Morfologiske analyser af nefrinekspression ved progressiv glomerulonefropati

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstrakt:

I denne undersøgelse fokuserede vi på nephrin, et af nøglemolekylerne i spaltemembranen af ​​podocytter, da selv om der har været rapporter om dets ekspression hos mennesker og rotter, er deres tilstedeværelse i almindelige silkeaber ikke blevet rapporteret. Vi undersøgte nefrinekspression og ændringer i glomeruli, afhængigt af udviklingen af ​​spontan progressiv glomerulonephropati hos almindelige silkeabe. Nitten almindelige silkeaber i alderen to til ti år blev evalueret. Nyren blev undersøgt ved mikroskopi med hæmatoxylin og eosin og immunhistokemisk farvning for nefrin. Læsionerne blev klassificeret i tre grader i henhold til et tidligere rapporteret nyrelæsionsklassificeringssystem. Det nephrin-positive område blev målt ved morfometrisk analyse, og det nephrin-positive forhold blev beregnet. Nephrinekspression blev observeret langs den glomerulære kapillærsløjfe i et kontinuerligt lineært mønster i renale læsionsgrader 0 til 2 og enten diskontinuerligt lineært eller groft granulært mønster i grad 3. Nephrinekspression havde en tendens til at falde signifikant afhængigt af graden af ​​nyrelæsioner . Ændring i nefrinekspression er blevet foreslået at spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​nyrelæsioner.

Nøgleord:nefrin, marmoset,glomerulonephropati, nyre, patologi

ørken cistanche fordeleogCistanche anlæger god tilnyre

Introduktion

Spontan progressiv glomerulonephropati hos almindelige silkeaber (Callithrix jacchus) er kendt for at forekomme hyppigt, begyndende ved to år gammel, med læsionens sværhedsgrad, der udvikler sig med alderen. Vi har tidligere rapporteret primære og progressive læsioner af nefropati hos almindelige silkeaber1. Primære glomerulære ændringer af nefropati i tidligt stadie er karakteriseret ved udslettelse af podocytfodprocesser og delvis fortykkelse af den glomerulære basalmembran, der formodes at forårsage lækage af protein fra glomeruli, og kan observeres ved ultramikroskopi, men ikke ved lysmikroskopi1-3. Ydermere spiller immunglobulin en vigtig rolle i udviklingen af ​​nefropati1, 2. IgM aflejres på mesangium i det tidlige stadium af glomerulonephropati, og efter den første aflejring af IgM udvides aflejringsområdet til hele glomerulus, og IgA og IgG er deponeret med progression2. Hyalinstøbninger, der tyder på lækage af protein fra glomeruli, kan observeres ved lysmikroskopi med progression af glomerulonephropati4. Proteinuri forværrer progressionen af ​​tubulointerstitielle læsioner i almindelige silkeaber4, som hos mennesker5, 6, og i en nylig undersøgelse af glomeruli kunne proteinuri induceres af lidelser i spaltemembranen og derved forbinde tilstødende fodprocesser (pedicels) af podocytter. Spaltemembranen er et intercellulært forbindelseskompleks, der er til stede mellem tilstødende fodprocesser, og nogle molekyler relateret til dens dannelse er blevet identificeret3. Et fald i ekspressionen af ​​disse molekyler eller dysfunktion af spaltemembranen mentes at være relateret til progressionen af ​​proteinuri3. Nephrin, et af nøglemolekylerne udtrykt i spaltemembranen i podocytter, er et glycoprotein bestående af 1241 aminosyrer og er en velkendt biomarkør, der bruges til at overvåge lidelsen i spaltemembraner7-10. Molekyler relateret til spaltemembraner er ikke blevet undersøgt i nefropatien hos almindelige silkeaper, selvom ændringen af ​​podocytfodprocesser og progression af proteinuri vides at forekomme hos dem. Desuden har der været rapporter om ekspression af nefrin hos mennesker og rotter7-12, men ikke i silkeaber. Derfor undersøgte vi nefrinekspression i glomeruli og ændringer i nefrinekspression, afhængigt af læsionsforløbet, ved immunhistokemiske analyser.

