Molekylær udvikling af det bakteriedræbende/permeabilitetsforøgende protein (BPIFA1), der regulerer de medfødte immunresponser hos pattedyr, del 1

Abstrakt:

Baktericidt/permeabilitetsforøgende protein, en primær faktor i pattedyrs medfødte immunsystem, deltager i naturlig immunbeskyttelse mod invaderende bakterier. BPIFA1 bidrager aktivt til værtsforsvar via flere mekanismer, såsom antibakteriel, overfladeaktivt middel, luftvejsoverfladevæskekontrol og immunmodulerende aktiviteter. Imidlertid er den evolutionære historie og selektionskræfter på BPIFA1-genet i pattedyr under adaptiv evolution dårligt forstået. Denne undersøgelse undersøgte BPIFA1-genet hos mennesker sammenlignet med det fra andre pattedyrarter for at estimere det selektive tryk, der stammer fra adaptiv evolution. For at vurdere, om der forekom positiv selektion eller ej, anvendte vi flere forskellige mulighedstests (M1 vs. M2 og M7 vs. M8).

Andelene af positivt udvalgte steder var signifikante med en sandsynlighedslogværdi på 93,63 for BPIFA1-proteinet. Selektionsserveren blev brugt på det samme datasæt til at genbekræfte positiv selektion for specifikke steder ved at anvende den mekanistisk-empiriske kombinationsmodel, hvilket giver yderligere beviser, der understøtter resultaterne af positiv selektion. Der var overbevisende beviser for positive selektionssignaler i BPIFA1-generne fra pattedyrarter, hvilket var mere signifikant for selektionstegn og skabelse af signaler.

BPIFA1-protein, også kendt som LPLUNC1 eller Nasopharyngeal Carcinoma-associeret Gen 6 (NAG6), er et protein, der er stærkt udtrykt i de øvre luftveje og mundhulen. BPIFA1-protein er tæt forbundet med immunitet.

Undersøgelser har vist, at BPIFA1-proteinet har antibakterielle og immunmodulerende virkninger. BPIFA1-protein kan binde til invasiv Escherichia coli og ødelægge dets cellemembran og derved spille en antibakteriel rolle. Derudover spiller BPIFA1-proteinet en immunmodulerende rolle ved at aktivere Toll-like receptor (TLR) 4- og TLR2-veje, fremme inflammatoriske responser, apoptose og immuncelleaktivering.

Forholdet mellem BPIFA1-protein og luftvejssygdomme er også blevet grundigt undersøgt. For eksempel har undersøgelser vist, at ekspressionsniveauet af BPIFA1-protein i luftvejssygdomme som bronkial astma og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) er tæt forbundet med sygdommens sværhedsgrad. Især under infektionsforhold kan ekspressionsniveauet af BPIFA1-protein øges betydeligt, og dermed deltage i reguleringen af ​​respiratorisk immunrespons og florabalance.

Derfor kan BPIFA1-proteinets rolle i immunsystemet ikke ignoreres, og dets forhold til luftvejssygdomme og infektioner kræver yderligere dybdegående undersøgelse. Derfor skal vi være særligt opmærksomme på at forbedre vores immunitet. Cistanche har en betydelig effekt på at forbedre immuniteten. Polysacchariderne i kødet kan regulere immunresponsen i det menneskelige immunsystem, forbedre immuncellernes stressevne og styrke immuncellerne. bakteriedræbende effekt.

Klik for at kende cistanche hele fødevarer

Vi udførte sandsynlighedstest, der sammenlignede forskellige modeller baseret på dN/dS-forhold for at genkende specifikke kodoner under positivt selektionstryk. Vi identificerede positivt udvalgte steder i LBP-BPI-domænet af BPIFA1-proteiner i pattedyrsgenomet, herunder et lipidbindende domæne med en meget høj grad af selektivitet for DPPC. BPIFA1 aktiverer de øvre luftvejes medfødte immunsystem som reaktion på adskillige genetiske signaler i pattedyrets genom. Disse resultater fremhæver evolutionære fremskridt inden for immunregulerende virkninger, der spiller en væsentlig rolle i pattedyrarters antibakterielle og antivirale forsvar.

