Melatonin forhindrer T-lymfocytinfiltration til nyrerne hos hypertensive rotter, induceret af en kost med højt saltindhold, ved at forhindre ekspression af CXCR3-ligandkemokiner

For flere oplysninger:ali.ma@wecistanche.com

Ariel Bier¹, Rawan Khashab², Yehonatan Sharabi^1,2,3, Ehud Grossman^1,2,3og Avshalom Leibowitz^1,2,3,*

¹Medicine D, Chaim Sheba Medical Center, Tel-Hashomer 5262000, Israel; arielbier@gmail.com (AB);Yehonatan.Sharabi@sheba.health.gov.il (YS); Ehud.Grossman@sheba.health.gov.il (EG)² Hypertension Unit, the Chaim Sheba Medical Center, Tel-Hashomer 5262000, Israel;rawankhasbab@gmail.com³Sackler Faculty of Medicine, Tel-Aviv University, Tel-Aviv 6997801, Israel*

Abstrakt: I en tidligere undersøgelse viste vi detmelatoninforhindrernyreskade i en salt-induceret hypertensionsmodel ved at reducere oxidativt stress. Vi antog, at denne effekt involverer smelatonins immunmodulerende egenskaber. In vivo Study-Dahl saltfølsomme (DSS) rotter blev fodret med normal foder, en høj-salt diæt (HSD) eller en HSD ogmelatonin(30 mg/kg/dag) i deres vand i 8 uger.Nyrerblev høstet til øjeblikkelig lymfocytisolering og karakterisering ved flowcytometri (CD3 plus CD4 plus og CD3 plus CD8 plus) og for lymfocytkemoattraktant (hovedsageligt CXCL)kemokiner) genekspressionsundersøgelser. In vitro-studie-rotte, mesangiale celler (RMC) blev dyrket i et medium med højt saltindhold uden og medmelatonin. En HSD var forbundet med signifikant renalinfiltration af CD4 plus og CD8 plus T-lymfocytter sammenlignet med kontrol. Melatonin reducerede signifikant renal lymfocytinfiltration. En HSD øgede signifikant mRNA-ekspression af CXCLkemokiner.Tilføjelse af melatonin til HSD afskaffede denne effekt. Behandling af RMC-celler med salt øgede udtrykket af CXCL10 og CXCL11, men ikke CXCL9. Tilføjelsemelatonintil kulturmedierne forhindrede denne stigning. Behandling af HSD-fodrede rotter med melatonin reducerede renal lymfocyt chemoattractantmRNA-ekspression og er forbundet med signifikant reduktion af renal T-lymfocytinfiltration. Salt kan have en direkte effekt på kemokin-producerende nyreceller, som afstumpes ved melatoninbehandling.

Nøgleord:melatonin; salt; T-lymfocytter; forhøjet blodtryk;nyre; CXCL 9; CXCL 10; CXCL 11

1. Introduktion

Hypertension (HTN) er en førende modificerbar kardiovaskulær risikofaktor. På grund af befolkningens aldring er forekomsten af ​​HTN støt stigende og når op til 30 procent i fremskridt [1]. På trods af forskellige medicinske terapeutiske muligheder er verdensomspændende kontrol med HTN dårlig. Konsekvenserne af ukontrolleret HTN er ødelæggende, hvilket skaber en enorm negativ indvirkning på folkesundheden [2].

Forskellige adfærdsmæssige, miljømæssige og genetiske faktorer er involveret i patogenesen af ​​HTN. Det høje saltindhold i vestlige kostvaner er blevet impliceret som en væsentlig bidragyder til HTN og er forbundet med øget morbiditet og dødelighed. Retningslinjer og offentlige initiativer anbefaler at reducere saltindtaget for den brede befolkning. Imidlertid kan ikke alle personer drage fordel af denne begrænsning, da patofysiologien, der forbinder saltfølsomhed med HTN, ikke er fuldt ud forstået og har brug for forbedret mekanistisk forståelse [3]. Nye strategier er således afgørende for bedre HTN-forståelse og kontrol, hvilket gør nye forskningsparadigmer til et øjeblikkeligt behov.

