Molekylære veje relateret til levetidsfremme og kognitiv forbedring af Cistanche Tubulosa i Drosophila

for flere oplysninger:ali.ma@wecistanche.com

Wei-Yong Lin et al

Abstrakt:

Baggrund:Aldringsprocessen, herunder fysisk dysfunktion og aldersrelateret hukommelsessvækkelse (AMI), anses for at være korreleret med kumulative oxidative skader og insulin/IGF-1-signalvejene. Formål: Denne undersøgelse var at belyse in vivo effekter på at forsinke aldring og forbedre AMI og underliggende molekylære mekanismerCistanche tubulosa(CT), en urt, der bruges i traditionel kinesisk medicin til at forbedre seksuel funktion og behandle nyresvigt

Metoder:Fluerne, behandlet og ubehandlet med CT(Cistanche Tubulosa), blev observeret for levetid, resistens over for oxidativ stress med H2O2 eller paraquat, sultassay, kognitiv adfærd med T-labyrint og transskriptionsniveauer af målgener med kvantitativ RT-PCR.

Resultater:Administration af CT(Cistanche Tubulosa)forlænget middel og maksimal levetid og øget modstandsdygtighed over for oxidativ stress hos fluer. CT(Cistanche Tubulosa)tilskud forbedrede også hukommelsesdannelse hos unge fluer og undertrykte AMI ved aldring. Adskillige gener og signalveje, herunder det mekanistiske mål for rapamycin (mTOR) og Notch-netværk, er blevet identificeret som forårsager disse farmakologiske virkninger og ændringer i genekspressionen af ​​glutamatreceptorer.

Konklusion:Vores resultater indikerer, at CT(Cistanche Tubulosa)tilskud kan bidrage til at bremse aldringsfænotyper og lindre kognitiv adfærdsmæssig tilbagegang hos fluer, hvilket indikerer potentiel anvendelighed til at forbedre menneskers sundhed og reducere modtageligheden for aldersrelaterede lidelser.

Nøgleord:Aldring,Cistanche tubulosa,Kognitiv adfærd, Herb

Klik for at Cistanche stilkprodukter

Introduktion

Efterhånden som den aldrede befolkning stiger på verdensplan, er fremme af sund aldring og lang levetid et stadig mere afgørende folkesundhedsproblem for videnskaben, samfundet og det medicinske område. Ældningsprocessen er blevet foreslået som styret af komplekse mekanismer, drevet af et bredt samspil af genetiske og miljømæssige faktorer. På grund af gradvise skader på celle- og vævsniveau er alder en risikofaktor for og i høj grad korreleret med modtageligheden for kroniske sygdomme som cancer samt hjerte-kar- og neurodegenerative sygdomme (Kenyon, 2005). Aldring reducerer også synaptisk aktivitet, ny proteinsyntese og kognitiv funktion. Disse funktionelle ændringer bidrager til aldersrelateret hukommelsessvækkelse (AMI) (Burke og Barnes, 2010; Schimanski og Barnes, 2010). Derfor kan udvikling af lægemidler til at forsinke aldersrelateret patologi og kognitiv aldring være gavnlig for menneskets livskvalitet. I denne undersøgelse brugte vi Drosophila melanogaster, som er en ideel organisme til in vivo ældningsundersøgelser på grund af dens korte levetid, til at evaluere lægemiddeleffektivitet og udforske de molekylære mekanismer, der ligger til grund for forbedringen af ​​aldring og AMI.

Herbacistanche, også kendt under sit kinesiske navn Rou CongRong, er en parasitisk plante, der hovedsageligt er udbredt i ørkenerne i det nordvestlige Kina. To Cistanche arter, Cistanche deserticolaY. C. Ma ogCistanchetubulosa(Schrenk) Wight er inkluderet i Chinese Pharmacopoeia (2005-udgaven) for deres lignende kemiske ingredienser og farmakologiske aktiviteter. Deres stammeekstrakt har været meget brugt i tusinder af år som et styrkende middel, hovedsageligt til behandling af forskellige symptomer, herunder mangelfuld nyrefunktion, impotens, infertilitet og til at lette katharsis, som beskrevet i gamle kinesiske lægebøger. Talrige kemiske bestanddele, herunder æteriske olier, phenylethanoidglycosider (PhGs), iridoider, lignaner og saccharider, er blevet isoleret fraCistanchearter, og to vigtige PhG-komponenter, acteosid og andechinacosid er typisk udvalgt som markører for kvalitetsevalueringen af ​​Herba cistanche på grund af deres betydelige farmakologiske virkninger (Wang et al., 2012).

Cistanche tubulosa(CT) ekstrakter besidder forskellige biologiske funktioner, der inkluderer modulerende immunaktivitet, forbedring af seksuel funktion, fremme af hårvækst og andre fordele på antioxidation, leverbeskyttelse, antiosteoporotisk aktivitet og anti-tumor (Li et al., 2016; Seok et al., 2015 ; Wang et al., 2012). Derudover viste in vitro undersøgelse, at Herbacistancheekstrakt kan beskytte dopaminlignende neuroner fra H2O2-induceret oxidativ skade og signifikant øge niveauerne af nervevækstfaktor og hjerneafledt neurotrofisk faktor (Lin et al., 2013). Echinacoside forhindrede dopaminneurondød i den MPTP-læsionerede musemodel af Parkinsons sygdom (Zhao et al., 2010). Desuden CT(Cistanche Tubulosa)ekstrakt forbedrede den kognitive dysfunktion gennem faldende amyloidaflejring og øgede acetylcholin- og dopaminniveauer i en rottemodel for Alzheimers sygdom (AD) (Wu et al., 2014). Selvom den terapeutiske virkning af Herbacistancheer stadig påkrævet for at bekræfte, i lille størrelse, ikke-placebokontrolleret klinisk forsøg med CT(Cistanche Tubulosa)glykosidekstrakter viste, at lægemidlet har potentiale til at behandle patienter med mild til moderat AD og har relativt milde bivirkninger, selv efter langvarig administration (Guo et al., 2013). Disse data tyder på, at glycosid ekstrakter i Herbacistanchehar neurobeskyttende og anti-demens virkninger. På trods af forskellige fordele ved CT(Cistanche Tubulosa)Dets molekylære mekanismer og virkninger på at forsinke aldring og forbedre AMI er ikke blevet belyst. I denne undersøgelse er virkningerne af CT(Cistanche Tubulosa)på en signifikant forlængelse af levetiden forbedret modstand mod miljøstress og undertrykt aldersrelateret kognitiv dysfunktion blev undersøgt for at bestemme den mulige kliniske nytte af CT(Cistanche Tubulosa)ved at bremse aldringsprocessen.

