Mitokondriemembranstabilisering ved Angelica Sinensis polysaccharid i murine aplastisk anæmi
Mar 16, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Abstrakt
For at undersøge mekanismen for mitokondriel membranstabilisering ved Angelica Sinensis polysaccharid (ASP) i murine aplastisk anæmi (AA) ICR mus blev tilfældigt opdelt i kontrol. AA- og ASP-behandlede grupper AA-gruppemusene blev behandlet med 60Co Y og intraperitoneale injektioner af cyclophosphamid og chloramphenicol. Kontroldyrene blev behandlet med blyafskærmningsbestråling og saltvandsinjektion. De behandlede AA-mus blev fodret med ASP i 2 uger. Mitokondriel ultrastruktur af knoglemarven blev observeret ved transmissionselektronmikroskopi, og transmembranpotentialet i knoglemarvsnukleerede celler (BMNC) blev undersøgt ved fluorescensspektrofotometri. Cox- og MDH-indholdet af mediet blev også undersøgt i de tre grupper, Mitokondrietallet og transmembranpotentialet for BMNC i knoglemarven faldt i AA-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen, men blev forbedret i den ASP-behandlede gruppe sammenlignet med AA-gruppen. Fuldstændig mitokondriel spaltning i den ASP-behandlede gruppe blev signifikant forsinket (P< 0.05)="" as="" compared="" to="" the="" aa="" group.="" we="" conclude="" that="" asp="" might="" improve="" mitochondrial="" membrane="" stabilization,="" and="" suppress="" the="" downregulation="" of="" transmembrane="" potential="" and="" apoptosis="" of="" bmnc="" in="">
Nøgleord: aplastisk anæmi, Angelica Sinensis polysaccharid, mitokondrier, membranpotentiale, ICR-mus
cistanche ekstrakt: øger knogledannelsen og øger knogletætheden
Baggrund
Aplastisk anæmi (AA) er en blodsygdom, hvor knoglemarven og de tilhørende blodstamceller er beskadiget, hvilket forårsager mangel på røde blodlegemer, hvide blodlegemer og blodplader. Disse mangler er individuelt kendt som henholdsvis anæmi, leukopeni og trombocytopeni og kollektivt kendt som pancytopeni. Eksponering for kemikalier, stoffer, stråling, radioaktive materialer, strålingsproducerende enheder, infektion. immunsygdom, arvelighed(i 50% af tilfældene) og ukendt ætiologi kan også føre til udvikling af AA.
Mitokondrier anses for at være "cellens kraftværker", fordi de producerer adenosintrifosfat (ATP) ved systematisk at udvinde energi fra næringsstofmolekyler (substrater)[1]. Desuden replikeres mtDNA med en høj mutationshastighed, da det mangler beskyttende histoner og et effektivt DNA-reparationssystem. Mutationer i mtDNA er forbundet med hæmatologiske sygdomme såsom erhvervet sideroblastisk anæmi, myelodysplastiske syndromer og erhvervet AA [2-4]. Vores tidligere undersøgelse 5] viste, at funktionsnedsættelse af den mitokondrielle respiratoriske kæde induceret af mutationer kan være involveret i hæmatopoietisk svigt hos AA-patienter. Uanset de morfologiske træk ved celledød i slutstadiet (apoptotisk, nekrotisk, autofagisk eller mitotisk) er mitokondriemembranpermeabilisering (MMP) ofte den afgørende begivenhed mellem overlevelse og død [6]
Ifølge traditionel kinesisk medicin hjælper Angelica Sinensis med at forene blodet og fremme dets cirkulation [7]. Nylige undersøgelser har vist, at ekstrakter af Angelica Sinensis har antioxidative og neuroprotektive virkninger [8,9]. Imidlertid forbliver den antioxidative funktion af ASP uklar. Denne undersøgelse undersøgte den tidlige celleskade ved hjælp af mitokondrielysetidskurven og den mitokondrielle membranstabiliserende virkning af ASP i AA.
cistanche supplement øge knogletætheden og øger knogledannelsen
Materialer og metoder
Gruppering af dyr
Sunde ICR-hanmus, der vejer 18-22 g, i alderen 6-8 uger, blev leveret af Experimental Animal Center ved Shandong University (Kina). Dyrene blev ophuset i et varmt, roligt miljø med fri adgang til mad og vand. og akklimatiseret i en uge, før eksperimenterne påbegyndes.
