for BSHX er dog stadig uklar. I denne undersøgelse sigter vi mod at observere den beskyttende effekt af BSHX-ekstrakt på HG-inducerede PC12-celler og udforske potentielle molekylære mekanismer.

Metoder

Materialer og reagenser

Alle urter blev købt fra Kang Ren Tang Chinese Medicine Co., Ltd. (Beijing, Kina) og godkendt af Dr. PF Tu, farmakognoser, ifølge Chinese Pharmacopoeia (The Pharmacopoeia Commission of PRC, 2010). 3- [4, 5-Dimethylthiazol-2-yl] 2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) var fra Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, USA). Et lactat dehydrogenase (LDH) assay kit blev købt fra Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. (Nanjing, Jiangsu, Kina). Acridine Orange (AO)/Ethidium Bromide (EB) dobbeltfarvningssæt og Hoechst 33258 blev opnået fra Solar Co., Ltd. (Beijing, Kina). Et mitokondrielt membranpotentiale assaykit med JC-1, 2, 7-dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) blev købt fra Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, Kina). Primære antistoffer for caspase-3, spaltet caspase-3, PARP, spaltet PARP, cytokrom C, Bax, Bcl-2, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p -JNK og -tubulin blev opnået fra Cell signaling Technology (Boston, MA, USA).

Fremstilling af BSHX ekstrakt

BSHX består af syv medicinske komponenter (tabel 1). Til fremstilling af BSHX ekstrakt, Tsizi (Cuscuta Chinensis Lam.), Gouqi (Lycium barbarum L.), Fupenzi (Rubus chingii Hu), Wuweizi (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill.), Cheqiancao (Plantago Asiatica L.), Shuizhi ( Hirudo nipponica Whitman.) og Yinyanghuo (Epimedium brevican Maxim.) blev blandet i forholdet 8:8:4:1:2:1:8 og nedsænket i et samlet volumen på 10 gange (v/w) destilleret vand i 30 min. , derefter kogt i 1 time og kogt igen i 1 time i et samlet volumen på 5 gange (v/v) destilleret vand. Supernatanterne blev kombineret og tørret ved lyofilisering. Det endelige tørrede ekstrakt var 25 procent (vægt/vægt) af vægten af ​​de rå urter, og en kuponprøve blev deponeret i Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Peking University Health Science Center, Beijing, Kina.

Cellekultur

Rottefæokromocytomcellelinjer (PC12-celler) blev opnået fra Peking Union Medical College Cell Bank (Beijing, Kina) og dyrket i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Macgene, Beijing, Kina) suppleret med 10 procent føtalt bovint serum (Biowest, Frankrig) ) og 1 procent Penicillin-Streptomycin (100×, Macgene, Beijing, Kina) i en fugtig inkubator indeholdende 95 procent luft og 5 procent CO2 ved 37 grader.

Prøvebehandling

I den indledende test blev PC12-celler behandlet med BSHX-ekstrakt (20, 50, 100 mg/L) alene i 48 timer for at evaluere cytotoksiciteten. Til neurobeskyttende effektanalyse af BSHX-ekstrakt mod høj glukose (HG)-induceret neurotoksicitet blev PC12-celler behandlet med BSHX-ekstrakt (20, 50, 100 mg/L) og HG (75 mM) i 48 timer, efterfulgt af MTT-assay for cellelevedygtighed. Alle de andre assays blev udført under de samme betingelser med området for BSHX-ekstraktkoncentration fra 20 til 100 mg/L.

Cellelevedygtighedsanalyse

PC12-celler blev podet i 96-brøndsplader ved en tæthed på 3,5 × 103 celler pr. brønd. Efter inkubation med BSHX-ekstrakt (med eller uden HG) i 48 timer blev supernatanten fjernet, og MTT-opløsning (0,5 mg/ml) blev tilsat. Efter inkubation ved 37 grader i 4 timer blev MTT-opløsningen fjernet, og cellerne blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) til omrystning i 5 minutter. Den optiske densitet (OD) blev målt ved 570 nm under anvendelse af en mikropladelæser. Cellelevedygtighed ( procent )=[OD (behandling) – OD (blank)]/ [OD (ubehandlet kontrol) – OD (blank)] × 100 procent .

