Naturlig infektion af parvovirus hos vilde fiskekatte (Prionailurus Viverrinus) afslører eksisterende viral lokalisering i nyrerne

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrakt

Carnivore protoparvovirus-1 (CPPV-1), en viral art, der indeholder kattepanleukopenivirus (FPV) og hundeparvovirus (CPV), er vidt spredt blandt husdyr og vilde kødædere, der forårsager systemiske dødelige sygdomme. Vilde fiskekatte (Prionailurus viverrinus), en globalt sårbar art, er fundet døde. Postmortem undersøgelse af kadaverne afslørede læsioner i tarm, milt ogRenal. CPPV-1-antigenidentifikation i disse væv ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR) og immunhistokemi (IHC) understøttede infektionen med virussen. PCR- og IHC-positivitet i nyrevævafslørede atypisk lokalisering af virussen, mens in situ hybridisering (ISH) og transmissionselektronmikroskopi (TEM) med pop-off-teknikken bekræftede den første beskrivelse af viral lokalisering inyrer. Fuldstændig genomkarakterisering og udledt aminosyreanalyse af den opnåede CPPV-1 fra fiskekattene afslørede FPV som et forårsagende agens. De detekterede FPV-sekvenser viste aminosyremutationer ved I566M og M569R i capsidproteinet. Fylogenetiske og evolutionære analyser af komplette kodende genomsekvenser afslørede, at fiskekattens CPPV-1-genomer er genetisk klynget til FPV-genomerne isoleret fra huskatte i Thailand. Siden 1970'erne har disse genomer også vist sig at dele en genetisk udvikling med kinesiske FPV-stammer. Denne undersøgelse er det første bevis på CPPV-1-infektion hos fiskekatte, og det er det første, der viser dets lokalisering inyrer. Disse resultater understøtter multi-værtsområdet for denne parvovirus og tyder på, at dødelige CPPV-1-infektioner kan resultere i andre sårbare vilde kødædere.

Nøgleord: nyrevæv; nyresygdomme, nyre, nyre, renal tubulær

Introduktion

Slægten Prionailurus, familien Felidae, er kategoriseret som en gruppe plettede, små, vilde katte, der er hjemmehørende i Asien [1]. Prionailurus-slægten omfatter fire formelt anerkendte vilde kattearter, herunder leopardkatten (P. bengalensis), fladhovedkatten (P. planiceps), rustplettet kat (P. rubiginosus) og fiskekatten (P. viverrinus) [2]. Fiskerkatten lever hovedsageligt i nærheden af ​​sumpe og mangrover. Den lever udelukkende i Syd- og Sydøstasien og er mere udbredt i Thailand [3, 4]. På nuværende tidspunkt er fiskekattepopulationer truet, da vådområderne, hvor de lever, er blevet ødelagt i løbet af det sidste årti. Som følge heraf anses denne art i øjeblikket for at være sårbar og er på den røde liste for Den Internationale Naturbevarelsesunion (IUNC) [3]. På grund af tabet af deres levesteder har fiskekattekolonier migreret og lejlighedsvis levet i områder, hvor husdyr og mennesker lever [5]. Dette fænomen med delt miljø kan føre til øget afsmitning af patogener mellem modtagelige vilde dyr og husdyr og omvendt. Rapporter om dødelige udbrud hos enten vilde dyr eller husdyr, der kan være et resultat af patogenspild, er blevet dokumenteret i løbet af de sidste par årtier [6-9]. Transmissionsdynamikken for patogener fra disse dyr bør derfor undersøges og kræver yderligere undersøgelse.

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREFUNKTIONEN

Carnivore protoparvovirus-1 (CPPV-1), en viral art inklusive mink enteritis virus (MEV), vaskebjørn parvovirus (RPV), feline panleukopenia virus (FPV) og varianter af hunde parvovirus (CPV), er blevet anerkendt som et vigtigt patogen forbundet med dødelige sygdomme i både vilde og tamme Canidae og Felidae familier [10, 11]. FPV, et almindeligt patogen af ​​Felidae-arterne, er blevet antaget at være en fælles forfader til CPV [12-14]. CPV inficerer ofte dyr i Canidae-familien, og der er stigende tegn på infektion i Felidae-familiens modstykke [9, 15, 16]. Tidligere er FPV og CPV blevet antaget at være en værtsbegrænset virus. Imidlertid indikerede adskillige fund efterfølgende, at nogle dyr i familien Canidae kunne spille en rolle som et reservoir for FPV eller omvendt [11, 17, 18]. Desuden har flere rapporter indikeret, at FPV- og CPV-varianterne (CPV-2a, -2b og -2c) deler modtagelige værter. Disse værter er ikke kun husdyr, men også en række kødædende arter [15, 19, 20], hvilket tyder på en multi-vært række af CPPV-1 [11].