Musene blev tilfældigt opdelt i tre grupper: henholdsvis normal gruppe, AA-gruppe og behandlet gruppe. Den aplastiske anæmimodel blev genereret som tidligere beskrevet [10].
Kortvarigt blev musene bestrålet med 2,0Gy 60Coy og derefter behandlet med daglige intraperitoneale injektioner på 40 mg/kg/dag cyclophosphamid og 50 mg/kg/dag chloramphenicol i de næste tre dage. Den behandlede gruppe blev intragastrisk fodret med ASP (200 mg / kg / d, ifølge Chinese Medical Dictionary). Kontrolgruppen og AA-gruppens mus blev intragastrisk fodret med fysiologisk saltvand (10 ml/kg/d)suppleret kost. Desuden fik alle mus en standardkost under undersøgelsen. Efter behandling med ASP eller fysiologisk saltvand i 2 uger blev musene ofret ved cervikal dislokation.
Hæmatologisk undersøgelse
Haleblodprøverne fra de tre grupper blev indsamlet på henholdsvis den første og fjortende dag. WBC og blodplader blev talt i de perifere blodprøver, og Hb-niveauer blev bestemt. Efter afslutningen af forsøgene blev musene ofret, og lårbensudstrygninger blev forberedt til differentiel optælling af knoglemarvsnukleerede celler (BMNC'er) (figur 1).
Transmission elektronmikroskopi
Lårbensmarven blev smurt og skåret i ultratynde sektioner. Mitokondrier af hæmatopoietiske celler i lårbensmarven blev analyseret og talt ved transmissionselektronmikroskopi (JEM-2000EX, Japan) under 50 synsfelter.
Mitokondriel lysis tidskurve
Mitokondrier blev ekstraheret fra murine BMNC'er i henhold til producentens protokol for mitokondrier isolationssættet (Pierce Biotechnology Inc., USA). Koncentrationen af monoaminoxidase(MAO) angiver koncentrationen af mitokondrier og blev bestemt ved anvendelse af 200U/ml mitokondriesuspensioner fra 20 serumkulturer inden for 12 timer på forskellige tidspunkter (30 minutters intervaller). Indholdet af cytokromoxidase (Cox) og malatdehydrogenase (MDH) i mediet blev også bestemt. Spidsbelastningsanalysen af mitokondriemembranen og matrixspecifikke enzymkoncentrationstidskurver viste omfanget af mitokondriemembranlyse.
Mitokondriemembran potentiale
Efter præinkubation med MAO eller ASP blev de isolerede mitokondrier fra de tre grupper resuspenderet i 0,5 ml fosfatbufret saltvand (Wuhan Boster Biotechnology, Ltd., Kina), og 10 μl rhodamin 123 arbejdsløsning (Sigma-Aldrich, USA) blev tilsat og inkuberet ved 37 ° CC i 5% CO2 i 15 minutter. Mitokondriemembranpotentialet blev analyseret ved flowcytometri ved anvendelse af en excitationsbølgelængde på 490 nm og en emissionsbølgelængde på 520 nm.