LDH assay

PC12-celler blev dyrket og stimuleret til HG- og BSHX-ekstraktbehandling som beskrevet tidligere. Derefter blev LDH frigivet fra cellerne detekteret ved anvendelse af et kommercielt LDH-kit ifølge producentens instruktioner. Absorbansen blev målt ved 45 0 nm. LDH (U/L)=[OD (behandling) – OD (blank)] / [OD (standard) – OD (blank)] × 0,2 (mmol/L) × 1000.

Hoechst 33258-farvning og AO/EB-farvning

Til Hoechst 33258-farvning blev cellerne fikseret med 4 procent paraformaldehyd i 30 min. Derefter blev cellerne vasket med Phosphate Buffer Saline (PBS) 3 gange og inkuberet med Hoechst 33258 arbejdsopløsning (1 ug/ml) i mørke i 30 minutter ved stuetemperatur. Billeder blev optaget ved hjælp af et fluorescensmikroskop (IX73, Olympus, Japan) under excitationsbølgelængde 352 nm/emissionsbølgelængde 461 nm. Til AO/EB-farvning skal du fjerne mediet fra 96-brøndsplader og tilsætte AO/EB-blanding (100 ug/ml AO og 100 ug/mL EB blandet) i 5 minutter i mørke ved stuetemperatur. Derefter blev cellerne vasket med PBS 3 gange. Cellerne blev visualiseret ved anvendelse af et fluorescensmikroskop under excitationsbølgelængde 490 nm/emissionsbølgelængde 530 nm for AO-farvning og excitationsbølgelængde 520 nm/emissionsbølgelængde 590 nm for EB-farvning.

Intracellulær ROS-detektion

Til intracellulær ROS-detektion blev PC12-celler podet i 6-brøndsplader ved en tæthed på 5×105 og underkastet HG- og BSHX-ekstraktbehandling i 24 timer. Efter inkubation 24 timer blev PC12-celler vasket med serumfrit Dulbeccos modificerede ørnemedium i 3 gange og tilsat 10μΜ 2', 7'-dichlorfluoresceindiacetat (DCF-DA), som oxideres til fluorescerende 2', 7'-dichlorfluorescerende (DCF) af hydroperoxider ved 37 grader i 30 minutter i mørke. Derefter blev cellerne vasket med kold PBS 3 gange og resuspenderet i PBS. Det intracellulære niveau af ROS blev påvist ved at måle den gennemsnitlige fluorescensintensitet ved flowcytometri (BD FACSCaliburTM, USA). Excitations/emissionsbølgelængderne var ved 488/525 nm. Der blev talt mindst 10,000 hændelser pr. stikprøve. Værdierne blev udtrykt som middelabsorbansen normaliseret til procentdelen af ​​kontrolværdien.

Mitokondriel membranpotentialanalyse

Mitokondriel depolarisering blev vurderet ved hjælp af et kommercielt JC-1-assaykit. Efter at være blevet behandlet med HG- og BSHX-ekstrakt blev cellerne inkuberet med JC-1-arbejdsopløsning (1 ×) ved 37 grader i 15 minutter i mørke. Fjern derefter supernatanten og vask cellerne 2 gange med JC-1 bufferopløsning (1 ×). Cellerne blev visualiseret ved hjælp af et fluorescensmikroskop under excitationsbølgelængde 460 nm/emissionsbølgelængde 530 nm for JC-1 monomer (detekteret i celler med depolariserede mitokondrier), og excitationsbølgelængde 520 nm/emissionsbølgelængde 3 JC0 59 }} polymer (til stede i polariserede mitokondrier). Cellerne med grøn (monomer) fluorescens blev anset for at have depolariserede mitokondrier; cellerne med rød (polymer) fluorescens blev anset for at have normale mitokondrier.