Fra 1996 til 1997 blev CPV-varianter først påvist i leopardkatte og blev oprindeligt udpeget som leopardkatteparvovirus (LCPV), hvilket tyder på den første beskrivelse af CPPV-1 i slægten Prionailurus [21, 22]. Nogle af disse LCPV-stammer viste sig at være genetisk divergerende fra de tidligere beskrevne CPV-2a og -2b på grund af en mutation af G300A-aminosyren i capsid-(VP)-proteinet. Dette resulterede i en ændring i dets antigene egenskaber, der nu bruges som et unikt mutationspunkt til at differentiere CPV-2c fra andre CPV-varianter [22]. Opdagelsen af ​​den nye CPV-variant (i øjeblikket kendt som CPV-2c) hos leopardkatte understøttede ideen om co-evolution af CPPV-1 blandt dyrearter. Senere blev infektioner af FPV- og CPV-varianter rapporteret hos leopardkatte [9]. Dette tydede på, at andre arter i samme slægt som leopardkatten (slægten Prionailurus) kan være modtagelige for CPPV-1-infektion. Indtil nu er modtageligheden for CPPV-1-infektion hos andre arter i slægten Prionailurus stadig stort set ukendt. At afkode, hvordan CPPV-1-varianter udvikler sig, og hvordan nye varianter opfører sig, kan hjælpe med at belyse, hvordan man forhindrer et muligt udbrud af den nye variant. Selv hvis den nye virus får bredere værtsområder, kan fatale udbrud eller atypiske læsioner i forbindelse med infektionen observeres hos en ny, modtagelig vært. Denne undersøgelse beskriver en dødelig CPPV-1-infektion hos vilde fiskekatte (Prionailurus viverrinus). Genetisk karakterisering af den opnåede CPPV-1 afslører FPV som et forårsagende agens. Dette fund giver det første bevis på FPV-infektion i denne art, og det afslører den unikke cellulære tropisme af denne virus. Yderligere belysning af FPV-infektion og dens varianter i denne art er nødvendig for dens redegørelse for global infektion i talrige sårbare arter.

Materialer og metoder

Dyr og rutinemæssig postmortem undersøgelseI juni 2019 udpegede to vilde fiskekatte (P. viverrinus), sagsnr. 1 & 2 blev fundet døde i forstadsområdet i Nakhon Ratchasima-provinsen, Thailand. Senere i august 2019 blev en anden fiskekat, udpeget til sagsnr. 3, var ved at blive reddet fra området, hvor de to første fiskekatte blev fundet. På grund af sværhedsgraden af ​​dehydrering, sagsnr. 3 døde under henvisning til dyrehospitalet. Disse tre fiskekatte blev sendt til postmortem undersøgelse som en rutineproces. Desværre var prøver af fritgående tamme dyr eller vilde arter i det samme område ikke tilgængelige; derfor var de ikke inkluderet i denne undersøgelse. Der blev udført rutinemæssig postmortem undersøgelse på alle fiskekatte. Selektive vitale organer, herunder lunge, lever, hjerte, milt ognyreblev udtaget fra alle fiskekatte, mens tarmen og mesenterial lymfeknude desuden blev indsamlet fra fiskekat nr.3. Alle udvalgte væv blev indsendt til histologisk undersøgelse og udtaget individuelt til yderligere molekylære assays. Til histologi blev vævene nedsænket i 10% (v/v) neutralt bufret formalin i mindst 24 timer og rutinemæssigt behandlet. Derefter blev de farvet med hæmatoxylin og eosin

(H&E) ved hjælp af standardprocedurer forud for undersøgelse af en ACVP-bestyrelsescertificeret veterinærpatolog (TK). Friske vævsprøver opnået fra de tre fiskekatte blev opbevaret ved -80˚C til molekylære undersøgelser. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne og reglerne efter godkendelse fra Chulalongkorn University Animal Care and Use Committee (nr. 1931036).

Generelle virologiske molekylære assaysDe friske vævsprøver, herunder hjerte, lunge, lever, milt ognyreaf alle fiskekatte plus yderligere tarm- og mesenterisk lymfeknudevæv fra fiskekat nr. 3, blev udsat for viral nukleinsyreekstraktion ved individuelt at homogenisere dem med 1 procent (v/v) phosphatbufret saltvand (PBS). Efterfølgende blev den totale virale nukleinsyre ekstraheret under anvendelse af et kommercielt viral nukleinsyreekstraktions II-kit (Geneaid, Taipei, Taiwan) efter producentens forslag. De ekstraherede nukleinsyrer blev derefter kvalificeret og kvantificeret ved deres A260/A280-absorbansforhold ved anvendelse af spektrofotometrimetoden (NanoDrop, Thermo Scientific™, Waltham, MA, USA). Alle ekstraherede nukleinsyrer blev yderligere underkastet viral molekylær undersøgelse ved anvendelse af polymerasekædereaktion (PCR) analyse med adskillige pan-virologiske familie PCR-testpaneler, herunder påvisning af herpesvirus [23], paramyxovirus [24], pneumovirus [25], calicivirus [26], influenzavirus [27], bocavirus [26, 28], parvovirus [29] og coronavirus [30, 31]. PCR-protokollerne, reagenserne, cyklusforhold og positive/negative kontroller, der anvendes i reaktionerne, er beskrevet i S1-filen. PCR-detektionsspecifik for glyceraldehyd- 3-phosphatdehydrogenase (GAPDH)-genet fra katte blev brugt som en intern kontrol som beskrevet tidligere [32]. Efterfølgende blev de positive PCR-amplikoner visualiseret ved hjælp af en QIAxcel-kapillærelektroforeseplatform (Qiagen, Hilden, Tyskland) som tidligere beskrevet [33]. De positive amplikoner af hver PCR-assay blev oprenset og underkastet tovejs Sanger-sekventering (Macrogen Inc, Seoul, Sydkorea). På grund af moderat autolyse af vævene var det ikke muligt at udføre bakteriologisk undersøgelse på disse fiskekatte.