Inflammation og oxidativt stress har vist sig at være involveret i patogenesen af ​​essentiel HTN. Mens man forsker efter de triggere, der initierer og fortsætter disse processer, tyder mange eksperimentelle HTN-modeller på involvering af det adaptive immunrespons [4].

Klik for atCistanche fordele og bivirkninger for nyrefunktionen

Ledetråde, der forbinder adaptiv immunitet til HTN, har allerede eksisteret siden 1960'erne. Men først på det seneste, med en bedre forståelse af immunsystemet, kunne der opnås fremskridt i denne retning. En banebrydende undersøgelse af Guzik et al. demonstrerede, at angiotensin (Ang) II eller deoxycorticosteron (DOC) salt HTN blev stump i rag1-/-mus, som mangler T- og B-lymfocytter, og adoptiv overførsel af T, men ikke B-celler, kunne genoprette BP-responset [5]. Siden dette papir har forskellige adoptive immunitetskomponenter vist sig at være relevante for patogenesen af ​​HTN i de fleste almindelige dyremodeller. T-cellernes rolle i den salt-inducerede HTN-model er også blevet grundigt undersøgt. In vitro undersøgelser viser, at salt kan skubbe naiv T-celledifferentiering ind i TH17-celler [6]. Talrige in vivo-arbejde i de højsalt-diæt-(HSD)-inducerede HTN-modeller, såsom Dhal-saltfølsomme (DSS) rotter, viser omfattende nyre-T-celleinfiltration [7-9].

Blandt de mange fysiologiske processer,melatonininvolvering med blodtryksregulering er noget intuitivt. Det cirkadiske blodtryksmønster tilskynder til omfattende forskning vedrørende melatonin og HTN. Mange værker i fortiden, i mennesker og i eksperimentelle modeller, koblede lave melatoninniveauer til HTN [10]. Der er nogle kliniske data, der tyder på, at melatonintilskud kan behandle HTN, hovedsageligt for patienter med natlig HTN [11]. Inkonsistensen af ​​disse data rejser imidlertid spørgsmål om, hvorvidt ikke-cirkadiske melatoninegenskaber også er involveret i blodtryksregulering.

Melatonins antiinflammatoriske og antioxidative egenskaber har antydet, at melatonin interagerer med immunsystemet. Nye data har impliceret rollen af ​​melatonin-signalering i T-celleudvikling, aktivering, differentiering og hukommelse. Det er der bevis formelatoninmembran- og nukleare receptorer er til stede på T-celler [12,13].Melatoninpåvirker produktionen af ​​mange cytokiner involveret i immunrespons, såsom interferon (IFN) - som er en pivot-regulator af Th1-respons [14].

Oxidativt stress og T-celle-respons arbejder ifølge nogle forskere sammen med at fremme udviklingen af ​​HTN og hypertensive organskader [15]. I vores tidligere arbejde viste vi detmelatoninreducerer lokalt (renalt) oxidativt stress og forhindrer salt-induceret nyrefibrose og proteinuri i en saltfølsom HTN-rottemodel (DSS-modellen) [16]. Da oxidativ stress har en central rolle i HTN-associeret adaptiv immunrespons, antog vi, at melatonins immunmodulerende egenskaber er ansvarlige for dets beskyttende rolle i HSD-induceret HTN.

Formålet med denne undersøgelse er at vurdere, ommelatoninreducerer det salt-inducerede T-cellerespons og for at belyse de mekanismer, der er ansvarlige for denne effekt.