Western blot analyse

PC12-celler blev opsamlet og lyseret i kold RIPA-buffer med en 1 x cocktailproteaseinhibitor. Supernatanten blev opsamlet ved højhastighedscentrifugering ved 12,000 rpm i 10 min. ved 4 grader. Proteinkoncentrationer blev bestemt ved Bradford-assayet. Cytosol- og mitokondrierberigede fraktioner blev isoleret med Mitochondria Isolation Kit (Pierce, Rockford, USA) til cytochrom c-analyse. For andre proteiner blev totale cellelysater adskilt ved SDS-PAGE (10 procent -15 procent) og overført til polyvinylidenfluorid (PVDF)-membraner. Polyvinylidenfluoridmembranerne blev derefter blokeret med 5 procent fedtfri mælk og inkuberet med de angivne primære antistoffer ved 4 grader natten over. Membranerne blev vasket med PBST (phosphatpufret saltvand, 0,1 procent Tween 20) tre gange og inkuberet med sekundære antistoffer ved stuetemperatur i 2 timer. Derefter blev membranerne vasket med PBST yderligere tre gange og visualiseret ved hjælp af et forbedret kemiluminescerende substrat og scannet med Kodak Digital Imaging System (Gel Logic 2200Pro, Kodak, USA).

Statistisk analyse

Alle værdier er udtrykt som middel ± standardafvigelse (SD). Betydningen af ​​forskellene mellem middelværdier blev bestemt ved en-vejs variansanalyse (ANOVA) ved hjælp af Statistical Package for Social Sciences (SPSS 16.0 software). P < 0.05="" sammenlignet="" med="" kontrolgruppen="" blev="" betragtet="" som="" statistisk="">

Resultater

BSHX-ekstrakt beskytter PC12-celler mod HG-induceret celleskade

For at undersøge, om BSHX-ekstrakt kunne beskytte PC12-celler mod HG-fornærmelse, behandlede vi PC12-celler med en række BSHX-ekstraktkoncentrationer (20, 50 og 100 mg/L) i 48 timer under HG (75 mM) betingelser. Vurdering af cellelevedygtighed ved hjælp af MTT-assayet viste, at HG-fornærmelse forårsagede et signifikant fald i levedygtigheden af ​​PC12-celler (cellelevedygtighed var ca. 56,9 ± 6,7 procent), og at BSHX-ekstraktbehandling signifikant forhindrede celledød på en koncentrationsafhængig måde. Cellelevedygtigheden steg til 87,8 ± 9,2 procent, når cellerne blev co-behandlet med BSHX-ekstrakt (100 mg/L) (figur 1A). Lactatdehydrogenase (LDH) frigives fra beskadigede celler og kan derfor også bruges som indikator for celletoksicitet. I overensstemmelse med resultaterne af MTT-assayet fandt vi, at HG-fornærmelse øgede LDH-frigivelse fra PC12-celler signifikant, og at BSHX-ekstraktbehandling forhindrede LDH-frigivelse på en koncentrationsafhængig måde (figur 1B). Disse resultater tyder på, at BSHX-ekstrakt øger cellelevedygtighed i HG-inducerede PC12-celler.

BSHX-ekstrakt hæmmer PC12-celleapoptose via den caspase-9/3-afhængige vej

For at bestemme effekten af ​​BSHX-ekstrakt på celleapoptose brugte vi DNA-farvestof Hoechst 33258 som et følsomt assay for apoptose. Kernerne af normale celler farvet af Hoechst 33258 viste ensartet blå fluorescens, mens apoptotiske celler, som nuklear kromatin uklar pyknose, viste hyperkromatiske og tætte fluorescerende partikler. Procentdelen af ​​apoptose blev beregnet i henhold til antallet af apoptotiske celler vs. det totale antal celler. Vores data afslørede, at HG (75 mM) fornærmelse dramatisk øgede andelen af ​​apoptotiske celler (51,7 ± 4,3 procent), og BSHX-ekstraktbehandling beskyttede signifikant mod HG-induceret apoptose i PC12-celler (figur 2A). Disse resultater blev yderligere understøttet af AO/EB dobbeltfarvningsanalyse. AO kommer ind i både normale og apoptotiske celler og udsender grøn fluorescens, hvorimod EB kun kommer ind i apoptotiske celler og udsender rød fluorescens [13]. AO/EB-assayet viste, at procentdelen af ​​apoptotiske celler steg signifikant efter HG (75 mM) fornærmelse (47,8,7 ± 2,6 procent) og faldt ved BSHX-ekstraktbehandling i PC12-celler (figur 2B), hvilket tyder på, at BSHX-ekstrakt effektivt kunne hæmmer apoptosen af ​​PC12-celler induceret af HG.

