En sammenlignende undersøgelse af anti-aldringsegenskaber og mekanismer: Resveratrol og kaloriebegrænsning

ABSTRAKT

Resveratrol og kaloriebegrænsning (CR) er kraftfulde terapeutiske muligheder foranti aldring. Her deres sammenlignende effekt pålevetidsassocieret gensilencing information regulator (SIRT1) blev evalueret in vitro og in vivo. IMR-90-celler behandlet med 2,2'-azobis (2-amidinopropan) dihydrochlorid (AAPH) blev anvendt til at etablere en cellulær alderdomsmodel, og rotter behandlet med D-galactose (D-gal) blev brugt som enaldrende dyremodel. Resveratrol og CR udviste lignendeanti-aging aktiviteter, bevist afhæmmer senescens og apoptose og genopretter kognitiv svækkelse og oxidativ skade. Desuden kunne deopregulerer telomerase(TE) aktivitet,øge udtryk for SIRT1, gaffelboks 3a (Foxo3a), en aktiv regulator af SIRT1 (AROS) og Hu-antigen R (HuR), men reducerer p53 og deleteres i brystkræft 1-niveauer (DBC1). Imidlertid viste 10 μM resveratrol in vitro og højdosisgruppen in vivorelativt stærkere aktiviteter af anti-aging og stimulerende SIRT1-niveauer end CR. Afslutningsvis, resveratrol og CR viste lignendeanti-aging aktiviteterpå SIRT1-signalering,implicerer potentialet af resveratrol som et CR-mimetikum.

Klik her for at kende Cistanche-urtebehandling til anti-aldring

INTRODUKTION

Forbedringer i sundhedsvæsenet har været med til at øge menneskets forventede levealder i de seneste årtier, og den ældre befolkning stiger således markant. Desværre betyder dette stadig stigende perioder med dårligt helbred eller handicap. I øjeblikket dukker en række aldringsrelaterede sygdomme op som de største sundhedstrusler i de fleste udviklede lande. Selvom det endnu ikke er muligt at ændre vores genetiske baggrund, er forskellige anti-aldringsstrategier i øjeblikket dukket op som sund livsstil og terapeutiske interventioner, der sigter mod at reducere forekomsten af ​​risikofaktorer for dårligt helbred [1].

CR, nedsat kalorieindtag uden underernæring, er en af ​​de mest robuste indgreb, der øger levetiden i modelorganismer fra gær til primater [2]. Det kunne beskytte mod forringelse af biologiske funktioner, reducere forekomsten og forsinke begyndelsen af ​​flere aldersrelaterede sygdomme. Mekanismen, hvorved CR forlænger levetiden, involverer retardering af vækst, reduktion af kropsfedt, forsinkelse af neuroendokrine eller immunologiske ændringer, stigning i DNA-reparationskapacitet, ændret genekspression, øget apoptose, reduktion af kropstemperatur og sænkning af metabolisk hastighed og forbedring af oxidativ stress [3]. Anti-aldringseffekten af ​​CR har været stærkt forbundet med et øget niveau og aktivering af medlemmer af sirtuin-familien og også relateret til andre molekylære signalveje, herunder peroxisomproliferator-aktiveret receptor G coactivator- 1 (PGC{{ 6}}), adenosinmonophosphat-aktiveret proteinkinase (AMPK), insulin/insulin vækstfaktor-1 og mål for rapamycin [1, 4]. Men de fleste mennesker ville ikke overholde et så stringent kostprogram, især på lang sigt. Derfor er nyere forskning i stigende grad rettet mod at bestemme gennemførligheden og effektiviteten af ​​naturlige og/eller farmakologiske CR-mimetiske molekyler/behandlinger uden at reducere fødevareforbruget [5].

Resveratrol er en plantepolyphenol, der almindeligvis findes i forskellige planter, herunder huden på druer, bær og jordnødder. Interessant nok kan inkorporering af resveratrol i kosttilskud eller fødevarer være en kraftfuld terapeutisk mulighed for anti-aldring, og adskillige rapporter indikerer, at resveratrolbehandling frembringer gavnlige virkninger svarende til dem af CR [6], hvilket implicerer potentialet af resveratrol som et CR-mimetikum. [4]. For nylig er det blevet påvist, at resveratrol forlænger levetiden ved at øge SIRT1-aktiviteten betydeligt, hvilket resulterer i en stigning i SIRT1-affiniteten for både NAD plus og det acetylerede substrat [7, 8], som også er ansvarlig for levetiden forårsaget af CR. Selvom resveratrol og CR er blevet bredt undersøgt for deres potentielle sundhedsmæssige fordele, ved man kun lidt om deres sammenlignende virkninger. I denne undersøgelse sammenlignede vi anti-aldringseffekten af ​​resveratrol og CR in vivo og in vitro ved at detektere SIRT1-vejen.