cistanche tcm

Materialer og metoder

Dyr

Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee under Central Institution for Experimental Animals (CIEA; Kawasaki, Japan) og blev udført i nøje overensstemmelse med CIEA's regler for dyreforsøg baseret på retningslinjerne for korrekt opførsel af Dyreforsøg (Science Council of Japan, 2006). Nitten almindelige silkeaber (11 hanner og 8 hunner) fra CLEA Japan Inc. (Tokyo, Japan) blev evalueret. Deres alder varierede fra 2 til 10 år på tidspunktet for obduktionen. Dyrene blev anbragt i bure i et dyrerum holdt ved en temperatur på 26 ± 3 grader og en luftfugtighed på 55 ± 20 procent. De blev fodret med LCMS-1M (CLEA Japan Inc., Tokyo, Japan) og postevand. Dyrene blev aflivet humant under anæstesi med pentobarbitalnatrium på grund af forskellige årsager til døende (såsom syntexis, krumningen af ​​lændehvirvlerne, dislokation af underkæbeleddet osv.). Urinalyse blev ikke udført, fordi der ikke kunne tages urinprøve.

Histopatologi

Detnyrerblev perfunderet med saltvand, efterfulgt af 4 procent paraformaldehyd og derefter fikseret i 10 procent neutral-pufret formalin til mikroskopisk undersøgelse. Prøverne blev indlejret i paraffin, snit i 5 μm tykkelse og farvet med hæmatoxylin og eosin (HE). Læsionerne blev klassificeret som glomerulære, tubulære og interstitielle læsioner baseret på offentliggjorte kriterier1. Nefropatigrader blev opdelt i fire grupper: grad 1 (3 mænd og 1 kvinde), grad 2 (3 mænd og 5 kvinder), grad 3 (1 mand og 3 kvinder) og grad 4 (3 mænd) (tabel 1).

Til immunhistokemi, et monoklonalt antistof mod det ekstracellulære domæne af human oprindelsenefrin(1:1,000, Nephring{{0}}, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA) blev brugt som det primære antistof. 5-μm sektionerne blev afparaffineret, rehydreret, behandlet med 3 procent hydrogenperoxid ved stuetemperatur i 5 minutter og derefter opvarmet i en autoklave ved 121 grader i 20 minutter i målopsamlingsopløsning (pH 6,0, Dako, Glostrup, Danmark). Efter afkøling blev sektionerne inkuberet med det primære antistof ved 4 grader natten over. Peroxidase-konjugeret anti-mus og anti-kanin IgG-polymer (Histofine Simple Stain Rat MAX-PO(MULTI), Nichirei Bioscience Inc., Tokyo, Japan) blev brugt som det sekundære antistof til den polymerbaserede metode13. Sektionerne blev inkuberet med det sekundære polymerantistof ved stuetemperatur i 30 minutter, og de reagerende produkter blev visualiseret under anvendelse af 3,3'-diaminobenzidin som et kromogen. Modfarvning blev udført med hæmatoxylin. For den negative kontrol blev det primære antistof udeladt.

Morfologisk analyse

Til morfologisk analyse blev glomeruli med det glomerulære hilum indsendt til undersøgelse, og 16 til 28 glomeruli blev fanget på hvert objektglas (tabel 1) ved hjælp af en hel objektglasscanner (Aperio AT2, Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL, USA) og en tilsvarende patologisk diasvisningssoftware (Aperio ImageScope, Leica Microsystems Inc.) med samme opløsning og billedstørrelse.Nephrin-positive og hele glomerulære områder blev beregnet med billedanalysesoftware (Image-Pro V10, Mediacybenetics Inc., Rockville MD, USA) ved at tegne et område af interesse omkring glomerulus, ifølge en tidligere rapport14. Hele det glomerulære område blev defineret som det område, der kan skelnes fra den hvidfarvede baggrund. Farvetærsklerne for beregningnefrin-positive områder blev bestemt i henhold til hver farvningstilstand. Tærsklerne for rød, grøn og blå var henholdsvis 37-67, 31-77 og 32-88. Det nephrin-positive forhold blev beregnet ved at dividere målingerne afnefrin-positivt område over det glomerulære område. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Jonckheere-testen (signifikansniveau: 5 procent, en-sidetest) for at evaluere tendensen mellem nefropatigrad og udtryk fornefrin.