Derefter undersøgte vi effekten af ​​BSHX-ekstrakt på caspase-3/PARP-vejen, en vigtig vej for mitokondrierelateret apoptose [14]. Western blot afslørede, at HG (75 mM) fornærmelse signifikant øgede ekspressionen af ​​aktive former for caspase-3 og PARP og reducerede udtryk for total caspase-3 og PARP i PC12-celler, og denne effekt blev markant vendt. ved BSHX-ekstraktbehandling (Figur.2C), hvilket tyder på, at BSHX-ekstrakt effektivt beskyttede PC12-celler mod apoptose via regulering af den mitokondrieafhængige caspase-3/PARP-vej.

BSHX-ekstrakt hæmmer intracellulær ROS-produktion i HG-inducerede PC12-celler

Da HG kunne øge dannelsen af ​​intracellulær ROS [15], testede vi niveauet af intracellulær ROS for at bestemme, om BSHX-ekstrakt kunne hæmme dannelsen af ​​ROS. Der blev observeret en 3.23--fold stigning i gennemsnitlig fluorescensintensitet i PC12-celler, der blev udsat for 75 mM HG i 48 timer sammenlignet med kontrol. I modsætning hertil reducerede samtidig behandling med BSHX-ekstrakt den gennemsnitlige fluorescensintensitet til ca. 0.76-, 0.{{10}} og 0.{ {12}} gange af modelgruppen, henholdsvis, hvilket indikerer, at BSHX-ekstrakt kunne hæmme produktionen af ​​ROS induceret af HG (figur 3A, B).

BSHX-ekstrakt opretholder mitokondriel homeostase i HG-inducerede PC12-celler ved at regulere Bax- og Bcl-2-ekspression

Mitokondrielt membranpotentiale er en vigtig parameter for mitokondriel funktion, der bruges som en indikator for cellesundhed. JC-1 er et lipofilt, kationisk farvestof, der selektivt kan trænge ind i mitokondrier og reversibelt ændre farve fra grøn til rød, når membranpotentialet øges. I raske celler med højt mitokondriemembranpotentiale danner JC-1 spontant komplekser kendt som J-aggregater med intens rød fluorescens. På den anden side, i apoptotiske celler med lavt mitokondrielt membranpotentiale, forbliver JC-1 i den monomere form, som kun viser grøn fluorescens [16, 17]. Forholdet mellem grøn fluorescens og rød fluorescens kan derfor afspejle mitokondriel depolarisering. I vores undersøgelse blev antallet af celler med depolariserede mitokondrier (grøn fluorescens) signifikant forøget efter HG (75 mM) i 48 timer, og denne stigning blev vendt ved BSHX-ekstraktbehandling på en koncentrationsafhængig måde (Figur.4A).

Vi opdagede derefter de mitokondrielle og cytoplasmatiske distributioner af cytochrom c, en nøglespiller i den aktiveringscaspase-afhængige apoptosevej. Vi fandt, at HG (75 mM) fornærmelse i 48 timer inducerede en dramatisk translokation af cytochrom c fra mitokondrier til cytoplasmaet, og denne flytning blev signifikant forhindret af BSHX-ekstraktbehandling (Figur.4B), hvilket indikerer, at BSHX-ekstrakt kunne hæmme frigivelsen af cytochrom c fra mitokondrier.

Desuden er Bcl-2-familieproteiner vigtige regulatorer af forskellige apoptotiske veje. Bcl-2 kan hæmme celleapoptose forårsaget af en række forskellige cytotoksiske faktorer og er inhibitoren af ​​cytochrom c-frigivelse fra mitokondrier til cytoplasmaet. Imidlertid er Bax, som medlem af Bcl-2-familien, en pro-apoptosefaktor. Når apoptose induceres, migrerer Bax fra cytoplasmaet til mitokondrierne og ødelægger mitokondriernes integritet [5, 18]. I vores undersøgelse blev proteinniveauet af Bcl-2 nedreguleret, og Bax blev opreguleret af HG (75 mM) fornærmelse i 48 timer, denne effekt blev koncentrationsafhængigt vendt af BSHX-ekstrakt (Figur.4C). Alle disse resultater ovenfor antydede, at BSHX-ekstrakt beskyttede PC12-celler mod HG-induceret mitokondriel depolarisering ved at regulere ekspressionen af ​​Bax og Bcl-2.