RESULTATER

Resveratrol og CR reducerede alderdomsassocieret -galactosidase (SA -gal) farvning i AAPH-behandlede IMR-90 celler

Ved at udnytte en AAPH-induceret senescensmodel af IMR-90-celler testede vi den mulige effekt på SA- -gal-farvning. Som vist i figur 1 udviste de AAPH-behandlede celler mere udbredt og kraftigt positiv farvning end i kontrolceller, og den positive farvning i kontrolceller var relativt sjælden. Resveratrol (5 μM, 10 μM og 20 μM) eller CR-behandling viste sig at give markant beskyttelse i AAPH-induceret senescens. Ved at sammenligne effekten af ​​resveratrol med CR viste celler behandlet med 10 μM resveratrol desuden relativt sjældnere SA{10}}Gal-positiv farvning end CR-behandling. Disse resultater antydede således, at 10 μM resveratrol mere effektivt hæmmede AAPH-induceret senescens end CR.

Scanningelektronmikroskopianalyse af IMR- 90-celler

Scanningelektronmikroskopi-undersøgelse gav nogle nye detaljer om strukturen af ​​de AAPH-behandlede celler (figur 2). Normal IMR-90 fremstod som fuldt spredte celler med en typisk fusiform. De fleste af cellerne indeholdt to nedtrapningsprocesser og udviste få blærer. AAPH-behandlede celler udviste en forstørret og fladtrykt morfologi med talrige blærer. I modsætning hertil indikerede scanningselektronmikroskopiobservation af IMR-90-prøver behandlet med resveratrol eller CR efter AAPH-administration klart, at selvom nogle blærer kunne påvises, blev den normale fusiforme form generelt opretholdt sammen med fuldstændig spredning.

Resveratrol og CR reducerede apoptose i AAPH-behandlede IMR-90-celler

Phosphatidylserin på overfladen af ​​celler, betragtet som kendetegnende for apoptose i den tidlige fase, blev bestemt ved PI/Annexin V-farvningsassay (figur 3). De apoptotiske celler består af både tidlige apoptotiske celler farvet med Annexin-V-FITC og sene apoptotiske eller nekrotiske celler farvet med Annexin-V-FITC og PI. Populationen af ​​apoptotiske celler steg signifikant i AAPH-gruppen (34,54 procent) sammenlignet med den negative gruppe (7,32 procent). Hvorimod resveratrol (5 μM, 10 μM og 20 μM) eller CR-behandling viste sig at reducere apoptose i AAPH-inducerede IMR-90-celler. Derudover reducerede 10 μM resveratrolbehandling (11,58 procent) mere effektivt AAPH-induceret apoptose end CR-behandling (16,78 procent).

Ændring af generel udseende og kropsvægt

Under hele forsøgsprocessen blev de aldrende modelrotter modtaget D-gal i en dosis på 200 mg/kg hver dag, og generelt udseende blev observeret. Sammenlignet med normale kontrolrotter blev rotterne i D-gal-modelgruppen gradvist apatiske, matte og langsomme i respons; håret på modelgruppen mistede gradvist elasticiteten og blev skørt; huden blev tynd, uelastisk og slap lidt efter lidt. Imidlertid viste samtidig behandling af resveratrol eller CR med D-gal hos rotter en vending af ændringerne ovenfor sammenlignet med D-gal-gruppen. Der var ingen forskel i kropsvægt mellem eksperimentelle grupper inden for behandlingsperioden, bortset fra CR-gruppen med næsten ingen vægtstigning under forsøget (figur 4).