2. Materialer og metoder

2.1. Dyr og undersøgelsesprotokol

Studieprotokollen blev godkendt af den institutionelle dyreetiske komité i Sheba medicinske center i Israel. Deres helbredstilstand blev overvåget ved at måle kropsvægt og en daglig generel observation for bevægelse og helbredsforhold for hvert dyr. Dahl-saltfølsomme hanrotter, fire uger gamle (RGD Cat# 1582190, RRID: RGD_1582190), blev anbragt i en dyrefacilitet i almindelige bure (to rotter pr. bur) ved 22 ◦C med en 14 lys/10 timers mørkecyklus. Rotterne blev holdt på en normal saltdiæt og fik postevand til at drikke ad libitum i en akklimatiseringsperiode på fem dage. Rotterne blev derefter opdelt i tre grupper (n=8), i henhold til kosten, over en 8 ugers periode. Ifølge den etiske komité skulle dyr, der viste tegn på sygdom og lidelse, ofres.

Kontrolgruppen blev fodret med en standarddiæt til rottefoder (2018 SC; Teklad Envigo, Madison, WI, USA) og postevand; gruppen med højt saltindhold (HSD) blev fodret med en matchet beriget saltdiæt (4 procent) (TD.120485; Teklad Envigo, Madison, WI, USA) og postevand, ogmelatoningruppen blev fodret med den samme berigede saltdiæt (4 procent) med melatonin (M5250; Sigma, Rehovot, Israel) (30 mg/kg/dag) i deres drikkevand. Kropsvægt og vandforbrug blev målt med jævne mellemrum. Den korrekte melatoninmængde blev opløst i tændstikvandene pr. hvert bur for at levere den korrekte dosis til hvert dyr. Dag nul er defineret som dagen for start af HSD- og melatoninforbruget. Ved afslutningen af ​​undersøgelsen blev rotterne aflivet ved dyb bedøvelse med 3 procent isofluran (bedøvelsesdybde bekræftet ved klemning på bagsiden) ognyrerblev høstet. Begge nyrer blev fjernet og hemiseret. Nyrerne blev taget til flowcytometrianalyse bortset fra flere portioner, som hurtigt blev fjernet og lynfrosset i flydende N2 og opbevaret ved -80 ◦C. Frosne væv blev brugt til RNA-ekstraktion.

Cistanche-nyresygdom symptomer

2.2. Real-Time Kvantitativ Reverse Transcription PCR

mRNA-ekspressionsniveauer af gener blev konstateret inyrevæv ved realtids kvantitativ revers transkriptase-PCR (qRT-PCR). Totalt RNA blev ekstraheret fra nyrevævet ved hjælp af et NucleoSpin RNA Kit (MACHERY-NAGEL, Düren, Tyskland). Omvendt transkription blev udført ved anvendelse af et Applied Biosystems High-Capacity cDNAReverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). qRT-PCR-reaktioner blev udført ved hjælp af Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK) og Applied Biosystems 7500 real-time PCR-systemet. Cyklusbetingelserne var: et første enkelt trin på 95 ◦C i 0.20 min. og derefter 40 cykler af smeltetrin i 3 s ved 95 ◦C og et forlænget trin på 30 s ved 60 ◦C. Ved afslutningen af ​​de 40 cyklusser blev der udført en smeltekurvestage. Det ribosomale protein laterale stilk underenhed P0 (Rplp0) mRNA blev brugt som en intern kontrol. Primerne er anført i tabel 1.

Tabel 1. Liste over rotteprimere anvendt i denne undersøgelse.

2.3. T-celler isolation fra nyrer

Efter fjernelse af nyrekapslen, de tonyrerblev hakket og drillet med stemplet fra en 2 mL sprøjte gennem en 100 µm cellesi i RPMI 1640 indeholdende 2 mML-glutamin, 10 procent FBS, 10 ug/mL DNase 1 (Stem Cells technologies, Cambridge, MA , USA) og 0,1 procent collagenase type IV (CLS 4, Worthington Decatur, AL, USA). Opløsningen blev inkuberet i 25 minutter ved 37 ◦C. Vaskeopløsning (DPBS/2 procent FBS/2 mM EDTA) blev derefter tilsat til nyrehomogenatet for at nå 45 ml og blev filtreret gennem en 70 µm cellefilter. Opløsningen blev centrifugeret ved 400 x g/7 min. og pelleten blev suspenderet i en 5 ml vaskeopløsning og filtreret gennem en 40 µm cellesi og gencentrifugeret ved 400 x g/7 min. Pelleten blev resuspenderet i 3 ml FBS (10 mM EDTA) og lagdelt over Histopaque-1083 (Sigma, Rehovot, Israel) og centrifugeret ved 20 ◦C ved 400 x g/30 min. med bremsen slået fra. Det mononukleære cellelag, der hvilede over Histopaque, blev fjernet, vasket med vaskeopløsning to gange og suspenderet i en 5 ml vaskeopløsning til flowcytometrisk analyse.