Effekt af BSHX-ekstrakt på celleapoptose via JNK/p38 MAPK-signalveje

Nogle undersøgelser har vist, at øget ROS-produktion har været forbundet med aktiveringen af ​​MAPK-veje for at udløse celleapoptose9 [19, 20]. Så vi undersøgte effekten af ​​BSHX-ekstrakt på Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) signalvejen for at bestemme, om BSHX-ekstrakt kunne svække HG-induceret apoptose. Som vist i figur 5 øgede HG (75 mM) insult i 48 timer phosphoryleringerne af c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) og p38 i PC12-celler, som blev signifikant hæmmet af BSHX-ekstrakt i en koncentration- afhængig måde. Et lignende resultat blev dog ikke observeret med Extracellular Regulated Protein Kinase (ERK) MAPK. Resultaterne tyder på, at BSHX-ekstrakt kunne hæmme HG-induceret celleapoptose via JNK/p38 MAPK-signalveje.

Diskussion

Diabetisk encefalopati (DE) er en almindelig komplikation til type 2 diabetes mellitus (T2DM). Det kan forårsage kognitiv svækkelse af hjernen og er en vigtig risikofaktor for dødelighed og handicap hos type 2-diabetes mellitus-patienter verden over [3]. Det er således afgørende at studere mekanismen for DE såvel som dets forebyggelses- og behandlingsstrategier.

I Kina har traditionel kinesisk medicin (TCM'er) været brugt til behandling af DM i mange år og har vist en helbredende effekt. Nogle kliniske undersøgelser tyder på, at TCM'er baseret på nærende nyrer og aktiverende blodstrategier kan nedregulere blodsukkeret, fremme cirkulationen og forbedre hjernens kognitive dysfunktion. BSHX-recept er en repræsentant for disse TCM'er. Vores foreløbige kliniske undersøgelse viste, at BSHX-recept effektivt kunne forbedre blodsukker, homocystein (HCY) og højfølsomt C-reaktivt protein (hs-CPR) i serum og forbedre den kognitive funktion hos diabetiske patienter med mild kognitiv svækkelse (MCI) [12]. Der er dog mangel på beviser for at bevise effektiviteten og den farmakologiske mekanisme indtil videre.

I denne undersøgelse fandt vi, at BSHX-ekstrakt kunne svække cellelevedygtighedsreduktionen induceret af HG, som målt ved MTT, LDH-assay. For yderligere at udforske den beskyttende effekt af BSHX-ekstrakt på cellelevedygtighed studerede vi apoptose ved Hoechst 33258 og AO/EB-farvningsanalyse. Resultaterne viste, at BSHX-ekstrakt signifikant kunne reducere apoptose induceret af HG. Som markør for apoptose var caspase-3 og PARP signifikant forøget efter behandling med HG, men aktiveringen af ​​disse pro-apoptotiske faktorer blev hæmmet af BSHX-ekstrakt på en koncentrationsafhængig måde. Ovenstående resultater indikerede, at BSHX-ekstrakt havde en beskyttende virkning på PC12-cellebeskadigelse induceret af HG.