Resveratrol og CR forbedrede SD-rotters rumlige indlæring og hukommelse

Vi vurderede rotternes rumlige indlæring og hukommelsesevne ved at udføre Morris-vandlabyrint-testen. Som vist i figur 5 var alle fem grupper i stand til at lære opgaven med succes, hvilket fremgår af gradvist reduceret flugtforsinkelse og øget svømmehastighed i de 4 dages stedsnavigationsfase. Analyseret ved hjælp af to-vejs ANOVA-metoden blev der vist signifikante forskelle både i gennemsnitlig flugtlatens og svømmehastighed mellem træningsdage (F(3.138)=41.660, P < 0. 01; F(3,138)=10.013, henholdsvis P < 0.01) og mellem behandlinger (F(4,46) )=36.762, P < {{40}}.01; F(4,46)=20.102, henholdsvis P < 0,01) men ingen interaktion mellem faktorerne dag og behandling (F(12,138)=0,846, P > 0,05; F(12,138)=1,084, henholdsvis P > 0,05). Udslipstiden i D-gal-gruppen var markant længere end i kontrolgruppen (P < 0,01) (Post-hoc-analyse, figur 5A). I mellemtiden viste rotterne i resveratrol plus D-gal-gruppen eller CR plus D-gal-gruppen en vending af de førnævnte ændringer i flugtlatens sammenlignet med D-gal-gruppen (P < 0,01) (Figur 5A), og forkortede især flugten latens til lignende niveauer med kontrolgruppen. Lignende resultater blev opnået for svømmehastigheden for rotter (figur 5B), og rotter i resveratrol plus D-gal-gruppen og CR plus D-gal-gruppen udviste bemærkelsesværdige stigninger i svømmehastigheden sammenlignet med D-gal-gruppen (P < 0,01) ). Imidlertid viste rotter i høj dosis resveratrol plus D-gal-gruppen relativt længere flugtlatens og lavere svømmehastighed sammenlignet med CR plus D-gal-gruppen.

Figur 1: Resveratrol og kaloriebegrænsning reducerer SA- -gal-farvning i AAPH-behandlede IMR-90-celler. AAPH-inducerede IMR- 90-celler blev behandlet med kalorirestriktion (CR) eller resveratrol (RES) ved den angivne koncentration i 2 dage. Forstørrelsen var 20×.

Figur 2: Scanningelektronmikroskopianalyse af IMR-90-celler. AAPH-inducerede IMR-90-celler blev behandlet med kalorirestriktion (CR) eller resveratrol (RES) ved den angivne koncentration i 2 dage. Forstørrelsen var 6000×.

Figur 3: Resveratrol (RES) og kaloriebegrænsning (CR) reducerede apoptose i AAPH-behandlede IMR-90-celler. Celler blev farvet med Annexin V-FITC/PI og analyseret ved flowcytometri. FL1-kanalen blev brugt til at detektere annexin-V-FITC-farvning, og FL2-kanalen var til PI-farvning

I den rumlige probefase (figur 5C og 5D) kunne det ses, at der var bemærkelsesværdige reduktioner af platformkrydsninger i D-gal-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen (P < 0.{{6} }1). Interessant nok var det gennemsnitlige antal gange, rotterne krydsede platformen, signifikant forbedret efter administration med resveratrol eller CR sammenlignet med D-gal-gruppen (P < 0,01). Imidlertid krydsede rotter i høje doser af resveratrol plus D-gal-gruppen platformen hyppigere end dem i CR plus D-gal-gruppen.

Disse resultater indikerede, at aldrende modelrotter havde svækkelse af rumlig indlæring og hukommelse, mens behandlingen af ​​resveratrol eller CR kunne genoprette den aldersrelaterede kognitive svækkelse forårsaget af D-gal administration. Desuden viste aldrende modelrotter behandlet med en høj dosis resveratrol relativt mere effektive adfærd end dem, der blev behandlet med CR.

Effekt af resveratrol og CR på SOD, T-AOC, MDA og lipofuscin niveauer hos aldrende rotter

SOD-, T-AOC-, MDA- og lipofuscin-niveauerne i rotter blev evalueret for at bekræfte, om anti-aldringseffekterne af resveratrol og CR blev medieret ved at lindre det oxidative stress forårsaget af D-gal administration. Tabel 1 viser niveauerne af SOD, T-AOC og MDA i serum, lever og hjerne hos normale og aldrende rotter. Eksponering for D-gal reducerede SOD- og T-AOC-niveauerne signifikant, men øgede MDA-niveauet i serum, lever og hjerne sammenlignet med kontrolgruppen (P < 0.05). Samtidig behandling af resveratrol eller CR med D-gal hos rotter forårsagede et fald i aktiviteten af ​​MDA-niveauet, men øgede SOD- og T-AOC-niveauer sammenlignet med D-gal-gruppen. Sammenlignet med CR-behandling viste resultaterne dog, at administrationen af ​​høj dosis af resveratrol var relativt overlegen.

Figur 4: Effekt af resveratrol og kaloriebegrænsning på kropsvægten af ​​D-gal-behandlede rotter under forsøget. Alle værdier blev udtrykt som middel ± SD. NG, negativ kontrolgruppe; MG, modelkontrolgruppe; RESL, lav dosis af resveratrol gruppe; RESH, høj dosis af resveratrol gruppe; CR, kaloriebegrænsningsgruppe.