Materialer og metode

Urtemedicin

Oprindelsesidentifikation afCistanche tubulosa(Schrenk) Wight(Orobanchaceae) (CT) blev verificeret i Ko Da PharmaceuticalCo. Ltd. (Taoyuan, Taiwan), hvor kuponprøver (10.603.205) er blevet opbevaret, og CT-koncentreret urtemedicin fremstilles. Kort fortalt blev den tørrede kødfulde stilk af CT ekstraheret i 12-fold kogt vand i 1 time efterfulgt af filtrering. Filtraterne blev opsamlet og underkastet vakuum og reduceret trykkoncentration i 1 time for at opnå ekstrakter. CT-ekstrakterne blev blandet med stivelse i et 1:1-forhold (vægt/vægt) og underkastet spraygranulering for at opnå CT-pulver.

Vedligeholdelse af fluebestand og levetidsmåling

Vildtypefluelinjen, der blev brugt i denne undersøgelse, var af CantonS, opnået fra Bloomington Drosophila Stock Center. Fluer blev rejst og vedligeholdt i majsmel standardmedier ved 25 grader i 50-60 procent relativ luftfugtighed under en 12-t lys-mørke cyklus. Nye voksne fluer blev indsamlet inden for 24 timer og adskilt efter køn. Fra tidlig voksenalder blev fluer suppleret med CT. CT(Cistanche Tubulosa)pulver blev opløst i vand og tilsat majsmelmedier ved 5,4, 10,8 og 21,6 mg/ml koncentrationer, som var proportionale med den effektive daglige dosis til human oral administration. I en levetidsanalyse blev tyve til tredive fluer rejst i et fødevarehætteglas med eller uden CT(Cistanche Tubulosa); der blev udført mindst 250 fluer for hver behandling. Hætteglas med mad blev udskiftet hver 3. til 4. dag, og døde fluer blev talt på det tidspunkt

Stressresistensanalyser

Voksne fluer blev indsamlet og derefter forbehandlet med en kontroldiæt uden CT(Cistanche Tubulosa)og eksperimentelle diæter suppleret med 5,4, 10,8 og 21,6 mg/ml CT i 20 dage ved 25 grader. Til sultanalyse blev fluer kun holdt i hætteglas med vådt papir og evalueret deres udholdenhed mod sult-induceret oxidativ stress. Til oxidativ stress-assays blev fluerne overført til fødevarefrie hætteglas indeholdende et filterpapir med hydrogenperoxid (H2O2) (Sigma Aldrich) i en 5 procent glucoseopløsning for at måle fluernes modstand mod H2O2-induceret hydroxylradikal (OH) −) stress. Tilsvarende blev fluer overført til hætteglas indeholdende et filterpapir mættet med 10 mM paraquat (Sigma-Aldrich), som genererer superoxidanioner (O2 -), der forårsager oxidativ skade på dyr. Fluer blev vurderet for dødelighed mindst tre gange dagligt, indtil alle var døde. Der blev udført mindst 250 fluer pr. behandling. Til klatring blev fluer udsat for paraquat i 0 og 16 timer anbragt i et plastikhætteglas og forsigtigt banket i bunden. Antallet af fluer i toppen af ​​hætteglasset blev talt efter 18 sekunders klatring.

Frugtbarhedsvurdering

Både jomfruelige hanner og hunner blev fodret med 5,4 og 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)i 20 dage fungerede som forsøgsgrupper. Ti eksperimentelle hunner blev parret med et lige så stort antal jomfruelige hanner, som var 9-dage gamle og ikke havde modtaget CT. Tilsvarende blev de eksperimentelle hanner parret med jomfruelige hunner i samme tilstand. De parrede hunfluer blev derefter overført til et nyt hætteglas til æglægning i 24 timer, og det samlede antal æg, der blev lagt i hætteglassene, blev talt manuelt. Et indeks for frugtbarhed blev beregnet som den gennemsnitlige daglige ægproduktion pr. hun. Der blev udført mindst fem hætteglas pr. behandling, og fluer i alt n=50–80.

Lugtende associativ indlæring og hukommelse

Fluer blev opsamlet efter eclosion og forbehandlet med 5,4, 10,8 og 21,6 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)fungerede som forsøgsgrupper, og kontrolfluerne havde ikke modtaget CT(Cistanche Tubulosa)i 5 og 20 dage ved 25 grader . Et enkelt træningsforsøg blev udført ifølge en tidligere undersøgelse (Dubnau et al., 2001). Kort fortalt blev cirka 100 fluer sekventielt udsat for to lugte, enten 3-octanol (OCT, Sigma-Aldrich) eller 4-methylcyclohexanol (MCH, Sigma-Aldrich). Fluer udsat for den første lugt (konditioneret stimulus, CS plus ) blev parret med 80 V elektriske stød og modtog derefter en anden lugt (CS-) uden stød. Indlæringsevnen blev bestemt umiddelbart efter træning og evnerne til 3- og {{ 12}} timers hukommelse har udført testene efter træningsproceduren i henholdsvis 3 og 24 timer. For at udføre testen blev de trænede fluer fanget i valgstedet for en T-labyrint, hvor de blev udsat for OCT og MCH samtidigt. Et præstationsindeks (PI) blev beregnet til at repræsentere den konditionerede lugt undgåelse. En PI på nul indikerede en 50:50 fordeling, og en PI på 100 viste en 0:100 fordeling væk fra CS plus lugten.