In situ CPPV-1-detektion ved hjælp af immunhistokemi (IHC), in situ hybridisering (ISH) og transmissionselektronmikroskopi (TEM)

Indledende virologisk molekylær screening afslørede positive amplikoner af pan-parvovirus PCR, og sekventeringsresultaterne viste også potentielle DNA-sekvenser af CPPV-1. Disse resultater fik os til yderligere at bekræfte tilstedeværelsen af ​​CPPV-1 og til at lokalisere fordelingen af ​​CPPV-1 i fiskekattes væv. Formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) væv, herunder lunge, lever, hjerte, milt,nyreog tarm blev udsat for CPPV-1 IHC-detektion ved hjælp af et muse monoklonalt anti-canine parvovirus-antistof (ab59832, Abcam, Cambridge, UK) med peberrodsperoxidase (HRP) detektionssystem (EnVision polymer, Dako, Glostrup, Danmark) . Kort fortalt blev FFPE-sektionerne skåret til 4-μm tykkelse og yderligere afparaffineret og rehydreret. Objektglassene blev derefter forbehandlet, endogen peroxidase blokeret og behandlet som tidligere beskrevet [11]. Sektioner af tarmvævet fra en FPV-inficeret kat og en CPV-inficeret hund blev brugt som positive kontroller, mens identiske snit inkuberet med oprensede gedemuse- og kanin-IgG'er (IHC universal negativ kontrolreagens, kode ADI-950-231-0025, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), blev anvendt som negative kontroller. Vedrørendenyretubulær nekrose til stede i de områder, hvor CPPV-1 IHC positive signaler blev observeret,nyresektioner af alle fiskekatte blev udsat for Periodic AcidSchiff (PAS) speciel farvning for at demonstrere den cellulære arkitektur afnyrevæv.

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYRESYGDOMME

Desuden FFPEnyresektioner af fiskekatte nr. 1 & 3 blev udsat for ISH- og TEM-analyse for at understøtte resultatet af positiv CPPV-1 IHC-farvning og ultrastrukturelt demonstrere de virale partikler inyrevæv, henholdsvis. Til ISH blev CPPV-1 DNA-proben, der dækker 393 bp [34] af capsid-genet af CPPV-1, konstrueret ved hjælp af et PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz), ifølge producentens forslag. Den termiske cyklusreaktion og tilstand blev udført som tidligere beskrevet [34] med undtagelsen ved at anvende de digoxigenin (DIG)-mærkede oligonukleotider. Den konstruerede hybridiseringsprobe blev visualiseret og bekræftet ved størrelsesopløsning på 1,5% (vægt/volumen) agarosegelelektroforese. ISH med kromogent DNA blev udført som tidligere beskrevet [26] med mindre modifikationer. Kort fortalt, efter afparaffinisering, rehydrering og efterfølgende skylning i PBS, blev de 4-μm-tykke FFPE-objektglas udsat for proteolytisk fordøjelse, postfiksering og præ-hybridisering. Objektglassene blev derefter hybridiseret med 25 ng/μL ISH-proben ved 42˚C natten over. Hybridiseringssignalerne blev visualiseret ved kobling med 100 μL anti-DIG-AP Fab-fragmenter (Roche, Basel, Schweiz) (1:200 i 1X Blocking-opløsning) i kombination med Liquid Permanent Red (LPR) (Dako, Glostrup, Danmark) . Objektglassene blev derefter modfarvet med hæmatoxylin. Røde præcipitater i korrelationen af ​​cellulær morfologi blev anset for at være positive for ISH. Til negative kontroller blev tilapia lake virus (TiLV)-proberne [35] anvendt i stedet for CPPV-1-proben. TEM-prøverne blev fremstillet i overensstemmelse med pop-off-teknikker med modifikationer [36-38] og blev farvet med tungmetaller som tidligere beskrevet [39, 40]. Ultrastrukturen blev undersøgt ved hjælp af TEM (HT7800; Hitachi, Tokyo, Japan) drevet ved 80 kV