ROS dannes under processen med oxidativ fosforylering af celler, og dets stigning i produktionen eller beskadigelse af antioxidantsystemer kan føre til oxidativt stress i celler [21]. Undersøgelser har vist, at høj glucose kan give anledning til akkumulering af intracellulær ROS og i sidste ende en aktiv apoptotisk signalvej. Og den almindelige mekanisme for diabetiske komplikationer er oxidativt stress [22, 23]. Vores resultater viste, at høj glukose kunne føre til stigningen af ​​ROS i PC12-celler, hvilket var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [24]. Det spekuleres i, at toksiciteten af ​​høj glucose til celler kan opnås gennem ROS-induceret apoptose. Mitokondrier er de vigtigste steder for intracellulær ROS-produktion og også det vigtigste målorgan for ROS-angreb [25]. Under patologiske forhold kan den hurtige stigning af ROS resultere i mitokondriel dysfunktion, mitokondriel membranpotentiale kollaps og i sidste ende føre til celleapoptose [26]. Så vi opdagede integriteten af ​​mitokondrierne. Vores resultater viste, at høj glukose signifikant reducerede mitokondriemembranpotentialet, øgede forholdet mellem Bax/Bcl-2, der kontrollerede skiftet af mitokondriel permeabilitetsovergangspore (MPTP), og fremmede lækagen af ​​cytokrom c, mens BSHX-ekstrakt kunne vende disse ændringer. Disse tyder på, at det neurobeskyttende af BSHX-ekstrakt mod HG-inducerede PC12-celler kan skyldes opretholdelse af mitokondriers integritet.

MAPK-signalvejen spiller også en vigtig rolle i celleapoptose. JNK, ERK og p38 MAPK er de mest undersøgte medlemmer af MAPK-familien. Deres vigtigste virkemåde er at fosforylere deres specifikke steder og derved regulere celleapoptose [8, 27, 28]. Desuden har undersøgelser vist, at overdreven produktion af ROS kan udløse p38MAPK-phosphorylering [29-31], og ROS kan inducere eller mediere aktiveringen af ​​MAPK-vejene [32]. Adskillige cellulære stimuli, der inducerer ROS-produktion også parallelt, kan aktivere MAPK-veje i flere celletyper [32, 33]. De potentielle mekanismer for MAPK-aktivering af ROS kan omfatte inaktivering og nedbrydning af MAPK-phosphataserne, der opretholder pathwayen i en inaktiv tilstand [19]. På den anden side, for yderligere at bekræfte, om MAPK-veje blev aktiveret af ROS-generering, blev celler forbehandlet med antioxidanter (f.eks. NAC, en ROS-opsamler) for at forhindre ROS-akkumulering. Og resultaterne viste, at MAPK-aktivering næsten blev hæmmet efter cellestimulering med cellulære stimuli [32, 33], hvilket indikerer involvering af ROS-inaktivering af MAPK-veje. Derudover viste undersøgelser, at når celler blev behandlet med den specifikke JNK-hæmmer SP600125, kunne apoptosen induceret af Cardiotoxin III blive blokeret [34]. Vores tidligere undersøgelse viste, at modificeret Wu-Zi-Yan-Zong-recept (MWP) kunne hæmme aktiveringen af ​​ERK/p38 MAPK i A-aktiveret BV2 mikroglia [10]. I denne undersøgelse fandt vi imidlertid ud af, at BSHX-ekstrakt kunne hæmme phosphoryleringen af ​​JNK og p38 MAPK, og vi opnåede ikke det samme resultat med p-ERK. Vi spekulerer i, at igler spiller en anden rolle i BSHX-ekstrakt. Resultaterne tyder på, at en anden beskyttelsesmekanisme af BSHX-ekstrakt mod apoptose i HG-inducerede PC12-celler kan være gennem reguleringen af ​​JNK/p38 MAPK-signalveje.

Konklusion

BSHX-ekstrakt, en polyurteformel, viser neurobeskyttende virkninger på PC12-celler mod HG-fornærmelse. BSHX-ekstrakt hæmmede effektivt HG-induceret PC12-celleapoptose ved at reducere intracellulær ROS-generering, opretholde integriteten af ​​den mitokondrielle membran og blokere caspase--3- og JNK/p38 MAPK-signalveje (figur 6). Samlet tyder vores resultater på, at BSHX-ekstrakt er et lovende middel til behandling af DE i kliniske applikationer.

Forfatterbidrag

Udtænkt og designet eksperimenterne: Zeng KW, Wang XM. Foretog eksperimentet: Zhao SY. Analyserede dataene: Zhao SY, Zeng KW og Wang XM. Bidragede reagenser/materialer/analyseværktøjer: Zhao SY, Dong X, Tu PF, Zeng KW og Wang XM. Skrev pater: Zhao SY.