Nøgleord:

BPIFA1; bakteriedræbende; immunsystem; molekylær evolution; positiv udvælgelse.

1. Introduktion

Baktericidt permeabilitetsforøgende protein (BPI) er et yderst effektivt antimikrobielt protein, der binder og neutraliserer lipopolysaccharider frigivet fra den ydre membran af bakterier [1]. Det BPI fold-holdige familie A medlem 1 (BPIFA1) gen er kendt for at have effekter på det lokale immunsystem, og disse effekter kan potentielt påvirke væksten og invasionen af ​​mikroorganismer [2]. En af de potentielle mekanismer, der ligger til grund for denne forbindelse, er BPIFA1's evne til at forbedre absorptionen af ​​bakterier af fagocytiske celler og deres evne til at ødelægge dem [3].

Selvom de har minimal sekvenslighed, har BPI to domæner, der vedtager den samme strukturelle fold [1,4]. Invaderende gramnegative bakterier resulterer i et integreret værtsrespons lettet af tilstedeværelsen af ​​et lipopolysaccharid-bindende protein (LBP). LBP er et endotoksinbindende protein tæt forbundet med og koordineret med BPI [5]. BPIFA1 kontrollerer slimhindernes mikrobiota og baseline interferon-signalering. SPLUNC1 (tidligere kendt som BPIFA1) er et proteinfold-holdigt familiemedlem med antibakterielle, overfladeaktive og immunmodulerende aktiviteter, som alle bidrager til værtsbeskyttelse. Åndedrætssystemet er det primære sted for dets udtryk [6]. SPLUNC1, den humane homolog af musegenet PLUNC, udviser det samme ekspressionsmønster i de øvre luftveje og nasopharyngeale områder som dets musehomolog. Antibakteriel virkning mod Gram-negative bakterier vises af det kodede antimikrobielle protein [5]. I ikke-småcellet lungekræft kan det tjene som en potentiel molekylær markør til lokalisering af mikrometastase. Multiple transkriptvarianter er blevet opdaget som et resultat af den alternative splejsning af den 3' utranslaterede region; dog forstås kun tre af disse transkriptvarianters fuldlængde karakter [7].

Både mus og mennesker har signifikante niveauer af BPIFA1-genekspression i den øvre del af luftrøret, men dette udtryk aftager med afstanden fra luftrøret, når et minimum ved bifurkationen af ​​hovedstammens bronkier og bliver uopdagelig i lungernes periferi. [8]. Omfattende genekspressionsundersøgelser i mus og mennesker har ikke kunnet påvise BPIFA1 i perifert lungevæv [9]. Bortset fra meget lave niveauer af BPIFA1-mRNA-ekspression i muse-thymus, rottehjerte og olfaktoriske slimhinder, udtrykkes BPIFA1 ikke i nogen organer eller væv uden for gnaveres respiratoriske system [10]. Der er ingen indikation af, at BPIFA1 mRNA er til stede i nogen af ​​følgende menneskelige væv: hjerte, lever, hjerne, mave, tyndtarm, placenta, skeletmuskulatur, bugspytkirtel, milt, normale lymfeknuder, perifere lymfocytter, prostata, testikler eller æggestok [11].

Ekspressionen af ​​BPIFA1 mRNA følger et distributionsmønster, der er meget sammenligneligt i embryonale og voksne væv. Dette mønster er observeret i begge typer væv [1]. BPIFA1-overekspression i transgene mus producerede alveolære makrofager med forbedret opsonisering og fagocytose af kulstofnanorør i en model for kontrolleret luftvejsinflammation [12]. Derudover blev kommensale gramnegative nanobakterier vist at co-lokalisere med BPIFA1 i epitelcellerne i nasopharyngeal cancervæv [13]. Prøverne blev taget fra patienter, der tidligere var blevet identificeret som havende nasopharyngeal carcinom. Resultaterne af en nylig undersøgelse antydede, at interaktioner mellem BPIFA1 og ikke-bakteriel LPS kan afbøde kroppens inflammatoriske respons forårsaget af ikke-bakteriel LPS. [1].