Målinger af transskriptionsniveauer gennem real-time kvantitativ PCR(qPCR)

Fluer blev opsamlet efter eclosion og forbehandlet med 5,4 og 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)i 20 dage ved 25 grader fungerede som forsøgsgrupper, og kontrolfluerne havde ikke modtaget CT. Det samlede RNA blev ekstraheret ved hjælp af et RNeasy Mini-kit (Qiagen), og cDNA blev syntetiseret fra det totale RNA gennem omvendt transkriptionsreaktion ved hjælp af en højkapacitets cDNA omvendt transkription (Thermo Fisher Scientific). Transskriptionsniveauerne af målgener blev kvantificeret gennem kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid (Applied Biosystems ViiATM 7 Real-Time PCR System) ved hjælp af FastStart SYBR Green Master (Roche) i henhold til producentens instruktioner. Relative transkriptforekomster blev normaliseret ved hjælp af den sammenlignende cyklustærskelmetode med et husholdningsgen, RpLP0, som den interne standard. De relative ekspressionsforskelle i målgenerne for forsøgsgrupperne blev normaliseret til dem i en kontrolgruppe og præsenteret som en foldændring. Primerne for målgenerne er anført i supplerende tabel 1.

Netværkskonstruktion og analyse

For at analysere den funktionelle fortolkning og biologiske processer medieret af de differentielt udtrykte gener, vi identificerede, blev Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) brugt til at kommentere og analysere berigelsen af ​​Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome (KEGG) pathway og Gene Ontologi for disse gener (Jiao et al., 2012). For at analysere de direkte og indirekte interaktioner af differentielt udtrykte gener, blev genlisten også uploadet til søgeværktøjet til hentning af interagerende gener/proteiner (STRING) for at hente interaktionsinformationen og generere proteininteraktionsnetværk (Franceschini et al., 2013).

Statistisk analyse

Alle eksperimenter blev udført med mindst tre uafhængige replikater, og statistiske analyser blev udført med SigmaStat v3.5-software (Systat Software, Inc., IL). Data for levetidsforlængelse og oxidativ stress-udfordringer blev udført med et totalt antal fluer i området fra 25 0-350, og log-rank-testen blev vurderet til forskellige analyser. Gruppesammenligninger til frugtbarhedsvurdering og kognitiv test blev evalueret ved en-vejs variansanalyse (ANOVA), efterfulgt af Dunnetts post-hoc test. Andre eksperimentelle sammenligninger blev foretaget ved at udføre en Students t-test sammenlignet med kontrolgruppen. Data er repræsenteret som middelværdi ± SEM, og en p-værdi på < 0,05="" blev="" betragtet="" som="">

Resultater

CT (Cistanche Tubulosa) tilskud forlænger fluens levetid

For at undersøge om CT(Cistanche Tubulosa)tilskud kan forlænge fluens levetid, fluer blev suppleret med 5,4, 10,8 og 21,6 mg/ml CT umiddelbart efter eclosion ved 25 grader gennem hele forsøgsprocedurerne. Vores data indikerede, at CT(Cistanche Tubulosa)tilskud kan forlænge levetiden for både han- og hunfluer. Som vist i fig. 1A blev hanfluernes levetid forlænget med alle doser CT(Cistanche Tubulosa). Den gennemsnitlige levetid for grupperne suppleret med 5,4, 10,8 og 21,6 mg/ml CT steg signifikant med henholdsvis 18,9 procent, 10,3 procent og 9,9 procent. CT(Cistanche Tubulosa)øgede også signifikant den maksimale levetid for alle CT-grupper sammenlignet med kontrolgruppen fra 88 til 102, 98 og 102 dage efter behandling med 5,4, 10,8 og 21,6 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa), henholdsvis. Hos kvinder, CT(Cistanche Tubulosa)øgede den gennemsnitlige levetid for CT-grupperne signifikant sammenlignet med kontrolgruppen (fig. 1B). Den gennemsnitlige levetid steg op til 18,8 procent med 5,4 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)og 5,5 procent og 6,7 procent med henholdsvis 10,8 og 21,6 mg/mlof CT. Vi observerede også, at den maksimale levetid blev signifikant forlænget fra 91 dage (kontroller) til 109, 98 og 102 dage efter behandling med 5,4, 10,8 og 21,6 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa), henholdsvis; den maksimale stigning i den maksimale levetid var 19,8 procent ved 5,4 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa). Vores resultater tyder på, at CT(Cistanche Tubulosa)kosttilskud forlænger levetiden for både han- og hunfluer markant. Curcumin (10 μM) blev brugt som en positiv kontrol og effektiv til forlængelse af levetiden, som vist i Supplerende Fig. 1.