Statistisk analyse
Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS 19.0-software. Data udtrykkes som midler og standardafvigelser. Elevens t-test blev brugt til at sammenligne de forskellige grupper. P< 0.05="" was="" considered="" to="" be="" statistically="">
cistanche urt: for bedre knoglekvalitet
Resultater
Perifert blod og BMC tæller
Ved hjælp af en fuldautomatisk blodcelleanalysator viste det sig, at antallet af perifere blodlegemer og BMC'er i AA-musene var markant nedsat(P<0.05), indicating="" that="" the="" aa="" mouse="" model="" was="" successfully="" established="" (table="">
Mitokondriel ultrastruktur i aplastiske anæmimus
Transmissionselektronmikroskopi af knoglemarven hos AA-mus viste, at den mitokondrielle ultrastruktur signifikant forbedret med ASP i den behandlede gruppe (tabel 2 og figur 1), hvilket indikerer, at ASP stabiliserer mitokondrierne i AA-mus. Størrelsen og formen af mitokondrier i kontrolgruppen var normal. Derimod. mitokondrierne i AA-gruppen havde forstørrede kugleformede strukturer sammen med forstyrrelse eller forsvinden af cristae (figur 1A-C).
Mitokondriemembranpotentiale (MMP) i aplastiske anæmimus
Da transmissionselektronmikroskopi afslørede mitokondrieskader, bestemte vi effekten af ASP på MMP i AA-mus ved at måle de relative forskelle i fluorescensen af Rh 123 blandt de tre grupper ved hjælp af et fluorescensspektrofotometer.
Resultaterne viste, at Rh 123-fluorescensen af knoglemarvsceller i AA-gruppen(19,6±3,03) var lavere end i kontrolgruppen (31,7±2,59, P<0.0). however,="" the="" rh="" 123="" fluorescence="" of="" the="" asp-treated="" aa="" group="" was="" higher="" than="" that="" in="" the="" aa="" group=""><0.0i)(table 2="" and="" figure="" 2),="" indicating="" that="" asp="" facilitated="" the="" recovery="" of="" the="" mmp="" in="" aa="">
Tidlig celleskade mitokondriel lysis tidskurve
I kontrolgruppen tog indholdet af mitokondriel in vitro-kultur Cox og MDH 3,5 timer at nå toppen. MAO-indholdet i kulturen ændrede sig ikke signifikant over tid, men indholdet af COX og MDH steg gradvist med tiden, nåede et højdepunkt og faldt derefter gradvist. Således tog det komplette mitokondrieindhold, der blev frigivet af celler, ca. 3,5 timer at nå spaltningstoppen.
COX- og MDH-toppene i AA-gruppen optrådte ved henholdsvis 1,5 timer,1,375U/, 36,732U/l. COX- og MDH-toppene i den behandlede gruppe forekom ved henholdsvis 5,5 timer,6,5 timer,1,341U/l,33,994U/. To datasæt på hvert tidspunkt blev brugt til statistisk analyse. Efter 1,5 time var COX- og MDH-niveauerne i AA-gruppen signifikant højere end i den behandlede gruppe (P< 0.05).="" therefore,="" complete="" mitochondrial="" cleavage="" in="" the="" serum="" was="" significantly="" delayed="" after="" the="" addition="" of="" asp="" (p="">< 0.05),="" with="" a="" slight="" decrease="" in="" the="" peak="" (figure="" 3).="">
Diskussion
Aplastisk anæmi (AA) er et knoglemarvssvigtsyndrom karakteriseret ved perifer pancytopeni og marvhypoplasi. Mutationer og ustabilitet af mtDNA er blevet påvist i flere sygdomme. Mitokondriel dysfunktion og et fald i antallet af mitokondrier kan resultere i reduktion af mtDNA, Erhvervede deletioner af mtDNA i det hæmatopoietiske rum har vist sig at forekomme i svær pancytopeni og reticulocytopeni [11]. Baseret på vores tidligere forskning [5] undersøgte vi, om ASP kan stabilisere mitokondriemembranen hos AA-mus.