Omfanget af dets antibakterielle virkninger og bevarelsen af ​​dets struktur i luftåndende hvirveldyr antyder, at BPIFA1 har udviklet sig til at give væsentlig værtsbeskyttende kapacitet [14]. Men på grund af dets placering i de proksimale luftveje og dets høje niveau under basale forhold, kan BPIFA1 være uundværlig. Dette skyldes, at antimikrobielle effektorer er rigelige i dyr [15]. Som følge heraf synes BPIFA1 at have de mest signifikante virkninger med hensyn til at undgå infektion og rydde op inden invasionen af ​​patogener. Bakterielle infektioner i luftvejene kan forebygges takket være disse funktioner, som kan signalere aktivering af immunitet og forbedret regulering af andre luftvejsfunktioner [15].

Adaptive ændringer som reaktion på miljøkrav menes at være begrænset af biofysiske faktorer, men de strukturelle aspekter af steder, der indeholder adaptive ændringer, kan ikke forudsiges af nogen evolutionsteori [16]. Dette skyldes, at biofysiske begrænsninger begrænser de typer substitutioner, der er tilladt for at opretholde proteinfunktionen [17]. Positiv selektion kan være mere udbredt i dele af proteiner, hvor mutationer forventes at have en lavere effekt end i andre dele af proteinet, selvom dette ikke er blevet bevist (f.eks. allosteriske reguleringssteder) [18]. Imidlertid forventes funktionelle regioner at forblive væsentligt bevarede under evolutionen, selvom adaptive ændringer er forbundet med den hurtige fiksering af gunstige mutationer [19]. Den molekylære udvikling af proteinsekvenser er væsentligt påvirket af processen med naturlig selektion.

Den seneste udvikling inden for genomsekventering og pålidelige inferensmetoder på fylogenetiske og populationsniveauer har gjort det muligt at foretage en hurtig og robust vurdering af de evolutionære hastigheder og tilpasninger, der er drevet af naturlig selektion [20]. På både det fylogenetiske niveau og på populationsniveau er der blevet udført en betydelig mængde arbejde for at opbygge inferensmetoder. Desuden har den stigende tilgængelighed af proteinstrukturelle og funktionelle data gjort det muligt for forskere at undersøge virkningen af ​​strukturelle og funktionelle begrænsninger på udviklingen og tilpasningen af ​​proteinsekvenser [16]. På grund af de grænser, der pålægges af deres strukturer og deres funktioner, er udviklings- og tilpasningshastighederne forskellige for forskellige proteiner og steder inden for det samme protein [19].

Hovedparten af ​​en celles funktioner er indviklet sammenflettet med de regulerende netværk af genekspression, der gør det muligt for organismer at tolerere højere infektionsniveauer eller afbøde virkningerne af disse infektioner [21]. De fleste af komponenterne, der udgør cellulær fysiologi, er tæt relateret til disse genekspressionsregulerende systemer, som ofte er gamle evolutionære tilpasninger [22]. Disse mekanismer har tiltrukket en betydelig grad af interesse for forskning, der har brugt et begrænset sæt af modelarter, for hvilke genetisk information er tilgængelig [23]. Der er dog lidt kendt om de mekanismer, der førte til udviklingen af ​​disse systemer, eller hvordan de tilpassede sig forskellige miljøforhold, efterhånden som udviklingen skred frem.

Denne undersøgelse har til formål at undersøge den evolutionære oprindelse af BPIFA1-genet for at afsløre dets fysisk-kemiske egenskaber og anvende sammenlignende genomik til at give en vurdering af genet i forskellige pattedyrarter. Vi gennemførte dybdegående sammenlignende undersøgelser af det bakteriedræbende/permeabilitetsøgende protein (BPIFA1) gen, som regulerer det medfødte immunrespons hos pattedyr, for bedre at forstå, hvordan disse gener fungerer. Der er en mulighed for, at selektivt pres vil have en betydelig effekt på udviklingen af ​​tilpasning. I denne undersøgelse undersøger vi historien om disse gener i forskellige hvirveldyrarter, samt hvordan genetisk diversitet og naturlig selektion har påvirket udviklingen af ​​denne genfamilie over tid.