CT-tilskud øger modstanden mod sult og oxidativ stress

Forlængelse af levetid er ofte forbundet med øget modstand mod oxidativt stress under ældningsprocessen. Vi vurderede om CT(Cistanche Tubulosa)tilskud øger modstanden mod oxidativt stress. Han- og hunfluer blev forbehandlet med forskellige doser CT(Cistanche Tubulosa)i 20 dage og evalueret for deres overlevelse efter sult (fig. 2A). Den gennemsnitlige overlevelsestid og maksimale levetid for begge køn, sammenlignet med kontrolgruppens, udviste signifikante stigninger i 5,4 og 10,8 mg/ml CT-grupperne, men ikke i de21 0,6 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)gruppe. De forbehandlede fluer blev også evalueret for deres overlevelse efter udfordringer med H2O2 og paraquat, som producerer reaktive oxygenarter (ROS) for at udløse cellulær senescens og celledød. Vi fandt den CT(Cistanche Tubulosa)beskyttede både han- og hunfluer mod H2O2-toksicitet og forlængede deres gennemsnitlige og maksimale levetid (fig. 2B, p < 0.01 og 0,001, ved 5,4 og 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa), henholdsvis). En lignende tendens, der viser øget modstand mod paraquat-udfordringen, blev også observeret. Han fluefoderet med alle doser CT, og hunner, især dem suppleret med 5,4 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa) (Cistanche Tubulosa), overlevede længere end kontrollerne (fig. 3A, p < 0.001).="" med="" hensyn="" til="" klatreevne="" fik="" både="" han-="" og="" hunfluer="" 10,8="" mg/ml="">(Cistanche Tubulosa)udviste svækket paraquat-induceret lokomotorisk dysfunktion 16 timer efter paraquatchallenge (fig. 3B, alle p < 0.05).="" disse="" resultater="" afslører,="" at="" ct-tilskud="" forbedrer="" modstanden="" mod="" oxidativ="" stress,="" hvilket="" tyder="" på,="" at="">(Cistanche Tubulosa)-induceret levetidsforlængelse er forbundet med øget antioxidativt forsvar.

Effekter af CT (Cistanche Tubulosa) på reproduktionsevnen

Fordi teorien om aldring indikerer, at aldringsprocessen påvirker reproduktionen negativt, undersøgte vi om CT(Cistanche Tubulosa)påvirket den reproduktive kondition ved at analysere voksne fluers æglægningsevne. Voksne fluer blev indsamlet efter eclosion, adskilt efter køn og administreret 5,4 og 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)i 20 dage. Jomfru han- eller hunfluer administreret CT(Cistanche Tubulosa)blev parret med 9-daggamle fluer, der ikke fik CT(Cistanche Tubulosa). Vi observerede dosisafhængige stigninger i det daglige antal æg lagt pr. hun, nemlig 30,3 procent og 57,2 procent gamle fluer behandlet med 5,4 og 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)sammenlignet med kontrollerne (fig. 4, p < 0.05).="" disse="" data="" tyder="" på,="" at="">(Cistanche Tubulosa)tilskud kunne lette reproduktionsevnen hos ældre hunner, men gør det sandsynligvis ikke hos ældre hanner.

CT (Cistanche Tubulosa) tilskud forbedrer kognitive evner

Vi fastslog, om CT(Cistanche Tubulosa)tilskud har gavnlige virkninger på indlærings- og hukommelsesevner, en enkelt cyklus af olfaktorisk associativ træning blev udført. Vi evaluerer læringspræstation såvel som 3- og 24-h-hukommelse, som er blevet anset for at være henholdsvis mellemtidshukommelsen og langtidshukommelsen. Først blev fluer suppleret med forskellige doser CT(Cistanche Tubulosa)i 5 dage. Indlæringsevnen var ens i både CT- og kontrolgruppen (fig. 5A). Med hensyn til 3-h hukommelse, 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)gruppen havde en tendens til at have et højere ydeevneindeks (PI) end kontrollerne (fig. 5B, 51,5 ± 3,2 versus 42,6 ± 2,1), selvom der ikke er nogen signifikant forskel. Desuden 5,4 og 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)signifikant forbedret {{0}}h hukommelsen for fluer sammenlignet med kontrollerne (fig. 5C, PI=41.6 ± 3.6 og 45.9 ± 3.0 henholdsvis 29.6 ± 2.9 , p < 0.05="" og="" 0.01).="" disse="" resultater="" indikerede,="" at="" ct-supplementering="" forbedrer="" hukommelsesdannelsen="" hos="" unge="" fluer.="" for="" det="" andet,="" mens="">(Cistanche Tubulosa)Tilskud øgede fluernes levetid og oxidative modstandsdygtighed, og vi undersøgte yderligere, om tilskuddet også kunne forbedre kognitiv adfærd hos ældre fluer. Fluer fik standardfoder med eller uden 5,4, 10,8 og 21,6 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)i 20 dage for at efterligne aldring; fluerne suppleret med disse doser CT(Cistanche Tubulosa)havde signifikant højere PI'er under indlæring (henholdsvis 67,6 ± 1,9, 72,5 ± 0,5 og 75,2 ± 1,3) end kontrollerne (58.0 ± 2.0; Fig. 5D , p < 0.001), hvilket tyder på, at CT(Cistanche Tubulosa)har en gavnlig effekt på at forsinke det aldersrelaterede fald i indlæring. Lignende resultater afslørede også, at 5,4 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)gruppen havde mere effektiv hukommelsesretention i {{0}}h (fig. 5E, 47,5 ± 1,9 versus kontrol37.{{10}} ± 2,9, p < 0,05)="" og="" 24-="" h="" hukommelsestest="" (fig.="" 5f,="" 31,8="" ±="" 3,8="" versus="" kontrol="" 19,3="" ±="" 2,4,="" p="">< 0,01).="" disse="" resultater="" indikerer,="" at="">(Cistanche Tubulosa)tilskud forbedrer ikke kun hukommelsesdannelse hos unge fluer, men forsinker også kognitiv adfærdssvækkelse og opretholder mere effektiv indlæring og hukommelsesevne med alderen.