Referencer

1 Riederer P, Korczyn AD, Ali SS, et al. Den diabetiske hjerne og kognition. J Neural Transm 2017, 124: 1-24.

2. Hamed SA. Hjerneskade med diabetes mellitus: beviser, mekanismer og behandlingsimplikationer. Expert Rev Clin Phar 2017, 10: 409-428.

3. Testa R, Bonfigli AR, Prattichizzo F, et al. Teorien om "metabolisk hukommelse" og den tidlige behandling af hyperglykæmi til forebyggelse af diabetiske komplikationer. Nutr 2017, 9: 437-445.

4. Ly JD, Grubb DR, Lawen A. Det mitokondrielle membranpotentiale (Δψm) i apoptose; en opdatering. Apoptosis 2003, 8: 115-128.

5. Aouacheria A, Baghdiguian S, Lamb HM, Huska JD, Pineda FJ, Harwick J M. Forbinder mitokondriel dynamik og liv-eller-død begivenheder via Bcl-2 familieproteiner. Neurochem Int 2017, 109: 141-161.

6. Bernardi P, Scorrano L, Colonna R, et al. Mitokondrier og celledød. Mekanistiske aspekter og metodiske problemstillinger. Feb J 1999, 264: 687-701.

7. Yang L, Wu L, Du S, et al. 1,25-(OH)2D3 hæmmer høj glucose-induceret apoptose og ROS-produktion i humane peritoneale mesothelceller via MAPK/P38-vejen. Mol Med Rep 2016, 14: 839-844.

8. Tabakman R, Jiang H, Schaefer E, et al. Forbehandling af nervevækstfaktor dæmper oxygen- og glucosemangel-induceret c-Jun aminoterminal kinase 1 og stressaktiveret kinaser p38 og p38 aktivering og giver neurobeskyttelse i fæokromocytom PC12-modellen. J Mol Neurosci 2004, 22: 237-250.

9. Zou W, Zeng J, Zhuo M, Xu W, Sun L, Wang J, et al. Involvering af caspase-3 og p38 mitogenaktiveret proteinkinase i cobaltchlorid-induceret apoptose i PC12-celler. J Neurosci Res 2002, 67: 837-843.

10. Yu Q, Song FJ, Chen JF, et al. Antineuroinflammatoriske virkninger af modificeret Wu-Zi-Yan-Zong-recept i -amyloid-stimuleret BV2-mikroglia via NF-KB og ERK/p38 MAPK-signalvejene. Evid-Based Compl Alt 2017, 2017: 1-10.

11. Zeng KW, Zhang T, Fu H, et al. Modificeret Wu-Zi-Yan-Zong-recept, en traditionel kinesisk polyurteformel, undertrykker lipopolysaccharid-inducerede neuroinflammatoriske processer i rotteastrocytter via NF-KB og JNK/p38 MAPK signalveje. Phytomed 2012, 19: 122-129.

12. Fu H, Lin WW, Wang H, et al. Effekt af Bushen Huoxue-recept på behandling af mild kognitionsvækkelse af type 2-diabetes. Chin J Integr Trad West Med 2017, 37: 661-665.

13. Baskić D, Popović S, Ristić P, et al. Analyse af cycloheximid-induceret apoptose i humane leukocytter: Fluorescensmikroskopi ved anvendelse af annexin V/propidiumiodid versus acridinorange/ethidiumbromid. Cell Biol. Int 2006, 30: 924–932.

14. Galluzzi L, Lópezsoto A, Kumar S, et al. Caspaser forbinder celledødssignalering med organisk homeostase. Immunity 2016, 44: 221-231.

15. Hamed S, Brenner B, Roguin A. Nitrogenoxid: en nøglefaktor bag dysfunktionaliteten af ​​endotelstamceller i diabetes mellitus type-2. Cardiovasc Res 2011, 91: 9-15.

16. Perelman A, Wachtel C, Cohen M, et al. JC-1: Alternative excitationsbølgelængder letter mitokondriel membranpotentialcytometri. Cell Death Dis 2012, 3: e430.

17. Perry SW, Norman JP, Barbieri J, et al. Mitokondriel membranpotentiale prober og protongradienten: en praktisk brugsvejledning. Biotech 2011, 50: 98-115.