Fuld længde genetisk karakterisering af fiskekat CPPV-1Da resultaterne af virologisk PCR og IHC-screening var i overensstemmelse, og resultaterne af partielle VP-2-genomsekvenser opnået fra pan-parvoviral PCR antydede genetisk lighed mellem tilfælde nr. 1 & 2, men ikke for tilfælde nr. 3, karakteriserede vi yderligere CPPV-1-sekvensen i fuld længde fra disse fiskekatte (tilfælde nr. 1 & 3) og klassificerede CPPV-1-oprindelsen ved hjælp af en sæt af degenererede primerpar specifikke for FPV og CPV hentet fra en tidligere publikation [26]. Kort fortalt, de ekstraherede nukleinsyrer opnået fra milt ognyreraf to fiskekatte plus yderligere tarmvæv fra fiskekat nr. 3, blev individuelt amplificeret ved hjælp af en GoTaq1 Hot Start Green Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) og specifikke primere (S1 File). PCR-betingelserne er blevet beskrevet tidligere [26]. Målamplikonerne blev visualiseret ved anvendelse af 2 procent (vægt/volumen) agarosegelelektroforese og yderligere oprenset ved anvendelse af et Monarch DNA Gel-ekstraktionssæt (New England Biolab, Frankfurt, Tyskland) før kommerciel Sanger-sekventering. De komplette genomsekvenser af CPPV-1-isolaterne opnået fra de to fiskekatte blev deponeret i GenBank (adgangsnumre MW145540-MW145541).

Fylogenetiske, rekombinations- og evolutionære analyser af fiskekatte-CPPV-1 Fuldlængde-genomsekvenserne af fiskekatte-CPPV-1-stammerne blev justeret med de publicerede komplette CPPV-1-sekvenser opnået fra forskellige værtsarter , tilgængelig i GenBank ved hjælp af MAFFT V. 7 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) og MEGA7-software (http://www.megasoftware.net). Sekvensjusteringerne blev derefter udsat for fylogenetisk trækonstruktion. Det fylogenetiske træ blev skabt ved hjælp af maksimal sandsynlighed (ML) metoden med Hasegawa-Kishino-Yano med gammafordeling (HKY plus G)-modellen, som blev udvalgt ved hjælp af find-bedst-fit model-algoritmen i MEGA7 i henhold til det Bayesianske informationskriterium . Træet var bundet med 1,000 replikater. Sekvens parvis lighed blandt CPPV-1-genomer blev beregnet ved hjælp af den maksimale sammensatte sandsynlighedsmodel, og deres evolutionære afstand blev analyseret i MEGA7. De parvise nukleotididentiteter af output blev genereret og visualiseret i Microsoft Excel-format (S2-fil). Outputjusteringssekvensen for CPPV-1 blev derefter brugt som skabelon til genetisk rekombinationsanalyse ved brug af to statistisk uafhængige softwarepakker. Kort fortalt identificerede justeringen de potentielle rekombinationsstammer ved hjælp af integreret rekombinationsdetektionsprogram 4 (RDP4) pakke V. Beta 4.94-software, og dette blev krydstjekket med et lighedsplot og bootscanningsanalyse i SimPlot-softwarepakken V. 3.5.1. Indstillingerne af programmerne og fortolkningen af ​​resultaterne blev udført som tidligere beskrevet [26, 41].

FTil evolutionær analyse af fiskekatten CPPV{{0}} blev der hentet et datasæt med 224 komplette genomsekvenser indeholdende 26 FPV-, 6 MEV- og 192 CPV-sekvenser, som alle stammer fra 18 lande mellem 1979 og 2019. fra GenBank-databasen. Evolutionær analyse blev udført med de 2 potentielle CPPV-1-sekvenser opnået fra fiskekatte ved hjælp af Bayesian Markov-kæden Monte Carlo (BMCMC)-modellen implementeret i BEAST V. 2.4.8 [42]. jModelTest [43] blev udført for at identificere den bedst passende nukleotidsubstitutionsmodel for multiple alignment-sekvenser. De bedst egnede substitutionsmodeller under lognormale afslappede og strenge urmodeller ved konstante populationsstørrelser som tidligere blev implementeret for at tage højde for varierende evolutionære hastigheder blandt slægter. Det koalescerende Bayesianske skyline-træ tidligere og empiriske basisfrekvenser blev opnået under den bedst egnede urmodel og kørte for 100 millioner kæder, prøvetagning hver 10.{21}. generation, med de første 10 procent kasseret som indbrænding. Konvergensen af ​​parametre blev bekræftet ved at beregne den effektive stikprøvestørrelse ved hjælp af TRACER-programmet V. 1.7.0 [44]. De maksimale klade-troværdighedstræer blev kommenteret ved hjælp af TreeAnnotator V. 1.8.3 [42]. Det fylogenetiske træ med estimeret divergens, variabel tidslinje, posterior sandsynlighed og 95 procent højeste posterior tæthed (HPD) blev genereret og vist ved hjælp af FigTree V. 1.4.3 [45].

