Metabolitprofilering og anti-aldringsaktivitet af ris Koji fermenteret med Aspergillus Oryzae og Aspergillus Cristatus: En sammenlignende undersøgelse

Abstrakt:Riskoji, der bruges som starter for at maksimere fermenteringsfordele, producerer alsidige slutprodukter afhængigt af de anvendte inokulummikrober. Her udførte vi metabolitprofilering tilsammenligne riskojifermenteret med to vigtige trådsvampe,Aspergillus oryzaeogA. cristatus, i 8 dage. De multivariate analyser viste distinkte mønstre af primære og sekundære metabolitter i de tokoji. Riskojien gæret medA. oryzae(RAO) vistesteget -glucosidaseaktivitet og højere indhold af sukkerderivater end den, der fermenteres medA. cristatus (RAC). RAC visteforbedret -glucosidase aktivitet og øget indhold af flavonoider oglysophospholipidersammenlignet med RAO. Samlet set i det sidste gæringsstadium (8 dage),antioxidantaktiviteter og anti-aldringseffektervar højere i RAC end i RAO, svarende til the stegetmetabolittersåsomflavonoiderog auroglaucinderivater i RAC. Denne sammenlignende metabolomisketilgang kan anvendes iproduktionsoptimeringog kvalitetskontrol analyser afkojiProdukter.

Nøgleord: ris koji; mikrobe; fermentering i fast tilstand;anti-aging effekt; antioxidant aktivitet

Klik her for at få flere oplysninger om Cistanche Anti-aging Effect

1. Introduktion

Fermentering, som har en historie på tusinder af år, bliver i stigende grad anerkendt som en metode til at forbedre ernæringen og bioaktiviteterne af fødevarer, ud over at forarbejde og konservere dem [1]. Rice koji er lavet ved fast-state fermentering ved hjælp af dampede riskorn podet med mikroorganismer til at udskille enzymer og producere gavnlige metabolitter. I de senere år har forskellige forsøg på at skabe sarte fermenteringsforhold ført til avanceret fermenteringseffektivitet og bedre madsmag [2,3]. På grund af dets fordele finder ris koji anvendelser i industrielle områder såsom fermenterede fødevarer og drikkevarer og kosmetik [4-6].

Reaktive oxygenarter(ROS) genereres under betingelser of oxidativ stressog er biprodukter af aerob metabolisme. Dissefrie radikalerkan inducere nedbrydning af biomolekyler, hvilket resulterer i oxidative skader, såsom inflammation og acceleration af hudens aldringsprocessen [7]. For at udvikle en balance mellem ROS-produktion og -eliminering, spiller ROS-rensemidler, kendt som antioxidanter, en vigtig rolle i at lindre oxidativt stress og er hovedsageligt opnået fra naturlige kilder [8]. Disse frie radikaler er involveret i ældningsprocessen, og at fjerne dem gennem indtagelse af antioxidanter fra naturlige kilder er afgørende for at forsinke aldring [9]. I de senere år har mange undersøgelser rapporteret, at riskoji kan forbedre råmaterialernes potentielle antioxidantaktiviteter ved at forbedre fermenteringssubstratet [10,11].

Hudens ekstracellulære matrix (ECM) består af kollagen- og elastinfibre, som fremmer hudens elasticitet til at genoprette og bevare sin oprindelige form og tilstand [12]. Ødelæggelsen af ​​den dermale ECM er en indikator for aldring. Det opstår på grund af opreguleringen af ​​kollagen-nedbrydende matrix metalloproteinase-1 (MMP-1), også kendt som collagenase. Derfor er undersøgelser af forskellige fytokemikalier, der kan bremse hudens ældningsprocessen ved at stimulere kollagen- og elastinsyntesen og hæmme MMP-1, i stigning [13-16]. Seo et al. viste, at fermenteret risklid påvirker hudfibroblastkollagen, inflammatorisk faktor (IL-a) og MMP-1 [17]. Derfor har forskellige forbindelser, der findes i ris, såsom flavonoider og phenolsyrer antioxidantaktivitet, og fermenteret riskoji har potentialet til at forbedre hudens fotoaldring ved UV-stråling [18]. Aspergillus, en fifilamentøs svamp, er en typisk inokulummikrobe til fremstilling af mange gavnlige metabolitter såsom simple sukkerarter, fedtsyrer og aminosyrer fra koji i Asien. Især Aspergillus oryzae er den mest almindelige mikroorganisme, der anvendes i produktionen af ​​koji på grund af dens sikrede sikkerhed og forskellige enzymer, såsom amylase, protease og peptidase [19].