costanche

Resultater

De patologiske scores og grader af individuelle nyrelæsioner er vist i tabel 1. Samme som rapporteret i vores første rapport1 havde læsionsgraden en tendens til at stige med alderen, og der var ingen åbenlys kønsforskel. Resultaterne af immunhistokemisk farvning afnefriner vist i fig. 1, og denefrin-positivt forhold er vist i fig. 2 og tabel 1. Blandt scoringerne og karaktererne i tabel 1 blev nyrelæsionsgraden, afledt af den samlede score for hver nyrelæsion, og hyalingipsscore anvendt til sammenligning mednefrin-positivt forhold (fig. 2 og 3). Individuelle tilfælde i tabel 1 er vist i stigende rækkefølge efter renal læsionsgrad. Nephrin-ekspression blev observeret sammen med den glomerulære kapillarløkke i et kontinuerligt lineært mønster i kvaliteter 0 til 2 (fig. 1A-C) og et diskontinuert lineært eller groft granulært mønster i grad 3 (fig. 1D). I den negative kontrolprøve, ingen positiv reaktion fornefrinblev observeret på ethvert sted.

Sammenligningen afnefrin-positivt forhold til renal læsionsgrad er vist i fig. 2. I tilfælde af renal læsionsgrad 0 er gennemsnittet ± standardafvigelsen (SD) afnefrin-positivt forhold var 5,66 ± 1,18 procent, og maksimum-, minimum- og medianværdierne var henholdsvis 6,84 procent, 4,27 procent og 5,76 procent. I grad 1 tilfælde var middelværdien ± SD 3,99 ± 1,61 procent, og maksimum-, minimum- og medianværdierne var henholdsvis 5,69 procent, 1,19 procent og 4,35 procent. I grad 2 tilfælde var middelværdien ± SD 3,82 ± 2,25 procent, og de maksimale, minimums- og medianværdier var henholdsvis 6,71 procent, 1,58 procent og 3,49 procent. I grad 3 tilfælde var middelværdien ± SD 2,52 ± 1,02 procent, og maksimum-, minimum- og medianværdierne var henholdsvis 3,67 procent, 2,17 procent og 2,17 procent. Samlet set var individuelle forskelle i nefrinekspression små i tilfælde af grad 0, men store i tilfælde af grad 1 eller højere, og lav positiv ekspression blev sporadisk påvist.Nephrinekspression havde en tendens til at falde afhængigt af graden af ​​nyrelæsioner (fig. 2). Der var en signifikant lavere tendens mellem nyrelæsionsgrad ognefrin-positivt forhold ifølge Jonckheere-testen (p=0.0166). Hyalin-cast-scoren sammenlignet med nyrelæsionsgraden er vist i fig. 3. I tilfælde med en hyalin-cast-score på 0 var gennemsnittet ± SD af nephrin-positivt forhold 5,40 ± 1,32 procent, i score 1-tilfælde var det 4,10 ± 1,70 procent, og i score 2 tilfælde var det 3,37 ± 1,98 procent. Der var en signifikant lavere tendens mellem hyalinstøbningsscore og nephrinpositivt forhold ifølge Jonckheere-testen (p=0.0654).