Retrospektiv undersøgelse af CPPV-1-antigen i kødædende vilde dyrFor at udforske rollen af ​​CPPV-1 forbundet med morbiditet og dødelighed med ukendte årsager hos vilde kødædere i den fjerne og nyere fortid, blev 305 selektive friske prøver inkluderet til genomisk ekstraktion og identifikationsmålretning af CPPV{{2} } capsidgen som beskrevet ovenfor. Disse prøver er blevet opnået siden 2013 som enten fækale podninger eller tarmindhold. De blev opnået fra 136 zoo-dyr fra 27 forskellige kødædende arter (S1-tabel). Resultater Postmortem fund og vævslokalisering af fiskekat CPPV-1 Alle obducerede fiskekatte var moderat afmagrede med varierende grader af dehydrering, mens 2 af de 3 fiskekatte (tilfælde nr. 1 & 2) viste moderat autolyse. Fremtrædende er milten ognyrervar overbelastet i alle fiskekatte. Fiskekat nr. 3 havde makroskopiske læsioner af catarrhal enteritis, der indeholdt et vandigt brun-gulligt indhold i deres lumen og overbelastning af den mesenteriske lymfeknude. Histologisk set er lungen af ​​fiskekat nr. 3 afslørede alvorlig overbelastning med infiltration af mononukleære celler i alveoler. Leveren viste mild periportal hepatitis, karakteriseret ved mononukleær celleinfiltration ved leverportaltriader. Lignende grader af miltoverbelastning med få antal miltlymfoide follikler blev observeret hos alle fiskekatte. De lymfoide follikler var udtømte og de resterende lymfoide follikler midt i kollapset miltarkitektur med øget antal fremtrædende milttrabekler (fig. 1A). Der var spredt karyorrhectic debris af lymfocytter med

Fig. 1. CPPV-1-infektion hos fiskekatte. Demonstrative H&E (A, C) og CPPV-1 IHC (B, D) billeder fra fiskekatte. (A) Fiskekat nr. 1. Diffus tilstoppet milt med sparsomt antal lymfoide follikler. Midten af ​​en af ​​de resterende lymfoide follikler indeholdt eosinofilt fibrillært materiale (fibrin) blandet med spredte karyorrhectic debris af lymfocytter (lymfocytolyse) (indsat). Få antal af disse lymfocytter indeholdt 5-7 μm basofile intranukleære inklusionslegemer, der afgrænsede det nukleare kromatin (pil). (B) Fiskekat nr. 3. Afkortning af villi med lejlighedsvis udvidede krypter, der indeholdt eosinofile proteinholdige stoffer og foret med markant svækkede eller nekrotiske kryptepitelceller (indsat). Mange kryptepitelceller var pyknotiske og karyorrhectic, og sjældne celler indeholdt lignende basofile intranukleære inklusionslegemer (pile). (C) Fiskekat nr. 1. CPPV-1-immunreaktiviteten blev hyppigt observeret i cytoplasmaet af mononukleære celler i området af miltlymfoide follikel. (D) Fiskekat nr. 3. CPPV-1 IHC-signaler blev diffust detekteret, og immunreaktivitetssignalerne var markant lokaliseret i cytoplasmaet af kryptoepitelceller (indsat). Søjler angiver 25 μm for (A) og 120 μm for (B-D).

ophobninger af eosinofile fibrillære materialer i midten af ​​en sådan follikel. Få antal af disse lymfocytter indeholder 5-7 μm basofile intranukleære inklusionslegemer, der marginerer det nukleare kromatin. Afkortning af tarmvilli med kollaps af slimhindearkitektur var til stede i tarmsektionen hos fiskekat nr. 3 (fig. IB). Nogle krypter blev udvidet, og de indeholdt eosinofilt proteinholdigt materiale og var foret med markant svækkede eller nekrotiske kryptepitelceller. Mange kryptoepitelceller var pyknotiske og karyorrhectic, og sjældne celler indeholdt lignende basofile intranukleære inklusionslegemer. CPPV-1 IHC blev brugt til at påvise tilstedeværelsen af ​​virussen i væv og til at beskrive den patologiske rolle af CPPV-1 i læsionerne observeret ved rutinemæssig postmortem undersøgelse. De boende mononukleære celler i milten afslørede positiv intens immunreaktivitet af CPPV-1 i alle fiskekatte (fig. 1C). Immunreaktiviteten blev også observeret i det meste af cytoplasmaet i kryptoepitelceller og var kompatibel med tarmlæsioner fra fiskekat nr. 3 (fig. 1D). Især forskellige grader afrenal tubulærvakuolation og multifokalnyreblødning var tydelig i alle fiskekatte (fig. 2A). Noglenyretubulære epitelceller var hypereosinofile med nuklear pyknose, mens de sjældne vakuolerede tubulære epitelceller afslørede vesikulerede kerner med marginerende nuklear kromatin (fig. 2B). Vedrørendenyrelæsioner udførte vi yderligere PAS-farvning for at demonstrere den cellulære arkitektur afnyrevævog at udelukke systemisk hypoxi som værende den mulige årsag til denne læsion. PAS-farvning demonstrerederenal tubulærbasalmembraner var intakte (fig. 2B, indsat). Indenfornyresektioner, var CPPV-1 immunmærkning stærk og ses ofte i cytoplasmaet afrenal tubulærepitelceller (fig. 2C) og urotelceller vednyrebækkeni alle tilfælde. Ingen tegn på immunogen reaktion blev observeret i de negative kontroller (S1 Fig.). Den atypiske CPPV-1 lokalisering inyrevævafsløret af IHC foreslog, at vi skulle foretage yderligere undersøgelser for at bekræfte tilstedeværelsen og lokaliseringen af ​​CPPV-1 inyreved at bruge ISH og TEM med pop-off teknik. CPPV-1 ISH-immunoreaktiviteten var positiv hos alle fiskekatte og diffust lokaliseret i kernen afnyretubulære epitelceller, hvor de tubulære læsioner blev observeret (figur 2D). Der blev ikke observeret nogen reaktion i de negative kontroller (S1 Fig.) I overensstemmelse med resultaterne af positive immunologiske signaler af ISH, der var lokaliseret i kernen afnyreepitelceller, talrige små elektrontætte virale partikler, estimeret til omkring 19-22 nm i diameter, blev observeret. Disse blev samlet i kernerne af disserenal tubulærog urotelceller (fig. 3).