Angelica Sinensis polysaccharid-jernkompleks (APIC) har ikke kun en overlegen terapeutisk virkning på IDA, men også på at supplere blod og fremme blodcirkulationen [12]. ASP kan være nyttig til behandling af sygdomme induceret af hepcidinoverekspression ved at forhindre Janus-kinase (JAK), søn af mødre mod ekstracellulære decapentaplegiske (SMAD) og 1signalregulerede kinase (ERK) veje til at nedregulere hepcidinekspression hos IDA-rotter [13]. Qin J fandt, at ASP kan forbedre proteoglycan (PG) syntese af chondrocytter i rotte OA model in vivo og IL-1B-stimulerede chondrocytter in vitro ved at fremme ekspressionen af aggrecan og GTs involveret i PG syntese [14].
I vores undersøgelse blev AA-musemodellen induceret af en kombination af acetylphenylhydrazin, røntgenstråler og cyclophosphamid. AA-musene viste statistisk signifikante reduktioner i perifere blodleukocytter, Hb og blodplader (tabel 1) og alvorlige reduktioner i humerale marvceller og marv-engagerede stamceller, som er kliniske egenskaber ved AA. AA-musene behandlet med ASP viste en progressiv stigning i BM-celler sammenlignet med AA-gruppen. Derudover blev antallet af mitokondrier i de hæmatopoietiske celler også påvirket. ASP resulterede i et signifikant højere antal mitokondrier i den behandlede gruppe sammenlignet med AA-gruppen (figur 1). Disse resultater viste, at ASP kunne fremme marvnukleerede cellers proliferation, øge antallet af mitokondrier og stabilisere mitokondriemembranen i AA-mus.
Mitokondrieskade afspejles af mtDNA-skade og et fald i niveauerne af mtRNA-transkripter, proteinsyntese og mitokondriefunktion, hvilket kan resultere i nedsat cellulær energi, forstyrrelse af cellesignalering og interferens med cellulær differentiering og apoptose. Desuden kan mangelfuld mitokondriel ATP-produktion fremme kromosomal ustabilitet[15]. Da mtDNA koder for komponenter i fire ud af fem mitokondrielle respiratoriske komplekser, resulterer ændringer i mtDNA i mitokondriel sygdom [16-18]. Bortset fra mitokondriel sygdom er mutationer i mtDNA forbundet med kræft, diabetes. hjerte-kar-sygdomme. neurodegenerative lidelser, hæmatologiske sygdomme såsom leukæmi samt den normale aldringsproces [19]. Det er vigtigt, at mtDNA-mutationer såvel som en reduktion i mtDNA-kopinummeret kan være patogene [20, 21]. Forståelse af cellulære mekanismer til opretholdelse af mtDNA-integritet og kopinummer er af største betydning, da det kan give mål for kliniske interventioner rettet mod forebyggelse og behandling af hæmatologiske sygdomme såsom AA. Disse faktorer kan også resultere i nedsat energimetabolisme, hvilket vil påvirke selvfornyelsen og differentieringen af de hæmatopoietiske stamceller.
Resultaterne af denne undersøgelse viser, at ASP kan forbedre mitokondrie-ultrastrukturen og undertrykke nedreguleringen af transmembranpotentiale og apoptose af myeloide elementer for at helbrede knoglemarvssvigt.
Cistanche & cistanche ekstrakt:bebefit knogler
Referencer
1 Chinnery PF, Schon EA. J Neurol Neurosurg Psykiatri 2003, 74: 1188-1199.
2. Gattermann N. Mitokondrielle DNA-mutationer i det hæmatopoietiske system. Leukæmi 2004,18:18-22.
3. Gattermann N, Retzlaff Sørensen, Wang YL, et al. Heteroplasmatiske punktmutationer af mitokondrie-DNA, der påvirker underenhed I af cytokrom c-oxidase hos to patienter med erhvervet idiopatisk sideroblastisk anæmi. Blod 1997,90:4961-4972.