2.4. Flowcytometri

Fra hver gruppe,nyrerfra 5-7 rotter blev analyseret. For hver prøve blev der taget 1 × 106 celler. Isolerede mononukleære celler blev inkuberet med ekstracellulære markører: anti-CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-0030-82, RRID:AB_465493) og dets isotypekontrol (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-4742-41, RRID :AB_10753770), anti-CD4 (Thermo FisherScientific Cat# 17-0040-80, RRID:AB_1210581) og dens isotypekontrol (Thermo Fisher Scientific Cat# 17-4724-81, RRID: AB_470188), anti-CD8 (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-0084-82, RRID:AB_10548361) og dens isotypekontrol (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-4714-80, RRID: AB_657914). Alle celler blev analyseret ved flowcytometri (BD FACSCalibur Flow Cytometry System, RRID: SCR_000401) ved hjælp af FlowJo-softwaren (FlowJo, RRID: SCR-008520).

Cistanche-nyre funktion

2.5. Cellekultur

Den mesangiale rottecellelinje, RMC (ATCC Cat# CRL{{0}}, RRID: CVCL_0506), blev opnået fra ATCC®. Cellen blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (01-055-1A, biologiske industrier, Beit HaEmek, Israel) med 4 mM L-glutamin justeret til at indeholde 1,5 g/L natriumbicarbonat og 4,5 g/L glucose og suppleret med 0,4 mg/mLG418 og 15 procent føtalt bovint serum. Melatonin blev opnået fra Sigma (M5250 Rehovot, Israel). A 250 mMmelatoninlager blev fremstillet i ethanol. Celler blev dyrket under normale eller højt saltholdige (tilsætning af 80 mM NaCl til mediet) betingelser uden eller med melatonin (0,5 mM). Melatoninbehandling blev tidsindstillet 45 minutter før tilsætning af NaCl til mediet. Alle eksperimenter var i 6-brøndsplader med 3 × 105 celler pr. brønd og blev udført af 6 uafhængige forsøg.

2.6. Statistisk analyse

Data præsenteres som gennemsnit ± SEM Statistiske analyser blev udført ved hjælp af IBMSPSS Statistics, RRID: SCR_019096. Envejsvariansanalyse (ANOVA) og den posthoc Tukey-metode undersøgte forskellene mellem grupper. qPCR-data i realtid blev analyseret ved hjælp af DataAssist, RRID: SCR_014969.

3. Resultater

3.1. Melatonin beskytter rotter, der spiser en HSD

Rotternes alder under denne undersøgelse var 4-13 uger. I denne alder er rotternes velbefindende angivet ved vægtøgning, som blev udvist af kontrolgruppen [17]. Imidlertid nåede HSD-gruppen et plateau på dag 30 og tilføjelsen afmelatonintil HSD forbedrede dette fænomen (figur 1A). HSD-gruppen udviste en høj dødelighed, hvor 50 procent af rotterne døde eller havde en klinisk tilstand, der krævede dødshjælp i henhold til de dyreetiske udvalgs regler, i forsøgsperioden. Melatonintilskud forhindrede rotternes dødelighed signifikant, hvor kun én ud af otte rotter døde på dag 58, i slutningen af ​​forsøgsperioden (figur 1B).