Diskussion

Et fald i nefrinet var korreleret med udviklingen af ​​nyrelæsioner under udviklingen af ​​silkeabe glomerulonephropati. Anti-nephrin-antistoffet anvendt i denne undersøgelse genkendte det ekstracellulære domæne på den N-terminale side. Dette ekstracellulære domæne interagerer med NEPH1-molekyler og danner en lynlåslignende struktur i spaltemembranen15. Lokalisering af nephrin i normale glomeruli er langs den glomerulære kapillærløkke, og farvningsmønsteret er et lineært mønster af kontinuerlige fine granula både hos rotter og mennesker11, 12, 16-18. Farvningen udført i denne undersøgelse er passende; hvilket bekræftes af den observation, at kapillærvæggene i kontakt med mesangialområdet ikke var farvede, mens de, der var i kontakt med podocytterne, var det. Under unormale forhold, såsom nefrotisk syndrom hos mennesker eller puromycin-aminonukleosid-nefrose hos rotter, er nephrinfarvningsmønsteret i glomeruli diskontinuerligt og groft granulært, og intensiteten af ​​immunhistokemisk farvning er svagere end i normale glomeruli11, 16, 17. , var nefrinekspressionsmønsteret i grad 0 til 2 normalt; farvningsmønsteret i grad 3 var imidlertid sammenligneligt med det for unormale tilstande. I en tidligere undersøgelse af glomerulær nefrinekspression i Crl: CD(SD) rotter med minimal forandringssygdom, var nefrinekspression intakt, selvom podocytfodprocesser viste udslettelse under elektronmikroskopi uden tilsyneladende morfologiske ændringer observeret under lysmikroskopi18. I den almindelige nyresygdom hos rotter, kronisk progressiv nefropati (CPN), er det blevet påvist, at albuminuri ledsaget af tidligt stadie af CPN kan resultere i færre ændringer i glomerulær permeabilitet fra manglende reabsorbering af albumin fra proksimale tubuli19. Hos mennesker har der været nogle undersøgelser om reduktion af nefrinekspression under mindre ændringer10 eller under andre nyresygdomme14, 16. På den anden side har der været en rapport om intakt nefrinekspression ved minimal forandringsnephrosis20. Tilstedeværelsen eller fraværet af en ændring i ekspressionen af ​​nefrin i nefrotisk sygdom med minimal forandring diskuteres stadig. I virkeligheden var det vanskeligt at bekræfte stigningen eller faldet i antistofreaktionen af ​​nefrin ved visuel observation i silkeabe nefropati, men det var muligt at påvise ændringen i hele nyren ved billedanalyse. Vores undersøgelse tyder på, at abnormiteten af ​​spaltemembraner i glomerulus kan være involveret i progressionen af ​​nefropati hos almindelige silkeaber på grund af et fald i nefrin. Transformationen af ​​det positive farvningsmønster af nefrin, fra lineært til det granulære mønster, er blevet rapporteret i en rottedyremodel for nefrotisk sygdom under udviklingen af ​​læsionen11, 16, 21. En sammenhæng mellem abnormiteter i spaltemembranen og proteinuri har ofte blevet rapporteret22, 23; derfor er det blevet spekuleret i, at proteinuri kan være forårsaget af dysfunktion af spaltemembranen. I vores undersøgelse af silkeabe-nefropati kunne progressionen af ​​glomerulær proteinpermeabilitet på grund af dysfunktion af spaltemembranen være forekommet, fordi de morfologiske træk ved hyalinafstøbninger kun blev observeret i tilfældene uden tubulointerstitielle ændringer. I denne undersøgelse blev der ikke observeret nogen statistisk signifikant forskel mellem scoren af ​​morfologiske ændringer af hyalinafstøbninger og faldet i nefrinekspression. Nephrin-ekspression har dog en tendens til at falde afhængigt af hyalin-cast-score, som er en indikator for proteinlækage fra glomerulus.

I vores tidligere undersøgelse blev udslettelse af fodprocesser observeret i det tidlige stadium af silkeabe-nefropati, og det berørte fodprocesområde blev udvidet afhængigt af nyrelæsionsgrad1. Tabel 2 viser forholdet mellem reduktionshastigheden af ​​nephrin i denne undersøgelse og elektronmikroskopiresultaterne for hver nyrelæsionsgrad fra en tidligere undersøgelse. Udslettelse menes at skyldes en nedbrydning af aktincytoskelettet i fodens processer24. Nephrin dephosphoryleres, når spaltemembranen er konstrueret, og det binder til actin gennem CD2AP og podocin25, 26. Når en spaltemembran beskadiges, dannes nephrinmolekyler i klynger, hvilket inducerer nephrinphosphorylering, actinpolymerisation og udslettelse af foden26. Nephrin-phosphorylering forekommer også hurtigt efter induktionen af ​​udslettelse af fodprocessen i protaminsulfatmodellen hos mus27. Nephrin er et glomerulært adhæsionsprotein forbundet med podocytmodning, differentiering, procesdannelse og signalering24. Vores undersøgelse viste, at der var en sammenhæng mellem reduktionen af ​​nefrinekspression, som bestemt af immunhistokemi, og progression af renal læsionsgrad, hvilket tyder på en udvidelse af udslettelse af podocytfodprocesser. Det er dog uklart, om abnormiteter i spaltemembranproteinkomplekset forårsager skade på podocytfodprocesser, eller om podocytskader forårsager ændringer i spaltemembraner og nefrinreduktion. Da nephrin også er involveret i podocytdifferentiering, menes det, at dette forhold vil blive yderligere afklaret af data om podocytregenerering og -differentiering.