Aspergillus cristatus bruges i tefermentering, såsom Fuzhuan mursten te, som har probiotika og beskytter mod UVB-induceret fotoældning [20,21]. Det er også blevet rapporteret at forbedre antioxidantaktiviteten af ​​forskellige andre råmaterialer [22,23]. I øjeblikket bliver indsatsen i stigende grad dedikeret til at forbedre kvaliteten af ​​fermenteringsstartere [4,24]. Tidligere undersøgelser har vist en sammenlignende metabolisk undersøgelse af Aspergillus og Bacillus, der er meget brugt i riskoji [25]. Der er dog en mangel på information om de metabolomiske forskelle mellem de samme slægter, men forskellige svampearter. For at udvælge optimale mikrober, der kan introduceres på markedet for sundhed med nutraceutiske og kosmetiske applikationer, er der behov for en omfattende forståelse af metabolismen af ​​forskellige inokulummikrober ved at sammenligne deres bioaktivitet og metabolitter.

I denne undersøgelse profilerede vi metabolitterne af ris koji gæret med forskellige Aspergillus spp. (A. cristatus og A. oryzae) med hensyn til metabolomik for at sammenligne metabolismen af ​​de to fifilamentøse svampe. Vi målte også enzymaktivitet, antioxidantaktivitet og RNA-ekspression af hudanti-aldringsfaktorer (kollagen, elastin og MMP-1) for at sammenligne de to koji. Desuden udførte vi korrelationsanalyse for at foreslå potentielle kandidatmetabolitter, der bidrager til antioxidantaktivitet og hudanti-aldringseffekter. En omfattende analyse af MS-baseret metabolitprofilering til sammenligning af de to koji-podestoffer etablerede et forhold mellem enzymaktiviteter, metabolomer og bioaktiviteter. Her præsenterer vi en plan for den overordnede metaboliske tilstand, korreleret med bioaktiviteterne af de to forskellige koji-podestoffer.

2. Resultater

2.1. Metabolisk profilering for ris Koji fermenteret med forskellige Aspergillus spp.

Forskellige metabolomer af ris koji-prøver inokuleret med A. cristatus eller A. oryzae blev sammenlignet ved hjælp af multivariat analyse i henhold til GC–MS og LC–MS datasæt. Hovedkomponentanalysen (PCA) scoreplot opnået fra UHPLC–LTQ–Orbitrap MS/MS og GC–TOF–MS afslørede en total varians på 40,9 procent (PC1, 22,01 procent; PC2, 18,89 procent) og 52,88 procent (PC1, henholdsvis 34,70 procent, PC2, 18,18 procent (figur 1A,B). Begge PCA-resultater indikerede, at startpunktet for fermenteringen var samlet, men derfor adskilt fra forskellige podningssvampe i henhold til forskellige fermenteringstider. Partiel mindste kvadraters diskriminantanalyse (PLS-DA) belyste statistiske mønstre samme som metabolitfordelingen i PCA (Supplerende figur S1A,B).

Som vist i PCA opnået fra UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS-analyserne (figur 1A), er der signifikante forskelle på den ottende dag, og begge otte-dages prøver blev udsat for en ortogonal partiel mindst kvadratisk diskriminant-analyse (OPLS) -DA), som viste en klar adskillelse af OPLS-komponent 1, der tegner sig for 86.11 procent af variansen i data (Supplerende figur S1C). De 31 metabolitter blev udvalgt fra UHPLC–LTQ–Orbitrap–MS/MS-data, som anses for at være en væsentlig bidragyder til uoverensstemmelsen i ottendedags riskojis fermenteret med to forskellige inokulummikrober baseret på deres variable betydning i projektionsværdier (VIP > 1) .{{10}}) og p-værdier (p < 0,05) fra OPLS-DA-analyse (Supplerende tabel S1). Disse metabolitter omfattede 2 carboxylsyrer, 5 phenolsyrer, 7 flavonoider, 2 langkædede fedtsyrer, 11 lysophospholipider og anc4 hydroquinoner. Metabolitterne blev foreløbigt identificeret ved at sammenligne publiceret litteratur (molekylvægt, molekylformel, retentionstid, massefragmentmønstre og UV-absorbanser) og data fra et internt bibliotek.