Figur 1.Melatoninforbedret blodtryk og overlevelse ved HSD. DSS Rotter blev behandlet i 9 uger med HSD med og uden melatonin. En kost med højt saltindhold reducerede kropsvægten fra dag 36, og melatonin modererede denne effekt (A). HSD øgede dødeligheden fra dag 40. Behandling af HSD-fødere med melatonin forbedrer deres overlevelse. (B). (n=8) *-p Mindre end eller lig med 0.05 salt og salt plus melatonin versus kontrol. #-p Mindre end eller lig med 0,05 salt versus kontrol og salt plus melatonin. HSD-diæt med højt saltindhold.

3.2. Melatonin forhindrer nyre-T-celle-infiltration induceret af HSD

Vi isolerede celler franyreog gatede dem til T-cellemarkøren, CD3. CD3 plus celler blev gatet til CD4 og CD8. Både CD3 plus CD4 plus og CD3 plus CD8 plus var signifikant højere i HSD (henholdsvis 5,18 ± 1,62 og 4,6 ± 0,75 procent) sammenlignet med kontrollen (0.16 ± {{18} }.{{20}}2 og henholdsvis 0,95 ± 0,15 procent) ogmelatoninsupplering til HSD reducerede både CD3 plus CD4 plus og CD3 plus CD8 plus celler tilbage til kontrolniveauer (henholdsvis 0.68 ± 0.21 og 1.37 ± 0}.45) (figur 2A-D).

Figur 2. Melatonin forhindrer T-cellers infiltration tilnyre. T-celler blev isoleret fra rotternes nyrer og blev gatet for CD3. De CD3-positive celler blev gatet til CD4 og CD8. Melatonin (C) reducerede både CD3 plus CD4 plus og CD3 plus CD8 plus sammenlignet med HSD uden melatonin (B) uden forskel fra kontrolgruppen (A). Analyse for alle rotter er vist i (D) (n=7–8). HSD-diæt med højt saltindhold. *-p Mindre end eller lig med 0.05 versus kontrol. #-p Mindre end eller lig med 0,05 versus salt plus melatonin.

3.3. Melatonin reducerer visse nyrekemokiner, som blev opreguleret i HSD

Rekrutteringen af ​​T-celler til inflammatorisk væv reguleres af lokal kemokinekspression. Vi målte derfor ekspressionen af ​​to kemokinfamilier i rotternenyrer: kemokin (CXC motiv) ligand (CXCL) familien og kemokin (C-Cmotif) ligand (CCL) familien.

For CXCL-familien var CXCL 9, 10 og 11, som tiltrækker T-celler til deres målvæv ved hjælp af CXCR3-receptoren på T-cellerne, signifikant opreguleret i HSD-rotter. Supplementet afmelatonintil HSD reduceret deres ekspression tilbage til kontrolniveauer. Det samme mønster blev påvist for CXCL 1 og 16. For CXCL12 blev der dog ikke påvist nogen opregulering i HSD (figur 3A).

For CCL-familien viste CCL 2, 4, 12, 17, 19 og CX3CL1 ingen opregulering i HSD. CCL3 var opreguleret i HSD, men ingen signifikant ændring blev påvist med tilsætning af melatonin til kosten. For CCL7 en væsentlig opregulering i HSD og en væsentlig nedregulering med tilføjelse afmelatonintil HSD blev detekteret (figur 3B).

Figur 3. Opregulering afnyrerneskemokineri HSD med og uden melatonin. Ekspressionen af ​​kemokin (CXC motiv) ligand (CXCL) familie (A), kemokin (CC motiv) ligand familie og CX3CL1 (B) blev bestemt i rotterne. (n=7–8) *-p Mindre end eller lig med 0.05 versus kontrol. #-p Mindre end eller lig med 0,05 versus salt plus melatonering. HSD-diæt med højt saltindhold.

3.4. Den direkte effekt af melatonin på RMC mesangial cellelinje

Vi fokuserede derefter på CXCL9, 10 og 11, som tiltrækker T-celler ved at binde til receptoren CXCR3. Vi bestemte udtrykket for dissekemokineri RMC-celler, som er en rotte mesangial cellelinje.