Påvisning af fiskekat CPPV-1 og genomisk analysePrimært blev pan-familie-PCR-panelerne, der er specifikke for forskellige vira, herunder herpesvirus, paramyxovirus, pneumovirus, calicivirus, influenzavirus, bocavirus, coronavirus og parvovirus, testet på de ekstraherede virale nukleinsyreprøver. Dette afslørede kun positive resultater med pan-parvovirus PCR i tarm, lymfeknuder ognyreprøver af de tre fiskekatte. Omvendt var andre pan-PCR'er for de andre viruspåvisninger negative i alle testede vævsprøver Ud fra tidligere opnåede resultater af pan-parvovirus PCR-positivitet i alle fiskekatte karakteriserede vi yderligere de kodende genomsekvenser i to fiskekatte ved hjælp af flere primerpar i ekstraherede nukleinsyreprøver opnået fra tarm (sag nr. 1) ognyre(sag nr.3). De 4.462 og 4.430 basepar af komplette kodende genomer fra to fiskekatte CPPV-1-stammer blev påvist og blev betegnet stamme 19ZP004-TH/2019 (sag nr. 1, accessionsnr. MW145540) og 19ZP{ {12}}TH/2019 (henholdsvis sag nr. 3, tiltrædelsesnr. MW145541). Efter genetisk analyse afslørede de komplette kodende genomer genetisk lignende resultater blandt CPPV-1-stammer opnået fra fiskekatte ved at vise, at disse fiskekatte-CPPV-1 var FPV. Udledt aminosyresammenligning mellem CPPV-1-varianterne og fiskekattens FPV er beskrevet i tabel 1. Det skal bemærkes, at fiskekattens FPV afslørede unikke aminosyremutationer af I566M og M569R i det strukturelle (VP1 & 2) protein , som ikke blev fundet i tidligere CPPV-1-varianter.

Fig. 2. CPPV-1-infektion hos fiskekatte. Demonstrative H&E (A), PAS-farvning (B), CPPV-1 IHC (C) og in situ hybridisering (ISH) (D) mikrofotografier afnyrefra fiskekatte. (A, B) Fiskekat nr.3. (A) Multifokalnyreblødning medrenal tubulærvakuolering. Få tubulære epitelceller var hypereosinofile med pyknotiske kerner (indsat, pile). (B)Renal tubulærepitelceller udviste cytoplasmatisk vakuole, og kernerne af sjældne epitelceller er vesikulerede med marginerende nuklear kromatin. PAS-farvning fremhævede intakt basalmembran (indsat). (C) Fiskekat nr. 2. CPPV-1 IHC-immunoreaktivitet (mørkebrun farve) blev observeret diffust inyretubuliog detekteres ofte i cytoplasmaet afrenal tubulærepitel (indskudt). (D) Fiskekat nr.1. CPPV-1 ISH-immunoreaktivitet (rødlig lyserød farve) blev observeret rigeligt inyretubuli(stjerner), og det lokaliserede sig i kernerne afrenal tubulærepitel (indskudt, pile). Søjler angiver 50 μm for (A, C) og 120 μm for (B, D).