2. Materialer og metoder

2.1. Sekvenssøgning og analyse

Aminosyre- og kodende nukleotidsekvenser af BPIFA1-genet i 34 pattedyrarter, inklusive mennesker som referencearten i denne undersøgelse, blev indsamlet fra GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank, tilgængelig den 20. september 2021), og de blev justeret ved hjælp af Clustal Omega-værktøjet i MEGA 6-softwaren [24]. Den maksimale sandsynlighed metode blev brugt i MEGA 6 software til at generere det fylogenetiske træ for BPIFA1 genet. Dette træ blev konstrueret baseret på de evolutionære forhold mellem generne. Bootstrap-testen beregnede det gennemsnitlige antal substitutioner pr. sted og den gennemsnitlige grenlængde ved at anvende en metode med maksimal sandsynlighed med 1000 gentagelser for at bestemme taksonomisk klyngedannelse. Denne metode blev brugt til at vælge en topologi for mere avancerede log-sandsynlighedsværdier [25,26]. Artsnavnene og accessionsnumrene, der bruges til at studere BPIFA1-genet, er angivet i supplerende tabel S1.

2.2. Udvælgelsesanalyse

Maksimal sandsynlighed tilgange blev brugt til at sammenligne forholdet mellem dN/dS for hvert kodonsted for at identificere specifikke kodoner i pattedyr BPIFA1 gensekvenser udsat for positiv selektion [27,28]. CODEML udført i PAML [29] og DATA MONKEY-webserveren (https://www.datamonkey.org, tilgået den 29. september 2021) [30] blev brugt til analysen, og resultaterne blev udpeget ved hjælp af substitutionsforhold for kodoner, der var betydeligt højere end 1 for kodoner under positiv selektion. Det indledende trin i denne forskning var at bestemme, om der fandt positiv udvælgelse sted eller ej ved hjælp af testen med maksimal sandsynlighedsforhold.

Denne analyse bestemte tilstedeværelsen af ​​steder med et dN/dS-forhold større end én. I denne undersøgelse sammenlignede vi en diskret (generisk) model, der udførte denne funktion, med en nul-model, der forbød forekomsten af ​​steder med en værdi større end 1 [31]. Analyser blev sammenlignet ved hjælp af en sandsynlighedslog (2∆l) fordeling med df=4. Nulhypotesen (M7) hævdede, at fordelingen var afgrænset af værdierne 0 og 1. En alternativ model (M8) med to parametre, omega (ω) og beta ( ), giver mulighed for at udlede en værdi fra datasættet, som kan være større end 1 [27]. Analyser ved hjælp af fixed effect likelihood (FEL), single likelihood ancestor counting (SLAC) og random effect likelihood (REL) viste alle, at BPIFA1-genet var genstand for positiv selektion, når globale værdier for synonyme og ikke-synonyme divergenser på hvert sted blev sammenlignet [32].

Det andet trin var at bruge det maksimale sandsynlighedsestimat til at lokalisere aminosyrepositioner, der var genstand for positiv selektion gennem hele evolutionen. Bayes-sætningen, som forudsiger de posteriore sandsynligheder for de steder, der er genstand for positiv selektion, blev brugt til at opnå dette mål. Positiv selektion blev observeret opererende på aminosyrelokationer med posteriore sandsynligheder varierende fra 95 procent til 99 procent [33]. Aminosyrerester med stor sandsynlighed for, at værdien var større end én, blev underkastet en selektiv procedure. Den schweiziske model og Phyre 2 (http://www. sbg.bio.ic.ec.k/pyre/html, tilgængelig den 28. september 2021) er webbaserede applikationer, der viser placeringen af ​​gunstigt udvalgte aminosyrer på proteinstrukturer [34].