Vi behandlede cellerne med 80 mM NaCl uden og med 0,5 mMmelatonin. Denne koncentration af NaCl øgede signifikant ekspressionen af ​​CXCR10 med 2,4 ± 0.26-fold sammenlignet med kontrollen, og tilsætningen af ​​0,5 mM melatonin faldt signifikant. dette udtryk til 1,4 ± 0.{{10}}fold sammenlignet med kontrollen (figur 4A). For CXCL11 øgede 80 mM NaCl udtrykket signifikant med 3 ± 0.48- gange sammenlignet med kontrollen, og tilsætningen af ​​0,5 mM melatonin reducerede dette udtryk signifikant til 1,8 ± 0.{{22 }}fold sammenlignet med kontrollen (figur 4B). CXCL9 blev ikke påvist i RMC-celler.

Figur 4. Salt opregulerede CXCL10- og CXCL11-ekspression i en mesangial cellelinje, hvor melatonbehandling nedregulerede dets ekspression. RMC (rotters mesangiale cellelinje) blev behandlet med salt 80 mM med og uden 0,5 mM melatonin. CXCL10 (A) og CXCL11 (B) blev opreguleret ved saltbehandling og tilsætning afmelatoninreducere denne opregulering. Graferne viser 6 uafhængige forsøg. *-p Mindre end eller lig med 0.001 versus kontrol #-p Mindre end eller lig med 0.005 versus salt 80 mM og melatonin 0,5 mM. $-p Mindre end eller lig med 0,05 versus salt 80 mM og melatonin 0,5 mM.

4. Diskussion

Den gavnlige effekt afmelatoninpå HTN blev påvist i tidligere undersøgelser og blev foreslået som en mulig fremgangsmåde for behandlingsresistent HTN [18]. I vores første undersøgelse fokuserede vi på oxidativ stress og afslørede, at melatonin reducerer oxidativ stress induceret af HSD. I denne undersøgelse fokuserede vi på den adaptive immuneffekt og viste, at melatonin forbedrer overlevelsen af ​​HSD-fodrede rotter. Denne effekt er forbundet med en reduktion af T-celler, der infiltrerer nyrerne og nedregulering afnyrekemokin udtryk.

Historiske data viser, at DSS-rotter, der indtager en HSD, udvikler alvorlig HTN og udviser højere dødelighedsrater [19]. Dahl selv rapporterede, mens han etablerede modellen, at når DSS-rotter blev placeret på en HSD (8 procent NaCl) ved fravænning (21-23 dage gamle), udviklede de hurtigt HTN og døde alle ved den 16. uge med saltfodring [20]. Senere, efter nogle modifikationer af stammen, Rapp et al. rapporterede, at alle rotter var døde inden for otte uger efter HSD (8 procent NaCl) [21]. Rotterne i vores undersøgelse havde en høj dødelighed, men nåede ikke 100 procent, sandsynligvis på grund af den lavere procentdel (4 procent) salt i deres kost. Ikke desto mindre er det indlysendemelatonintilskud forhindrede rottedødelighed markant.

At tage på i vægt er en markør for rotternes velbefindende i en alder af 4-13 uger. DSS ratsoriginat fra Sprague Dawley, som er en velkarakteriseret stamme. I en alder af de rotter, som vi brugte i vores eksperimenter, formodes rotterne at tage på konsekvent i vægt [22]. I mange dyreforsøg betragtes vægtreduktion som et af "endepunkterne" i eksperimenterne [23]. Fra flere undersøgelser er det klart, at en HSD i DSS-rotter resulterer i lavere vægtforøgelse sammenlignet med kontroller [24,25]. I overensstemmelse med disse undersøgelser observerede vi også vægtforskelle mellem grupperne. Her tog rotterne ikke på i vægt efter fire ugers HSD. Melatonin stoppede også denne effekt af HSD, da rotterne, der blev behandlet med melatonin, fortsatte med at tage på i vægt, omend mindre end kontrollerne.