Fylogenetisk og evolutionær analyseFor at sammenligne det genetiske forhold mellem påvist fiskekat CPPV-1 og andre tidligere publicerede CPPV-1-genomer blev der udført fylogenetisk analyse baseret på fuldstændig kodende genomsekvens. Det ML-fylogenetiske træ viste, at de fleste FPV, MEV og CPV dannede en meget tydelig klade blandt grupperne (fig. 4). De to CPPV-1-genomer fra de undersøgte fiskekatte (angivet med røde trekanter) blev grupperet sammen med den samme afstamning af tidligere offentliggjorte FPV-sekvenser opnået fra forskellige værter, hvilket bekræfter, at de opnåede

Fig. 3. CPPV-1 virale partikler i kernen afrenal tubulærepitelceller. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) ved hjælp af pop-off-teknikken. Ultrastrukturel demonstration af klyngning af elektrontætte partikler (pile). Den icosaedriske partikelstørrelse var 19-22 nm i diameter placeret i kernen afrenal tubulærepitelceller (indsat). Skala søjler som vist på figuren.

fiskekatte-CPPV-1er var FPV. De påviste genomer var klynget sammen og var tættest beslægtet med FPV-genomet påvist hos huskatte i Thailand (accessionsnr. MN127780). For yderligere at belyse den evolutionære proces af detekteret fiskekat CPPV-1 blev der udført adskillige rekombinationsdetektioner og evolutionære analyser på et datasæt med 224 CPPV-1 komplette genomsekvenser. Rekombinationsanalysen afslørede, at der ikke blev fundet rekombinationshændelser i fiskekatte CPPV-1-sekvenser. Det evolutionære træ af disse data viste to hovedsærskilte adskilte klader (fig. 5). En clade inkluderede FPV og MEV og en anden clade inkluderede alle CPV-sekvenser. Den samlede evolutionære hastighed blev estimeret til 1,08 × 10-4 substitutioner/sted/år (95 procent HPD: 1,95-2,87 × 10-4). Det evolutionære træ viste, at fiskekatte-FPV-sekvenser var samlet i samme linje af FPV som dem, der var isoleret fra Thailand. De har delt genetisk udvikling med FPV-genomer påvist i huskatte i Kina og kan have samme oprindelse siden omkring 1970.

Diskussion

Cirkulation af CPPV-1-varianter, der inkluderer CPV og FPV, er blevet identificeret hos både tamme og vilde kødædere. Mens dødelig infektion med CPPV-1 hos husdyrhunde og -katte er almindelig, ses denne infektion sporadisk hos vilde kødædere [46]. Adskillige undersøgelser har vist, at mange vilde kødædere er modtagelige for CPPV-1-infektion, herunder vilde kattedyr, mink, oddere, stinkdyr, vaskebjørne, ræve, ulve, prærieulve, civeter og mår [11, 19]. Særligt for slægten Prionailurus er det kun leopardkatte, der er blevet rapporteret at være inficeret med CPPV-1 varianter [9]. I denne undersøgelse beskriver vi den naturlige infektion af FPV, et medlem af CPPV-1, hos vilde fiskekatte (Prionailurus viverrinus). Dette er den første rapport med en beskrivelse af distinkt viral distribution og tropisme inyrevævsom bekræftet via antigenpåvisning ved hjælp af PCR, IHC, ISH og TEM-analyse af ultrastrukturen.

Overførsel på tværs af arter af CPPV-1-varianter mellem husdyr og vilde kødædere er blevet observeret, og nogle dødelige CPPV-1-udbrud er blevet spekuleret i at være forbundet med patogenafsmitning blandt levesteder [9, 11]. På grund af det nuværende tab af dyrelivshabitater har vilde kolonier migreret og delt levesteder med husdyr, hvilket har ført til øget patogenafsmitning mellem modtagelige dyr. I denne undersøgelse fandt vi ud af, at fiskekattens CPPV-1-genomer har delt et evolutionært mønster med de FPV-stammer, der er påvist i

Fig. 4. Fylogenetisk topologi, der afslører det genetiske forhold mellem de kodende sekvenser i fuld længde mellem fiskekatten CPPV-1 og andre CPPV-1-varianter. Det fylogenetiske træ viste, at fiskekattens CPPV-1-sekvenser (angivet med røde trekanter) var klynget sammen med FPV-genomerne med det genom, der var mest relateret til FPV-genomet, der blev påvist i den thailandske kat (MN127780). GenBank-adgangsnumrene for tidligere beskrevne CPPV-1-sekvenser anvendt i denne analyse blev angivet.

huskatte i Thailand. Disse resultater viser et lignende evolutionært mønster til FPV-stammerne fra fælles forfædre isoleret fra huskatte i Kina siden 1970'erne. Dette resultat kan enten indebære mulige beviser for overførsel på tværs af arter mellem huskatte og fiskekatte eller co-evolution af CPPV-1 varianterne. På grund af begrænsningen af ​​prøver opnået fra fritgående dyr i de samme levesteder og det lille antal undersøgte fiskekatte, kunne det primære reservoir for CPPV-1 i denne undersøgelse imidlertid ikke identificeres, og yderligere undersøgelse er nødvendig . Selvom adskillige undersøgelser har vist, at forskellige aminosyrerester i capsid-genet er forbundet med både evnen til at inficere nye værter og antigeniciteten af ​​CPPV-1 [18, 47], er den enkelte aminosyremutation i position 300 af capsidprotein (VP2) er blevet rapporteret som en nøgledeterminant for flere værtsområder [48]. I denne undersøgelse afslørede CPPV-1-varianten opnået fra fiskekattene de samme aminosyremønstre som i FPV-sekvenser, med tilstedeværelsen af ​​alanin (A) som en nøgleaminosyredeterminant i capsidposition 300. Mens fiskekatte-capsidproteinet fra CPPV-1 afslørede asparagin (N) og alanin (A) aminosyrer placeret i henholdsvis position 564 og 568 (som anses for at være kritisk for FPV-replikation i katteværten), de havde 2 unikke aminosyremutationer i positionerne I566M og M569R. Disse mutationer kan differentiere denne virus fra tidligere beskrevne CPPV-1-varianter. Tidligere analyse af den forfædres rekonstruktion viste, at FPV kan inficere forskellige kødædere med få ændringer i VP2-genet [49]. Således blev det FPV-lignende parvovirus foreløbigt navngivet som et potentielt nyt virus påvist i fiskekattene, og dette kan understøtte den første identifikation af denne virus i denne art. Men et lille antal undersøgte fiskekatte sammenlignet med et lille antal andre sekvenser giver muligvis ikke en endelig fortolkning. Dette kræver yderligere undersøgelse for at kunne drage mere sikre konklusioner.