Afslutningsvis giver vores resultater oplysninger omnefrinudtryk i progressiv glomerulonephropati hos almindelige silkeaber. Morfologisk analyse afslørede en lavere tendens pånefrinekspression i podocytter i progressiv glomerulonephropati af almindelige silkeaper og ændring afnefrinekspression blev foreslået at spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​nyrelæsioner.

Offentliggørelse af potentielle interessekonflikter:

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Anerkendelse:

Forfatterne vil gerne takke hr. Takayoshi Ito for den fremragende tekniske assistance, de ydede. Forfatterne takker også Ms. Kanae Tamatsukuri og Mr. James Harada for den sproglige redigering af manuskriptet.

sønderskud

Referencer
1. Yamada N, Sato J, Kanno T, Wako Y og Tsuchitani M. Morfologisk undersøgelse af progressiv glomerulonephropati hos almindelige silkeaber (Callithrix jacchus). Toxicol Pathol. 41: 1106-1115. 2013.
2. Yamada N, Hashimoto N, Kamiie J, Doi T, Sato J, Inoue T, Shirota K og Tsuchitani M. Forholdet mellem immunglobulinaflejring og tidlige læsioner af progressiv glomerulonephropati hos unge almindelige silkeabe. Dyrlæge Pathol. 55: 173-176. 2018.
3. Cara-Fuentes G, Clapp WL, Johnson RJ og Garin EH. Patogenese af proteinuri i idiopatisk minimal forandringssygdom: molekylære mekanismer. Børnelæge Nephrol. 31: 2179-2189. 2016.
4. Isobe K, Adachi K, Hayashi S, Ito T, Miyoshi A, Kato A og Suzuki M. Spontane glomerulære og tubulointerstitielle læsioner i almindelige silkeaber (Callithrix jacchus). Dyrlæge Pathol. 49: 839-845. 2012.
5. Eddy AA. Proteinuri og interstitiel skade. Nephrol skivetransplantation. 19: 277-281. 2004.
6. Hingorani S, Gooley T, Pao E, Sandmaier B og McDonald G. Urinary cytokines after HCT: evidens for nyrebetændelse i patogenesen af ​​proteinuri ognyresygdom. Knoglemarvstransplantation. 49: 403-409. 2014.
7. Kestilä M, Lenkkeri U, Männikkö M, Lamerdin J, McCready P, Putaala H, Ruotsalainen V, Morita T, Nissinen M, Herva R, Kashtan CE, Peltonen L, Holmberg C, Olsen
A og Tryggvason K. Positionelt klonet gen for et nyt glomerulært protein--nephrin--er muteret i medfødt nefrotisk syndrom. Mol Cell. 1: 575-582. 1998.
8. Langham RG, Kelly DJ, Cox AJ, Thomson NM, Holthöfer H, Zaoui P, Pinel N, Cordonnier DJ og Gilbert RE. Proteinuri og ekspressionen af ​​podocytspalte-diafragmaproteinet, nefrin, ved diabetisk nefropati: virkninger af hæmning af angiotensin-konverterende enzym. Diabetologia. 45: 572-1576. 2002.
9. Welsh GI og Saleem MA. Nephrin-signaturmolekyle af den glomerulære podocyt? J Pathol. 220: 328-337. 2010.
10. van de Lest NA, Zandbergen M, IJpelaar DHT, Wolterbeek R, Bruijn JA, Bajema IM og Scharpfenecker M. Nephrintab kan bruges til at forudsige remission og langsigtet nyreudfald hos patienter med minimal forandringssygdom.NyreInt Rep. 3: 168-177. 2017.
11. Kawachi H, Koike H, Kurihara H, Yaoita E, Orikasa M, Shia MA, Sakai T, Yamamoto T, Salant DJ og Shimizu F. Kloning af rottenephrin: ekspression i udvikling af glomeruli og i proteinuriske tilstande.NyreInt. 57: 1949-1961. 2000.