Evnen tilmelatoninat reducere blodtrykket i dyremodeller blev opdaget i slutningen af ​​halvfjerdserne af det 20. århundrede [26-28]. Siden da blev det rapporteret i flere andre modeller, såsom at en høj-fruktosediæt inducerer metabolisk syndrom hos spontant hypertensive rotter [29,30]. Vores undersøgelser på dette område er de første, der viser, at melatonin spiller en rolle i salt-induceret HTN ved at forhindre organskader og reducere dødeligheden.

I denne undersøgelse har vi vist, at en HSD inducerer T-lymfocytinfiltration tilnyre, en proces, som er blevet beskrevet i DSS-rotter hovedsageligt af Mattsons gruppe [31-33]. Den centrale rolle af denne infiltrationsproces i DSS-modellen er blevet demonstreret af en cent studie, der observerede, at T-celle-deficiente DSS-rotter er beskyttet mod HTN induceret af en HSD og en splenocytoverførsel forværrer saltfølsomt HTN [34].

Melatonin kan påvirke T-celler i forskellige aspekter (for gennemgang, se [35]). Det har denne undersøgelse for første gang vistmelatoninreducerer tiltrækningen af ​​både CD4 plus og CD8 plus Tceller tilnyrei HSD. Denne effekt af melatonin kan være mekanismen, der understreger dens gavnlige virkning i denne model.

Melatonins evne til at reducere T-celleinfiltration er blevet beskrevet i den eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE) musemodel. I EAE blev melatonin vist at reducere infiltrationen af ​​CD4 plus T-celler og Th17-celler i CNS [36,37].

T-celle tiltrækning til et specifikt væv er hovedsageligt reguleret af lokale høje koncentrationer afkemokinersom er kemotaktiske cytokiner, der styrer migrationsmønstre og positionering af immunceller. To store kemokinfamilier, der inducerer T-celleinfiltration, er CXC-motivligand (CXCL) og CC-motivligand (CCL) kemokinfamilierne [38].

Cistanche til forbedring af nyredysfunktion

I vores undersøgelse fandt vi ikke et konstant mønster i CCL-familiens respons på en HSD og tilmelatonin. Ud af de nikemokineri denne familie blev kun CCL7 og CLL21 observeret for at øge deres ekspression på grund af HSD, og ​​melatonintilskud reducerede det. En HSD øgede CCL3's ekspression, men der blev ikke påvist nogen reduktion i de melatoninbehandlede rotter. En nylig undersøgelse i samme model har vist, at en HSD opregulerer CCL2 inyreved at bruge RNA-Seq metoden [39]. Denne undersøgelse testede dog niveauerne på dag 3 og 21 efter diæten startede. I vores undersøgelse testede vi niveauerne efter otte uger. Det er muligt, at kemokinekspression ændres i løbet af HSD-perioden.

Omvendt steg niveauerne af det meste af CXCL-familien, inklusive CXCL 1, 9, 10, 11 og 16, hos de HSD-behandlede rotter ogmelatonintilskud afskaffede denne stigning. Kun CXCL12 viste ingen stigning i respons på HSD.

CXCL9, CXCL10 og CXCL11, kaldet "interferon-inducerbare CXC-kemokinreceptor 3-ligander", induceres af IFN- og er liganderne af CXC-kemokinreceptoren 3(CXCR3). In vivo undersøgelser har vist deres betydning i aktivering og rekruttering af T-lymfocytter til målorganet [40-42]. Youn et al. viste, hos humanhypertensive patienter, både nyreinfiltration af T-celler og forhøjede cirkulerende niveauer af alle de tre CXCR3kemokiner, hvilket tyder på, at CXCR3 og dets ligander er relevante for T-celler involveret i human HTN [43]. En anden undersøgelse har vist, at CXCL10 er forhøjet hos hypertensive patienter, og dets niveauer er korreleret til deres blodtryksværdier [44].