Molekylære veje relateret til fremme af lang levetid og kognitiv forbedring af CT-tilskud

CT(Cistanche Tubulosa)tilskud både undertrykker AMI og forlænger levetiden. Derfor begrundede vi, at AMI- og levetidsrelaterede gener kunne bestemmes ved at vurdere differentiel ekspression mellem kontrol- og 5,4 og 10,8 mg/ml CT-grupper gennem qPCR. Ændringerne i genekspression af de CT-behandlede fluer blev sammenlignet med ændringerne i kontrolgruppen blev vist i fig. 6A. Den opregulerede ekspression af flere målgener, herunder Sirt6, Sir2, Sod, p38b og Sirt2, kan være involveret i ældningsprocessen. Transskriptionsniveauer af S6k, raptor, Psn, Rpd3 og N steg også, hvilket tyder på, at CT(Cistanche Tubulosa)tilskud ændrer signaltransduktionen af ​​demTOR- og Notch-vejene. Derudover påvirkede CT-tilskud signifikant mRNA-ekspressionen af ​​Nmdar1, Nmdar2 ogSkpA. For at fremhæve de CT-relevante proteininteraktioner, der forlænger levetiden og forbedrer indlæring og hukommelse, blev et litteraturbaseret proteininteraktionsnetværk af qPCR-screenede gener skabt (fig. 6B). Hver knude repræsenterer et protein, hvorimod hver kant angiver en litteraturbaseret interaktion. Noder er grupperet i overensstemmelse med KEGG-vejen og genontologiens biologiske proces (GOBP). Som vist i fig. 6B er den neuroaktive GOBP-ligand-receptor-interaktion, som påvirker indlæring og hukommelse, og en anden GOBP-aldring, som er korreleret med levetid, begge forbundet med Notch-signalvejen. Derudover er GOBP af aldring påvirket af mTOR-signalvejen. Betydningen af ​​CT-induceret genoverekspression på disse GOBP'er og veje er beskrevet i diskussionsafsnittet.

Fig. 6. Netværksanalyse af differentielt udtrykte gener. Fluer forbehandlet med 5,4 og 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)og kontroldiæter ved 25 grader i 20 dage blev indsamlet til kvantificering af differentiel genekspression. (A) De relative transkriptniveauer af målgener til kontrollerne blev kvantificeret gennem qPCR. n=4 for hver gruppe. (B) Opregulerede gener involveret i cellesignaltransduktion og deres interaktionsnetværk. Noder repræsenterer gener. Gener med overekspression er cirklet med grønt. Kanter repræsenterer interaktioner mellem genprodukter. Interaktionstyper er angivet med forskellige farver i figuren. (For fortolkning af referencerne til farve i denne figurforklaring henvises læseren til webversionen af ​​denne artikel.)

Diskussion

En ubalance mellem generering og eliminering af frie radikaler af endogene antioxidative forsvarssystemer kan forårsage oxidativ skade på væv med alderen; frie radikaler spekuleres således i at spille en kritisk rolle i alderdom (Dato et al., 2013). Her viste vi, at CT(Cistanche Tubulosa)tilskud hos fluer forlænger levetiden og resulterer i en høj tolerance over for oxidative skader forårsaget af H2O2 og paraquat hos begge køn. Undersøgelserne korrelerede med CT(Cistanche Tubulosa)andantiaging, er mindre undersøgt, men ekstrakter fra C. deserticola kan forlænge levetiden hos ældningsaccelererede musetilbøjelige 8 (SAM-P8) mus (Zhang et al., 2014) og echinacoside, en af ​​de vigtigste forbindelser, der findes i CT , har gavnlige effekter på levetidsforlængelsen og stresstolerance hos C. elegans (Wang et al., 2015).

Nylige dyreforsøg har vist, at echinacosid har beskyttende virkninger mod bisphenol A-induceret testikeltoksicitet og øger testosteronbiosyntesen ved induktion af testikelsteroidgene enzymer, herunder CYP11A1, 3 -HSD og CYP17A1 (Jiang et al., 2016). CT(Cistanche Tubulosa)Ethanolekstrakt fremmer også levedygtigheden og kvaliteten af ​​sædceller hos rotter (Wang et al., 2016). Selvom sammenhængen mellem CT(Cistanche Tubulosa)og østrogen stadig skal udforskes, rapporterede en undersøgelse, at echinacosid signifikant øger ekspressionen af ​​østrogenreceptorer, svarende til den østradiolbehandlede gruppe i ovariektomiserede rotter (Li et al., 2013). Fordi reproduktionskapacitet forekommer negativt korreleret med alder (Kenyon, 2005), undersøgte vi, om CT har fordele hos gamle fluer. Reproduktiv kondition påvirket af CT(Cistanche Tubulosa)blev kun observeret hos hunner, hvilket tyder på, at hunfluer kan reagere mere på CT(Cistanche Tubulosa)tilskud. Disse resultater afslører, at CT kan have en kønshormonlignende effekt og forsinke reproduktiv ældning, i overensstemmelse med den kliniske brug af CT(Cistanche Tubulosa)til behandling af seksuel dysfunktion hos mennesker.

Acteosid kan belyse de beskyttende virkninger for at mindske neuronapoptose og hukommelsestab i en senescent musemodel induceret af en kombination af D-galactose og AlCl3, hvilket tyder på, at CT kan have potentialet til at have neurobeskyttende og hukommelsesforøgende egenskaber (Gao et al., 2015; Peng et al., 2015). Vores data indikerede, at hukommelsesdannelse blev forbedret i CT-suppleret unge fluer. Derfor vurderede vi, om CT(Cistanche Tubulosa)tilskud er gavnligt for hukommelsesbevarelse ved aldring, fordi kognitive funktioner er kendt for at falde ved normal aldring. Vores resultater afslørede, at flere typer AMI'er, herunder læring, 3- og 24-hmeory, kan forbedres ved CT(Cistanche Tubulosa)tilskud i 20 dage.Ifølge de førnævnte resultater, CT(Cistanche Tubulosa)tilskud kan have gavnlige virkninger på levetiden og forbedring af hukommelsesdannelsen samt forsinke AMI tilstrækkeligt.