18. Chipuk JE, Green D R. Hvordan inducerer BCL-2-proteiner mitokondriel ydre membranpermeabilisering? Trends Cell Biol 2008, 18:157-164.

19. Søn Y, Cheong YK, Kim NH, et al. Mitogen-aktiverede proteinkinaser og reaktive oxygenarter: hvordan kan ROS aktivere MAPK-veje? J Signal Transduct 2011: 792639.

20. Zhang L, Zhang Z, Chen F, et al. Aromatiske heterocykliske estere af podophyllotoxin udøver anti-MDR-aktivitet i human leukæmi K562/ADR-celler via ROS/MAPK-signalvej. Eur J Med Chem 2016, 123:226-235.

21. Kanninen K, White AR, Koistinaho J, et al. Målretning af glykogensyntasekinase-3 til terapeutisk fordel mod oxidativ stress ved Alzheimers sygdom: Involvering af Nrf2-ARE-vejen. Int J Alzheimers Dis 2011, 2011:985085.

22. Babizhayev MA, Strokov IA, Novikov VV, et al. Oxidativt stresss rolle i diabetisk neuropati: Generering af frie radikale arter i glykationsreaktionen og genpolymorfismer, der koder for antioxidantenzymer til genetisk modtagelighed for diabetesneuropati i populationen af ​​type I-diabetespatienter. Cell Biochem Biophys 2015, 71: 1425-1443.

23. Volpe C, Villardelfino PH, Dos PA, et al. Cellulær død, reaktive oxygenarter (ROS) og diabetiske komplikationer. Cell Death Dis 2018, 9: 119-127.

24. Chen K, Zhang M, Chen BD, et al. Ginkgolid B hæmmer apoptose i højglukosestimulerede humane endotelceller i navlestrengsvenen. Chinese Pharmacological Bulletin 2017, 33: 378-383.

25. Goldsteins G, Keksa-Goldstein V, Ahtoniemi T, et al. Skadelig rolle af superoxiddismutase i mitokondrielle intermembrane rum. J Biol Chem 2008, 283: 8446-8452.

26. Cowan KJ, Storey KB. Mitogen-aktiverede proteinkinaser: nye signalveje, der fungerer i cellulære reaktioner på miljøstress. J Exp Bio 2003, 206: 1107.

27. Wu N, Lin X, Zhao X, et al. MiR-125b fungerer som et onkogen i glioblastomceller og hæmmer celleapoptose gennem p53- og p38MAPK-uafhængige veje. Brit J Cancer 2013, 109: 2853.

28. Shi L, Yu X, Yang H, et al. Avancerede glykeringsslutprodukter inducerer apoptose af humane corneale epitelceller gennem generering af reaktive oxygenarter og aktivering af JNK- og p38 MAPK-veje. Plus One 2013, 8: e66781.

29. Chung H, Kim E, Lee DH, et al. Ghrelin hæmmer apoptose i hypothalamus neuronale celler under oxygen-glucosemangel. Endocrinology 2007, 148: 148.

30. Palanivel K, Kanimozhi V, Kadalmani B. Verrucarin A ændrer cellecyklusregulerende proteiner og inducerer apoptose gennem reaktiv oxygenarteafhængig p38MAPK-aktivering i den humane brystcancercellelinje MCF-7. Tumor Biology 2014, 35: 10159.

31. Hua X, Chi W, Su L, et al. ROS-induceret oxidativ skade involveret i patogenese af svampekeratitis via p38 MAPK-aktivering. Sci Rep 2017, 7: 10421.

32. Mccubrey JA, Lahair MM, Franklin RA. Reaktive oxygenarter-induceret aktivering af MAP-kinase-signalvejene. Antioxid Redox Signal 2006, 8: 1775-1789.

33. Torres M, Forman H J. Redox-signalering og MAP-kinasevejene. Biofactors 2003, 17: 287-296.

34. Chien CM, Yang SH, Yang CC, Chang LS, Lin SR. Cardiotoxin III inducerer c-jun N-terminal kinaseafhængig apoptose i HL-60 humane leukæmiceller. Cell Biochem Funct 2008, 26: 111-118.