Fiskekat CPPV-1 lokaliseringer blev observeret i forskellige væv, herunder intestinale epitelceller og lymfoide celler, hvor den mest almindelige vævslokalisering af CPPV-1-infektionen findes hos andre arter [20, 26, 50, 51 ]. Interessant nok, da indledende undersøgelse af viral genomisk påvisning ved hjælp af PCR og viral lokalisering ved hjælp af IHC afslørede distinkt viral lokalisering inyrevæv, udførte vi PAS-farvning for at demonstrere den cellulære arkitektur afnyrevævog at udelukke systemisk hypoxi som værende den mulige årsag til tubulær nekrose. PAS-farvning afslørede, at de mest tubulære basalmembraner var intakte, hvilket tyder på, at denne læsion muligvis ikke skyldes systemisk hypoxi [52]. Men andre årsager såsom toksin-induceret tubulær nekrose kan forårsage denne læsion. Således er rollen af ​​FPV-lignende parvovirusinfektion forbundet mednyrelæsioner skal stadig undersøges nærmere. Desuden forsøgte vi yderligere at belyse eksisterende lokalisering af virussen inyrevævved at bruge ISH og TEM med pop-off teknikken [37] i de områder, hvor CPPV-1 IHC-immunoreaktivitet blev påvist. De elektrontætte partikler blev observeret i kernen afrenal tubulærepitelceller og urothelceller, der understøtter den positive in situ immunreaktivitet af CPPV-1 inyrevæv. FPV-inficerede katte udskiller virussen overvejende i fæces, men tilstedeværelsen af ​​aktiv virus i urinen er blevet beskrevet [53, 54]. Nylige undersøgelser har vist, at parvovirusinfektion spiller en rolle iNyresvigt[55]. Lokaliseringen af ​​FPV og CPV-modstykket inyrevæver ikke tidligere blevet undersøgt. Desuden en musnyreparvovirus (MKPV) har vist sig at være en nefrotropisk virus ved at vise en affinitet til at inficere og lokalisere irenal tubulærepitelceller, hvilket resulterer inyresygdomme [56, 57].

Baseret på vores viden, CPPV-1 lokalisering inyrerer ikke tidligere beskrevet. Dette antyder den nye beskrivelse af en unik viral lokalisering i denne art, eller endda hvis den kan findes i FPV-inficerede katte. Dette fund kan understøtte tidligere undersøgelser, som fandt FPV i urinen. Unikke patologiske fund kan være subjektive og kan observeres som infektion hos individer. En storstilet undersøgelse af fiskekatten CPPV-1 vil således lette en endelig fortolkning. Derudover er prøver, der for det meste blev indsendt fra døde dyr, og som allerede havde gennemgået postmortem autolyse, ikke egnede til yderligere organindsamling fra disse dyr. Vi var således ikke i stand til at bestemme den virale lokalisering i andre organer. Belysning af atypisk viral lokalisering af fiskekat CPPV-1 ville være en nyttig undersøgelse.

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYRESYGDOMME

CPPV-1 er blevet identificeret hos forskellige vilde kødædere, og det er forbundet med dødelige udbrud. De negative beviser for retrospektiv CPPV-1-påvisning i prøver fra dyrehaver i denne undersøgelse kan skyldes enten ingen tæt kontakt mellem modtagelige dyr eller på den anden side forlænget prøveopbevaring, der påvirker stabiliteten af ​​genomiske materialer. Den nye identifikation af CPPV-1 forbundet med dødelig infektion hos fiskekatte i denne undersøgelse giver anledning til bekymring om en ny, potentielt virulent sygdom hos dette sårbare dyr. Derfor er yderligere undersøgelse af overførslen af ​​CPPV-1 hos fiskekatte afgørende for at forhindre tab af andre modtagelige dyrearter. Derfor bør forebyggelsesstrategier lægges vægt på for at håndtere CPPV-1-infektioner, ikke kun hos denne art, men også hos fritgående husdyr, der kan tjene som potentielle værter for denne virus.