Figur 1. Principal komponent analyse (PCA) score plot fra (A) UHPLC-LTO-Orbitrap-MS/MS og (B) GC-TOF-MS datasæt af ris koi fermenteret med Aspergillus cristatus eller A. oryzne.(udfyldte symboler , A. cristatus; uudfyldte symboler, A. oryzne, O, 0 dag; , , 2 dage; V, V, 4 dage; 6 dage; , 8 dage).

2.1.1. Temporale metabolomer for ris Koji med forskellige Aspergillus spp. Podning i henhold til gæringstid

De metaboliske veje for riskoji afhængig af forskellige podningsmikrober blev repræsenteret af et varmekort for at visualisere metabolitændringsmønstre i overensstemmelse med fermenteringstider (figur 2). Farven på en blå-til-rød gradient repræsenterer den gennemsnitlige normaliserede relative overflod af hver metabolit under hver eksperimentel tilstand. Tendenserne for de fleste metabolitter i riskoji fermenteret med A. cristatus (RAC) og A. oryzaeRAO) viste et gradvist stigende mønster med fermenteringstiden. Metabolitterne forbundet med kulhydratmetabolisme repræsenterede for det meste et stigende mønster bortset fra glucose, xylose, saccharose og maltose, som er sukkerarter. Derudover blev indholdet af phenolsyreflavonoider og hydroquinon forbedret med fermenteringstiden, bortset fra ferulinsyre. Blandt fedtsyrerne viste de fleste metabolitter et stigende mønster, mens pimelinsyre viste et fald. Lysophospholipider præsenterede forskellige mønstre med forskellige fermenteringstider og podningssvampe.

Figur 2. Skema over den metaboliske vej og relative niveauer af metabolitter i riskoji fermenteret med Aspergillus cristatus eller A. oryzae. Vejen blev tilpasset fra Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database og modificeret. De farvede firkanter repræsenterer foldændringerne (blå til rød) normaliseret med gennemsnittet af alle værdier for hver metabolit.

2.1.2. Relativ forskel i niveauet af diskriminerende metabolitter i ris Koji fermenteret af A. cristatus eller A. oryzae

Som vist i figur 2 udviste indholdet af primære og sekundære metabolitter forskellige mønstre i overensstemmelse med forskellige podningssvampe. I tilfælde af glukose, som er centrum for kulhydratmetabolisme, viste mønstrene for A. cristatus koji et fald, hvorimod A. en koji viste faldende mønstre ved det indledende fermenteringspunkt, men steg gradvist indtil det endelige gæringspunkt. Desuden var sukkeralkoholerne højere i RAO end i RAC. Især auroglaucinderivater blev kun forbedret signifikant i RAC, fordi de er en unik pigmentforbindelse produceret af A. cristatus. Derudover var de fleste flavonoider øget signifikant i RAC sammenlignet med RAO, bortset fra 3,8-dimethylherbacetin. Blandt phenolsyrerne var ferulsyre og benzoesyre øget i begge prøver, men dihydroxybenzoesyre, caffeoylquinsyre og vaniljesyre blev kun øget i RAC. Lysophospholipider steg i RAC, men kontrasterende tendens blev observeret i RAO. Fedtsyrer viste større mønstre af øget RAO end i AC