Kim HR, Shin MG, Kim MJ, et al. Mitokondrie
4 . DNA-aberrationer af knoglemarvsceller fra patienter med aplastisk anæmi. Koreansk Med Sci 2008, 23:1062-1067. X Cui, JO Wang, ZG Cai, et al. Komplet sekvens
5. analyse af mitokondrie-DNA og telomerlængde i aplastisk anæmi. Int Jørgensen Mol Med 2014.34:1309-1314.
Tanshinone IA inducerer apoptose i humane lungekræft A549-celler gennem induktion af reaktive iltarter og mindsker mitokondriemembranpotentialet. Int Jørgensen Mol Med 2010,25:231-236.
7. Liu PJ. Huang SH, et al. Hæmatopoietisk virkning af vandopløselige polysaccharider fra Angelica Sinensis på mus med akut blodtab. Exp Hematol 2010, 38: 437-445.
8. Kuang X, Yao Y, Du JR, et al. Neuroprotektiv rolle 8F af Z-ligustilid mod iskæmisk skade på forhjernen hos ICR-mus. Brain Res 2006,1102:145-153.
9. Xin J.Zhang J. Yang Y, et al. Radi Angelica Sinensis, der indeholder komponenten Z-ligustilide, fremmer voksen neurogenese for at formidle genopretning fra kognitiv svækkelse Curr Neurovasc Res 203, 10: 304-315.
10. Chen YF, Wu ZM, Xie C, et al. Ekspressionsniveau af IL-6 udskilt af knoglemarvsstromale celler hos mus med aplastisk anæmi. ISRN Hæmatol 2013:986219.
11. Hatfill SJ, LaCock CJ, Laubscher Rasmussen, et al. Arole til mitokondrie-DNA i patogenesen af strålingsinduceret myelodysplasi og sekundær leukæmi. Leuk Res 1993,17:907-913.
12. Wang PP, Zhang Y, Dai LQ, et al. Virkning af Angelica Sinensis polysaccharid-jernkompleks på jernmangelanæmi hos rotter. Chin J Integr Med 2007, 13:297-300.
13. Zhang Y, Cheng Y, Wang N, et al. Virkningen af JAK-, SMAD- og ERK-signalveje på hepcidinundertrykkelse af polysaccharider fra Angelica Sinensis hos rotter med jernmangelanæmi. Mad Funct2014.5: 1381-1388.
14. Qin Jørgensen, Liu YS, Liu Jørgensen, et al. Virkning af Angelica Sinensis polysaccharider på slidgigt in vivo og in vitro: en mulig mekanisme til fremme af proteoglycansyntese. Evid-baseret komplement Alternat Med 2013,79476.
15. Gattermann N. Mitokondrielle DNA-mutationer i det hæmatopoietiske system. Leukæmi 2004,18:18-22.
16. Holt IJ, Harding AE, Morgan-Hughes JA. Sletninger af muskelmitokondrie-DNA hos patienter med mitokondrie-myopatier. Naturen 1988, 331:717-719.
17. Lestienne P, Ponsot G Kearns-Sayre syndrom med muskelmitokondriel DNA-deletion. Lancet 1988, 1:885.
18. Wallace DC, Singh G, Lott MT, et al. Mitokondriel DNA-mutation forbundet med Lebers arvelige optiske neuropati. Videnskab 1988,242:1427-1430.
19. Wallace DC.Et mitokondrielt paradigme for metaboliske og degenerative sygdomme, aldring og kræft: en daggry for evolutionær medicin. Annu Rev Genet 2005, 39: 359-407.
20. Clay Montier LL, Deng JJ, Bai Y. Antal betyder noget: kontrol af pattedyrs mitokondrielle DNA-kopinummer. J Genet Genomics 2009,36:125-131.
21. Rötig A, Poulton J. Genetiske årsager til mitokondriel DNA-udtømning hos mennesker. Biochim Biophys Acta 2009,1792:1103-1108.
cistanche ekstrakt:øger knogledannelsen og øger knogletætheden