Vi forudsagde placeringen af ​​evolutionær konservering af nukleinsyrer og aminosyrer i proteinet ved hjælp af ConSurf-værktøjet (http://consurftest.tau.ac.il, tilgængelig den 28. september 2021), som var baseret på det fylogenetiske forhold mellem sekvenser [ 35]. Sekvensen af ​​det justerede kodon af BPIFA1 blev undersøgt i Selecton version 2.2 (http://secton.tau.ac.il, tilgængelig den 28. september 2021), som tillader bestemmelse af de varierede forhold mellem forskellige kodoner inde i de justerede sekvenser. Disse forhold blev målt ved hjælp af den Bayesianske inferenstilgang gennem forskellige sandsynlighedstest. Dette blev udført for at bekræfte positivt udvalgte kodoner [36]. Desuden blev udvælgelsesresultaterne vist i forskellige farver for at angive de forskellige udvælgelseskriterier.

2.3. Rekombinationsanalyse

For at finde bevis for rekombination udførte vi en modeludvælgelsesprocedure baseret på den statistiske sandsynlighed, der kan gennemsøge mange sekvensjusteringer på jagt efter brudpunkter og spot sandsynligt rekombinant DNA. Denne teknik brugte en genetisk algoritme til at søge i justeringerne af flere sekvenser for rekombinationsbrudpunkter for at nå sit mål. GARD-tilgangen er let at forstå, let at udvide og meget paralleliserbar. Omfattende simuleringseksperimenter har vist, at metoden slår andre nuværende værktøjer i næsten alle tilfælde, især hvad angår nøjagtighed.

For at undersøge beviserne for rekombination blev nukleotidsekvenserne først vurderet til at identificere haplotyper (Na) og estimere de polymorfe steder (S), det gennemsnitlige antal nukleotidforskelle (K) og nukleotiddiversitet (π) ved hjælp af DnaSP 5.10-software [37 ]. Påvisning af brudpunkter og vurdering af rekombinante signaler i nukleotidsekvenser blev udført ved hjælp af online GARD-værktøjet fra Datamonkey-webserveren [38]. Derudover sikrer anvendelse af GARD til at screene sekvenser for rekombination, at metoder fokuseret på at identificere positiv selektion har acceptable statistiske træk.

2.4. Protein-protein interaktionsanalyse

Meget interesse er blevet rettet mod at undersøge, hvordan protein-protein-interaktioner bevares fra en art til en anden. Da der er flere forhindringer i den eksperimentelle identifikation og bekræftelse af interaktomdata, ville det være spændende at forstå en PPI overført fra en art, der er blevet bevist i en anden art [39]. STRING-databanken er en gratis bioinformatikressource, der indeholder information, der beskriver, hvordan proteiner interagerer med hinanden som en del af flere veje. Antallet af linjer, der forbinder hver proteinknude og mellemværdier, bruges til at identificere mellemliggende knudepunkter, der repræsenterer proteiner, der spiller vigtige biologiske roller og er tæt forbundet med hinanden. Netværksoprettelse blev udført ved hjælp af STRING og Cytoscape-software (http://www.cytoscape.org, tilgået den 29. september 2021) blev brugt til at vise netværket [40]. Ved at identificere protein-protein-interaktionerne af BPIFA1 blandt immunproteiner og co-ekspressionsanalyse ved hjælp af STRING version 9.1 (http://www.string-db.org, adgang til den 29. september 2021), var vi i stand til yderligere at bestemme, hvordan BPIFA1 fungerer på molekylært niveau.

2.5. Strukturel analyse af BPIFA1-protein

I denne analyse byggede vi krystalstrukturen af ​​det humane BPIFA1-protein ved hjælp af homologimodellering med onlineværktøjer, såsom den schweiziske model (http://swissmodel.expasy.org, tilgængelig den 29. september 2021) [41], I-TESSAR [42] og Phyre2 (http://www.sbg. bio1.ic.ac.uk/phyre2/html, tilgået den 29. september 2021) [43]. Konjugatgradientmetoden og Amber-kraftfelt i UCSF Chimera 1.10.1-software blev brugt til at reducere det samlede målprotein. Derudover blev ProSA-webserveren brugt til at evaluere de stereokemiske egenskaber af den forventede struktur [22].

For more information:1950477648nn@gmail.com