2.2. Sammenligning af enzymatisk produktion og bioaktivitet i ris Koji fermenteret med forskellige mikroorganismer

For at sammenligne fænotyperne af RAC og RAO evaluerede vi enzymaktiviteten og antialdringseffekterne på hudceller, antioxidantaktivitet, totalt flavonoidindhold (TFC) og totalt phenolindhold (IPC) (figur 3). Enzymproduktionen af ​​begge koji steg med fermenteringstiden, bortset fra a-amylase i RAO. Interessant nok var a-glucosidase-indholdet to gange højere i RAO end i RAC med henholdsvis 10.12 og 3.52 enheder; i modsætning hertil var indholdet af B-glucosidase højere i RAC end i RAO med henholdsvis 19.{{20}}5 enheder og 5.49 enheder i overensstemmelse med fermenteringstider. Den funktionelle fænotype af både koji (antioxidantaktivitet og hud-anti-aldringsfaktor) indikerede, at riskoji med A. cristatus havde højere antioxidantaktiviteter i ABTS, DPPH og FRAP ved det endelige fermenteringstidspunkt (8 dage) med 1.{ {24}}5, 0,40, henholdsvis 0,66 TEAC (Trolox-ækvivalent antioxidantkapacitet). Derudover var indholdet af flavonoid højere i RAC end RAO med henholdsvis 0,07 NE (naringin-ækvivalent) og 0,01 NE. Hvorimod indholdet af total phenol var højere i RAO end RAC med henholdsvis 0,32 EGA (ækvivalent gallussyre) og 0,28 EGA. Resultaterne af hudens anti-aldringsfaktorer (elastin, kollagen og MMP-1) indikerede hat ved afslutningen af ​​fermenteringen. ACRNA-ekspressionsniveau med 7,77 og 13,76 og lavere relativ MMP-1 RNA-ekspressionsniveau med 2,35 sammenlignet med B-actin. I mellemtiden viste RAO en gradvis stigning i RNA-ekspression af elastin og kollagen efter fermentering.

Figur 3. Sammenligning af enzymproduktion (A), hud-antaldringsfaktor (B) og antioxidantaktivitet, totalt flavonoidindhold og totalt phenolindhold (IPC) (C) i riskoji fermenteret med forskellige Aspergillus spp. (sort farve, A. cristatus hvid farve, A. oryzne). De enzymatiske aktiviteter er a-amylase-aktivitet, B-glucosidase-aktivitet og a-glucosidase-aktivitet (A). Det relative mRNA-ekspressionsniveau måles for følgende: kollagen (COL1A1), elastin (ELN) og matrixmetalloproteinase-1 (MMP-1) ​​(B). De afbildede antioxidantaktiviteter er ABTS, DPPH radikalopfangning, FRAP, totalt mavonoidindhold og totalt phenolindhold (C). Signifikante forskelle mellem forskellige inokulationsmikrober blev identificeret ved t-test (* p < {{10}}.05, ** p < 0.01).

For at bestemme de metabolitter, der potentielt bidrog til bioaktivitet, blev der udført en korrelationsanalyse mellem fermenterede koji-metabolitter og bioaktiviteter (Supplerende figur S2). Samlet set viste Pearsons korrelationskoefficientkort RAC højere korrelation med bioaktiviteter end RAO. I RAC viste organiske syrer, flavonoider, lysophospholipider, fedtsyrer, hydroquinon, sukkerderivater en høj positiv korrelation med bioaktiviteter. For RAO indikerede organiske syrer, flavonoider og fedtsyrer og sukkerderivater en positiv korrelation med bioaktiviteter. De metabolitter, der havde en Pearson-korrelationskoefficientværdi højere end 0.5, er repræsenteret i et netværkskort (figur 4) I begge koji-produkterne var organiske syrer, fedtsyrer, flavonoider og sukkerderivater potentielle bidragydere til bioaktiviteter . RNA-ekspression af elastin var forbundet med metabolitter af RAC, hvorimod RNA-ekspression af kollagen var forbundet med metabolitter af RAO. Derudover viste TFC en korrelation med RAC. Ydermere var lysophospholipider og hydroquinon stærke bidragydere til antioxidantaktivitet til RAC

Figur 4, De metabolitter, der har en Pearsons korrelationskoefficientværdi højere end 0.5, er repræsenteret af et netværkskort i ris koji gæret med (A) Aspergillus cristatus eller (B) A. oryzne. Bokssymbolerne repræsenterer bioaktiviteter (grå farve, antioxidantaktivitet TPC og TFC; sort farve, hudanti-ældningseffekt på celle), og de farvede symboler angiver metabolitterne (samme serie blev kendetegnet ved forskellig farve og form: o, hydroquinon: , organisk syrer: , fedtsyrer, flavonoider;, lysophospholipider; o, sukker og sukkerderivater; ukendt).

Spørg for mere:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950