12. Luimula P, Ahola H, Wang SX, Solin ML, Aaltonen P, Tikkanen I, Kerjaschki D og Holthöfer H. Nephrin i eksperimentel glomerulær sygdom.NyreInt. 58: 1461-1468. 2000.
13. Janardhan KS, Jensen H, Clayton NP og Herbert RA. Immunhistokemi i undersøgende og toksikologisk patologi. Toxicol Pathol. 46: 488-510. 2018.
14. Koop K, Eikmans M, Baelde HJ, Kawachi H, De Heer E, Paul LC og Bruijn JA. Ekspression af podocyt-associerede molekyler i erhvervet menneskenyresygdomme. J Am Soc Nephrol. 14: 2063-2071. 2003.
15. Gerke P, Huber TB, Sellin L, Benzing T og Walz G. Homodimerisering og heterodimerisering af de glomerulære podocytproteiner nephrin og NEPH1. J Am Soc Nephrol. 14: 918-926. 2003.
16. Doublier S, Ruotsalainen V, Salvidio G, Lupia E, Biancone L, Conaldi PG, Reponen P, Tryggvason K og Camussi G. Nephrin-omfordeling på podocytter er en potentiel mekanisme for proteinuri hos patienter med primært erhvervet nefrotisk syndrom. Am J Pathol. 158: 1723-1731. 2001.
17. Kawakami H, Kamiie J, Yasuno K, Kobayashi R, Aihara N og Shirota K. Dynamik af den absolutte mængde nefrin i en enkelt podocyt i puromycin-aminonukleosid nefrose-rotter beregnet ved kvantitativ glomerulær proteomisk tilgang med udvalgt reaktionsovervågningsmetode. Nephrol skivetransplantation. 27: 1324-1330. 2012.
18. Yasuno K, Honda K, Hakamata S, Kai K og Mori K. Minimal forandringssygdom inyrei en ung Sprague Dawley-rotte. J Toxicol Pathol. 31: 55-59. 2018.
19. Obert LA og Frazier KS. Intrarenal renin-angiotensin-system involvering i patogenesen af ​​kronisk progressiv nefropati, der bygger bro mellem informationskløften mellem discipliner. Toxicol Pathol. 47: 799-816. 2019.
20. Patrakka J, Ruotsalainen V, Ketola I, Holmberg C, Heikinheimo M, Tryggvason K og Jalanko H. Expression of nephrin in pediatricnyresygdomme. J Am Soc Nephrol. 12: 289-296. 2001.
21. Saran AM, Yuan H, Takeuchi E, McLaughlin M og Salant DJ. Komplement medierer nephrin-omfordeling og actin-dissociation i eksperimentel membranøs nefropati.NyreInt. 64: 2072-2078. 2003.
22. Gagliardini E, Benigni A, Tomasoni S, Abbate M, Kalluri R og Remuzzi G. Målrettet nedregulering af ekstracellulær nefrin i human IgA nefropati. Am J Nephrol. 23: 277-286. 2003.
23. Wakamatsu A, Fukusumi Y, Hasegawa E, Tomita M, Watanabe T, Narita I og Kawachi H. Rolle af calcineurin (CN) inyreglomerulær podocyt: CN-hæmmer forbedrede proteinuri ved at hæmme omfordelingen af ​​CN ved spaltemembranen. Physiol Rep. 4: e12679. 2016.
24. Garg P. En gennemgang af podocytbiologi. Am J Nephrol. 47(Suppl 1): 3–13. 2018.
25. Ichimura K, Kurihara H og Sakai T. Aktinfilamentorganisation af fodprocesser i rottepodocytter. J Histochem Cytochem. 51: 1589-1600. 2003.
26. Ronco P. Proteinuria: er det hele i foden? J Clin Invest. 117: 2079-2082. 2007.
27. Verma R, Kovari I, Soofi A, Nihalani D, Patrie K og Holzman LB. Nephrin ektodomæne-engagement resulterer i Src-kinase-aktivering, nephrin-phosphorylering, Nck-rekruttering og actin-polymerisering. J Clin Invest. 116: 1346-1359. 2006.