Brug af dyremodeller letter identifikation af de potentielle mekanismer og CT-stiafhængigheden(Cistanche Tubulosa)at bremse hjernens aldring og udskyde AMI på celleniveau. Vi fokuserede på molekylære mekanismer, der ligger til grund for aldring, neuronal transmission og oxidativ stress og begrundede, at AMI- og levetidsrelaterede gener kunne identificeres ved at undersøge differentiel ekspression mellem kontrol- og CT-grupper gennem qPCR. Notch-signalvejen er meget bevaret blandt arter fra Drosophila til mennesker; det udtrykker i det voksne centralnervesystem for neural plasticitet og regulerer neural differentiering sammen med dets inhibitornumb under udvikling (Presente et al., 2001). Mus, der bærer en heterozygot mutation af Notch, er mangelfulde i rumlig indlæring og hukommelse (Costa et al., 2003). Presenilin (Psn) er påkrævet for at aktivere spaltningen af ​​Notch ind i Notch intracellulære domæne, og knockout af Psn forårsager svækkelse af synaptisk plasticitet og hukommelsesdannelse (Saura et al., 2004). Vores data afslørede en dosisafhængig opregulering af Notch og Psn i CT(Cistanche Tubulosa)supplerede fluer, med et uændret udtryksniveau af følelsesløshed, hvilket antyder Notch-signalvejen som en potent mekanisme til forbedring af hukommelsen ved CT-tilskud. Ud over Notch-signalering, N-methyl-D-aspartat-receptor (NMDAR), glutamat- og D-serin-drevet ionkanal i neuroner, kontrolsynaptisk plasticitet og hukommelsesfunktion (Furukawa et al., 2005). Drosophila-genomet indeholder to NMDAR-underenheder, Nmdar1 ogNmdar2, og begge er afgørende for hukommelsesfunktionen. Nmdar1 knockdown i Drosophila hæmmer indlæring og hukommelse (Xia et al., 2005), hvorimod Nmdar2 overekspression hos mus forbedrer indlæring og hukommelse (Tang et al., 2001). Vores data viste en dosisafhængig stigning i Nmdar1 og Nmdar2 opregulering hos CT-suppleret fluer, hvilket tyder på en anden potentiel mekanisme for hukommelsesforbedring ved CT(Cistanche Tubulosa)tilskud.

Klassen O af forkhead box transcription factor (FoxO)-vejen er bevaret blandt arter og kritisk i metabolisme, stresstolerance og forlængelse af levetiden (Lehtinen et al., 2006). Posttranslationelle modifikationer, herunder phosphorylering, acetylering og ubiquitylering, regulerer aktiviteten af ​​FoxOs (van der Horst og Burgering, 2007). Silent information regulator 2 (Sir2; homologen i pattedyr er kendt som SIRT1) regulerer aktiviteten af ​​FoxO gennem deacetyleringen og påvirker dyrenes levetid relateret til den insulinlignende vækstfaktor (IGF)-vej (Lemieux et al., 2005). Sirt6 dephosphorylerer FoxO for at forårsage forlængelse af levetiden hos hanmus (Kanfi et al., 2012). Vores data afslørede Sir2 og Sirt6 opregulering i CT-suppleret fluer, hvilket antyder, at FoxO regulering af Shirts kan være en potent mekanisme til forlængelse af levetiden ved CT(Cistanche Tubulosa)tilskud. Frie radikaler produceret under metaboliske processer forårsager skade på DNA og proteiner, hvilket fører til en forkortet levetid. Sir2 er også et gen for oxidativ stressrespons (Whitaker et al., 2013), og overudtrykt superoxiddismutase (SOD), som omdanner O2− til H2O2 og endelig til H2O ved at bruge katalase og glutathionperoxidase, er blevet rapporteret at forlænge levetiden hos fluer ( Le Bourg, 2001). Vores data afslørede dosisafhængig Sod og Sir2 opregulering i CT-suppleret fluer, hvilket tyder på, at antioxidative veje kan være en potent mekanisme for forlængelse af levetiden ved CT(Cistanche Tubulosa)tilskud.

En anden nøglevej i aldring reguleres af mTOR-komplekserne mTORC1 og mTORC2, som begge fremmer organismealdring på en evolutionært konservativ måde. Signaler fra theinsulinreceptoren aktiverer mTORC1 gennem phosphoinositide3-kinase-Akt-vejen for at fremme proteinsyntese og inflammation og for at hæmme autofagi og glykolyse ved at bruge distinkte nedstrømsproteiner (Johnson et al., 2013). Proteinsyntese aktiveres af ribosomalt protein S6-kinase (S6K), som danner en negativ feedback-loop for at hæmme insulinreceptorsignalering (Hands et al., 2009). Et inhiberende mål for mTORC1 er Drosophila-proteinet lignende (sima), hvis homolog i pattedyr er kendt som hypoxi-inducerbar faktor 1 alfa (HIF1). HIF1 spiller en beskyttende rolle mod aldersafhængige skader på blodkar og motoriske neuroner (Oosthuyse et al., 2001; Rivard et al., 2000). Vores data afslørede et uændret ekspressionsniveau af mTOR komplekse underenheder, herunder Tor, rictor og raptor, hvorimod CT(Cistanche Tubulosa)tilskud dosisafhængigt opregulerede S6K og sima, hvilket indebærer en beskyttende rolle for CT(Cistanche Tubulosa)mod mTOR-aktivitet.

Konklusioner

På trods af at nogle implicerede veje er blevet identificeret, bidrog CT med lang levetid og høj intelligens(Cistanche Tubulosa)intervention kan være apolygen egenskab påvirket af samspillet mellem flere gener, og andre genetiske faktorer, som vi ikke har belyst, kan også modulere aldringsprocessen. For ældre bør opretholdelse af ønskelig fysisk kondition og kognitive evner for at udskyde eller forebygge demens og kroniske sygdomme være en afgørende tilegnelse fra undersøgelser om aldring. Fordi CT(Cistanche Tubulosa), kendt som "ørkenens ginseng," har en markant helbredende effekt på forstærkningen af ​​nyre-yang, som nærer alle organer og genopbygger den vitale essens i traditionel kinesisk medicin, mener vi, at vores undersøgelse giver beviser, der understøtter den kliniske behandling af CT(Cistanche Tubulosa)og kan give værdifuld indsigt i udviklingen af ​​nye lægemidler eller fødevaretilsætningsstoffer til ikke kun at forsinke aldring og aldersrelaterede sygdomme, men også for at forbedre menneskets livskvalitet.