Figur 5: Effekt af resveratrol og kaloriebegrænsning på adfærden af ​​D-gal behandlede rotter med Morris vandlabyrint. (A) Sammenligning af latenser til platformen i løbet af 4 træningsdage. Hver mus blev udsat for 4 forsøg pr. dag. (B) Sammenligning af svømmehastighed i løbet af 4 træningsdage. (C) Sammenligning af antallet af krydsende platforme, hvor platformen blev fjernet til sondeforsøg. (D) Den typiske svømmebane i sondeforsøget. Alle værdier blev udtrykt som middel ± SD. * P < 0.05, **P < {{10}}.01 sammenlignet med negativ kontrolgruppe; # P < 0,05, ##P < 0,01 sammenlignet med modelkontrolgruppe. NG, negativ kontrolgruppe; MG, modelkontrolgruppe; RESL, lav dosis af resveratrol gruppe; RESH, høj dosis af resveratrol gruppe; CR, kaloriebegrænsningsgruppe.

Tabel 1: Antioxidantstatus i væv og blod hos rotter i hver gruppe

Bemærk: Værdierne var middelværdien ± SD. * P < {{0}}.05, **P < 0.01 sammenlignet med kontrolgruppen (alle grupper); # P < 0.05, ##P < 0.01 sammenlignet med modelgruppe (CR-gruppe og RES-gruppe); ∆P < 0,05, ∆∆P < 0,01 sammenlignet med CR-gruppen (RES-gruppen). NG, negativ kontrolgruppe; MG, modelkontrolgruppe; RESL, lav dosis af resveratrol gruppe; RESH, høj dosis af resveratrol gruppe; CR, kaloriebegrænsningsgruppe.

er relativt overlegen. Lipofuscinophobning er et af de mest konsistente træk ved hjernens aldring. Som vist i figur 6 viste D-gal-behandlede rotter en signifikant stigning i lipofuscinniveau sammenlignet med kontrolgruppen (P < 0.01). Resveratrol og CR-behandling reducerede imidlertid lipofuscinakkumulering i hjernebarken hos aldrende rotter sammenlignet med D-gal-behandlede rotter (P < 0.01). Desuden var der ingen forskelle mellem resveratrol plus D-gal-gruppen og CR plus D-gal-gruppen (P > 0,05).

Resveratrol og CR opregulerede telomeraseaktivitet hos aldrende rotter

Vi evaluerede effekten af ​​resveratrol og CR på telomeraseaktivitet i lever- og hjernevæv (figur 7). Vores resultater viste, at behandlingen ikke havde nogen signifikant effekt på telomeraseaktiviteten i levervæv (P > 0.05). Telomeraseaktiviteten var imidlertid reduceret i D-gal-administrationsgruppen sammenlignet med kontrollen (P < 0.05). I mellemtiden kunne resveratrol eller CR opregulere telomeraseaktiviteten i D-gal administration plus resveratrol eller CR behandlingsgruppen. Desuden var der ingen forskelle mellem resveratrol-gruppen og CR-gruppen (P > 0,05).

Figur 6: Effekt af resveratrol og kaloriebegrænsning på lipofuscinniveauet hos aldrende rotter. Alle værdier blev udtrykt som middel ± SD. * P < 0.05 sammenlignet med negativ kontrolgruppe; # P < 0,05 sammenlignet med modelkontrolgruppe. NG, negativ kontrolgruppe; MG, modelkontrolgruppe; RESL, lav dosis af resveratrol gruppe; RESH, høj dosis af resveratrol gruppe; CR, kaloriebegrænsningsgruppe.

Resveratrol og CR øgede AAPH-induceret SIRT1-mRNA-ekspression For at udforske SIRT1's rolle i behandlingseffekterne af resveratrol og CR blev ekspressionsniveauerne af SIRT1-mRNA i IMR-90-celler og -væv undersøgt ved kvantitativ realtids-RT- PCR. Resultaterne viste, at ekspressionen af ​​SIRT1-mRNA i IMR-90-celler blev signifikant reduceret af AAPH. Resveratrol og CR kunne effektivt genvinde SIRT1-mRNA-ekspressionsniveauer i AAPH-behandlede celler, og 10 μM resveratrol var den optimale koncentration til at stimulere ekspressionen af ​​SIRT1-mRNA i IMR-90-celler (P < 0,01; figur 8)