Interessekonflikt

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Anerkendelser

Dette arbejde blev støttet af China Medical University(CMU103-S-25); China Medical University Hospital (DMR-101-065,DMR-103-099); Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Taiwan (NSC 102-2632-B-039-001-MY3, MEST 104-2632-B-039-002), og til dels af Taiwan Ministry of Health and Welfare Clinical Trial and Research Center of Excellence (MOHW105-TDU-B-212-133019).

Supplerende materialer

Supplerende materiale forbundet med denne artikel kan findes i onlineversionen på doi:10.1016/j.phymed.2017.01.006.

Fra: 'Molekylære veje relateret til fremme af lang levetid og kognitiv forbedring afCistanche tubulosai Drosophila' afWei-Yong Lin et al

--W.-Y. Lin et al. / Phytomedicine 26 (2017) 37–44

Referencer

Burke, SN, Barnes, CA, 2010. Ældrende synapser og hippocampus kredsløbsdynamik. Tendenser Neurosci. 33, 153-161.

Costa, RM, Honjo, T., Silva, AJ, 2003. Indlærings- og hukommelsesmangel hos Notch-mutantmus. Curr. Biol. 13, 1348-1354.

Dato, S., Crocco, P., D'Aquila, P., de Rango, F., Bellizzi, D., Rose, G., Passarino, G., 2013. Udforsker rollen af ​​genetisk variabilitet og livsstil i oxidativ stressrespons for sund aldring og lang levetid. Int. J. Mol. Sci. 14, 16443-16472.

Dubnau, J., Grady, L., Kitamoto, T., Tully, T., 2001. Afbrydelse af neurotransmission i Drosophila svampekrop blokerer genfinding, men ikke erhvervelsen af ​​hukommelse. Nature 411, 476–480.

Franceschini, A., Szklarczyk, D., Frankild, S., Kuhn, M., Simonovic, M., Roth, A., Lin, J., Minguez, P., Bork, P., von Mering, C. , Jensen, LJ, 2013. STRING v9.1: protein-protein interaktionsnetværk, med øget dækning og integration. Nucleic Acids Res. 41, D808–D815.

Furukawa, H., Singh, SK, Mancusso, R., Gouaux, E., 2005. Underenhedsarrangement og funktion i NMDA-receptorer. Natur 438, 185–192.
Gao, L., Peng, XM, Huo, SX, Liu, XM, Yan, M., 2015. Hukommelsesforbedring af Acteosid (Verbascoside) i en senescent musemodel induceret af en kombination af D-gal og AlCl3. Phytother. Res. 29, 1131-1136.
Guo, Q., Zhou, Y., Wang, CJ, Huang, YM, Lee, YT, Su, MH, Lu, J., 2013. Et åbent, ikke-placebokontrolleret studie vedr.Cistanche tubulosaglykosidkapsler (Memoregain((R))) til behandling af moderat Alzheimers sygdom. Er. J. Alzheimers Dis. Andre Demen. 28, 363-370.
Hands, SL, Proud, CG, Wyttenbach, A., 2009. mTORs rolle i aldring: proteinsyntese eller autofagi? Aging (Albany NY) 1, 586-597.
Jiang, Z., Wang, J., Li, X., Zhang, X., 2016. Echinacoside ogCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight forbedrer bisphenol A-induceret testikel- og sædskade hos rotter gennem gonadakse-regulerede steroidogene enzymer. J. Ethnopharmacol 193, 321-328.
Jiao, X., Sherman, BT, Huang da, W., Stephens, R., Baseler, MW, Lane, HC, Lempicki, RA, 2012. DAVID-WS: en stateful webservice til at lette gen/proteinlisteanalyse. Bioinformatik 28, 1805-1806.
Johnson, SC, Rabinovitch, PS, Kaeberlein, M., 2013. mTOR er en nøglemodulator for aldring og aldersrelateret sygdom. Nature 493, 338–345.
Kanfi, Y., Naiman, S., Amir, G., Peshti, V., Zinman, G., Nahum, L., Bar-Joseph, Z., Cohen, HY, 2012. Sirtuin SIRT6 regulerer levetiden hos mænd mus. Nature 483, 218–221.
Kenyon, C., 2005. Aldringens plasticitet: indsigt fra langlivede mutanter. Celle 120, 449-460.
Le Bourg, E., 2001. Oxidativ stress, aldring og lang levetid i Drosophila melanogaster. FEBS Lett. 498, 183-186.
Lehtinen, MK, Yuan, Z., Boag, PR, Yang, Y., Villen, J., Becker, EB, DiBacco, S., de la Iglesia, N., Gygi, S., Blackwell, TK, Bonni, A., 2006. En bevaret MST-FOXO-signalvej formidler oxidativ-stress-responser og forlænger levetiden. Celle 125, 987-1001.
Lemieux, ME, Yang, X., Jardine, K., He, X., Jacobsen, KX, Staines, WA, Harper, ME, McBurney, MW, 2005. Sirt1-deacetylasen modulerer den insulinlignende vækstfaktorsignalvej i pattedyr. Mech. Aging Dev. 126, 1097-1105.
Li, F., Yang, X., Yang, Y., Guo, C., Zhang, C., Yang, Z., Li, P., 2013. Den antiosteoporotiske aktivitet af echinacosid i ovarieektomerede rotter. Phytomedicine 20, 549-557.
Li, Z., Lin, H., Gu, L., Gao, J., Tzeng, CM, 2016. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): en af ​​de bedste farmaceutiske gaver fra traditionel kinesisk medicin. Front Pharmacol. 7, 41.
Lin, S., Ye, S., Huang, J., Tian, ​​Y., Xu, Y., Wu, M., Wang, J., Wu, S., Cai, J., 2013. Hvordan gør kinesisk medicin, der tonificerer nyrerne, hæmmer dopaminerge neuronapoptose? Neural Regen. Res. 8, 2820-2826.

Oosthuyse, B., Moons, L., Storkebaum, E., Beck, H., Nuyens, D., Brusselmans, K., Van Dorpe, J., Hellings, P., Gorselink, M., Heymans, S. , Theilmeier, G., Dewerchin, M., Laudenbach, V., Vermylen, P., Raat, H., Acker, T., Vleminckx, V., Van Den Bosch, L., Cashman, N., Fujisawa, H., Drost, MR, Sciot, R., Bruyninckx, F., Hicklin, DJ, Ince, C., Gressens, P., Lupu, F., Plate, KH, Robberecht, W., Herbert, JM, Collen , D., Carmeliet, P., 2001. Deletion af hypoxi-responselementet i den vaskulære endoteliale vækstfaktorpromotor forårsager motorneurondegeneration. Nat. Genet. 28, 131-138.

Peng, XM, Gao, L., Huo, SX, Liu, XM, Yan, M., 2015. Mekanismen for hukommelsesforøgelse af Acteosid (Verbascoside) i senescent musemodel induceret af en kombination af D-gal og AlCl3. Phytother, Res. 29, 1137-1144.
Presente, A., Andres, A., Nye, JS, 2001. Krav om Notch i voksenalderen for neurologisk funktion og lang levetid. Neuroreport 12, 3321-3325.
Rivard, A., Berthou-Soulie, L., Principe, N., Kearney, M., Curry, C., Branellec, D., Semenza, GL, Isner, JM, 2000. Aldersafhængig defekt i vaskulær endotelvækst faktorekspression er forbundet med reduceret hypoxi-inducerbar faktor 1-aktivitet. J. Biol. Chem. 275, 29643-29647.
Saura, CA, Choi, SY, Beglopoulos, V., Malkani, S., Zhang, D., Rao, Shankaranarayana, Chattarji, BS, Kelleher, S., 3rd, RJ, Kandel, ER, Duff, K., Kirkwood , A., Shen, J., 2004. Tab af presenilinfunktion forårsager svækkelse af hukommelse og synaptisk plasticitet efterfulgt af aldersafhængig neurodegeneration. Neuron 42, 23-36.
Schimanski, LA, Barnes, CA, 2010. Neural proteinsyntese under aldring: effekter på plasticitet og hukommelse. Front Aging Neurosci. 2. Seok, J., Kim, TS, Kwon, HJ, Lee, SP, Kang, MH, Kim, BJ, Kim, MN, 2015. Effektivitet afCistanche Tubulosaog Laminaria Japonica-ekstrakter (MK-R7) supplerer for at forhindre mønstret hårtab og fremme hovedbundens sundhed. Clin. Nutr. Res. 4, 124-131.
Tang, YP, Wang, H., Feng, R., Kyin, M., Tsien, JZ, 2001. Differentielle virkninger af berigelse på indlæring og hukommelsesfunktion i NR2B transgene mus. Neuropharmacology 41, 779-790.
van der Horst, A, Burgering, BM, 2007. Understreger FoxO-proteinernes rolle i levetid og sygdom. Nat. Rev. Mol. Celle. Biol. 8, 440-450.
Wang, T., Chen, C., Yang, M., Deng, B., Kirby, GM, Zhang, X., 2016.Cistanche tubulosaEthanolekstrakt medierer rotte kønshormonniveauer ved induktion af testikelsteroidgene enzymer. Pharm. Biol. 54, 481-487.
Wang, T., Zhang, X., Xie, W., 2012.Cistanche deserticolaYC Ma, "Desert ginseng": en anmeldelse. Er. J. Chin. Med. 40, 1123-1141.
Wang, X., Zhang, J., Lu, L., Zhou, L., 2015. Langtidseffekten af ​​echinacoside i Caenorhabditis elegans medieret gennem daf-16. Biosci. Biotechnol. Biochem. 79, 1676-1683.
Whitaker, R., Faulkner, S., Miyokawa, R., Burhenn, L., Henriksen, M., Wood, JG, Helfand, SL, 2013. Øget ekspression af Drosophila Sir2 forlænger levetiden på en dosisafhængig måde. Aging (Albany NY) 5, 682-691.
Wu, CR, Lin, HC, Su, MH, 2014. Reversering ved vandige ekstrakter afCistanche tubulosafra adfærdsmæssige underskud i Alzheimers sygdomslignende rottemodel: relevans for amyloidaflejring og central neurotransmitterfunktion. BMC komplement. Altern. Med. 14, 202.
Xia, S., Miyashita, T., Fu, TF, Lin, WY, Wu, CL, Pyzocha, L., Lin, IR, Saitoe, M., Tully, T., Chiang, AS, 2005. NMDA-receptorer medierer olfaktorisk indlæring og hukommelse i Drosophila. Curr. Biol. 15, 603-615.
Zhang, K., Ma, X., He, W., Li, H., Han, S., Jiang, Y., Wu, H., Han, L., Ohno, T., Uotsu, N., Yamaguchi, K., Ma, Z., Tu, P., 2014. Ekstrakter af Cistanche deserticola kan modvirke immunosenescens og forlænge levetiden i alderdomsaccelereret mus
Prone 8 (SAM-P8) mus. Evid. Baseret komplement. Alternativ. Med. 2014, 601383.
Zhao, Q., Gao, J., Li, W., Cai, D., 2010. Neurotrofiske og neurorescue-effekter af Echinacoside i den subakutte MPTP-musemodel af Parkinsons sygdom. Brain Res. 1346, 224-236.