På grund af disse undersøgelser fokuserede vi på CXCL9, CXCL10 og CXCL11. Vi dyrkede den mesangiale rottecellelinje og behandlede dem med 80 mM NaCl og 0,5 mM melatonin. Vi fandt ud af, at CXCL 10 og 11 er opreguleret i cellerne, og melatonin ophæver denne forhøjelse. Vores resultater indikerer, at effekten af ​​salt i at hæve CXCL 10 og 11, og den modsatte effekt afmelatonin, blev begge direkte påvist i mesangiale celler. I modsætning hertil blev CXCL9 ikke påvist i disse celler.

Vores undersøgelse har begrænsninger. I vores FACS-resultater var mange af CD3 plus dobbeltnegative for både CD4 og CD8. De samme resultater blev set i Mattsons undersøgelse fra 2010 [31]. Men i nyere undersøgelser fra Mattsons gruppe var CD3 plus CD4-CD8-cellerne meget få [32,33,45,46]. Det signifikante fald i de dobbeltnegative CD3-celler kunne være et resultat af tilføjelse af CD45-markøren og kun analysering af de celler, som var CD45-positive, hvilket er, hvad der blev udført i de senere undersøgelser af Mattson. Det er muligt, at den store population af CD3 plus CD'en4-CD'en8- er en artefakt. Der kendes dog ingen artefakt for CD3 plus CD4 plus og CD3 plus CD8 plus cellepopulationen.

5. Konklusioner

Som konklusion er en kost med højt saltindhold forbundet med T-celleinfiltration inyreraf DSS rotter. Salt øgede også ekspressionen af ​​specifikke T-celle kemoattraktanter i nyrerne. Behandling medmelatonin(30 mg/kg/dag) afskaffede disse virkninger (melatoninreducerer HSD-induceret infiltration af T-celler i nyrerne sammen med en reduktion i CXCL3-ligand-kemokinekspression).

Vores in vitro undersøgelse viser, at salt og melatonin kan regulere kemoattraktantekspression ved direkte at påvirkenyreceller.

Forfatterbidrag: Conceptualization, AL; formel analyse, AB og RK; undersøgelse, RK;metode, AB og AL; skrift – originalt udkast, AB og AL; skrivning – gennemgang og redigering, YSog EG Alle forfattere har læst og accepteret den offentliggjorte version af manuskriptet.

Finansiering: Denne forskning modtog ingen ekstern finansiering.

Udtalelse fra institutionelle revisionsråd: Undersøgelsesprotokollen blev godkendt af den institutionelle dyreetiske komité i Sheba lægecenter, protokol nr. 1219/19/ANIM og sundhedsministeriets protokol nr. 16418.

Erklæring om informeret samtykke: Ikke relevant.

Erklæring om datatilgængelighed: Dataene præsenteret i denne undersøgelse er tilgængelige på anmodning fra den tilsvarende forfatter.

Tak: Forfatterne takker Zehava Shabtai for hendes fremragende tekniske support og Michael Kanovsky for hans redaktionelle tjenester.

Interessekonflikter: Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Referencer

1. Olsen, MH; Angell, SY; Asma, S.; Boutouyrie, P.; Burger, D.; Chirinos, JA; Damasceno, A.; Delles, C.; Gimenez-Roqueplo, AP; Hering, D.; et al. En opfordring til handling og en livsforløbsstrategi for at imødegå den globale byrde af forhøjet blodtryk på nuværende og fremtidige generationer: The Lancet Commission on hypertension. Lancet 2016, 388, 2665-2712. [CrossRef]

2. O'Brien, E. The Lancet Commission on hypertension: Adressering af den globale byrde af forhøjet blodtryk på nuværende og fremtidige generationer. J. Clin. Hypertens 2017, 19, 564-568. [CrossRef]

3. O'Donnell, M.; Mente, A.; Yusuf, S. Natriumindtag og kardiovaskulær sundhed. Circ. Res. 2015, 116, 1046-1057. [CrossRef]

4. Schiffrin, EL Mekanismer for remodeling af små arterier, antihypertensiv terapi og immunsystemet ved hypertension.Clin. Undersøg. Med. 2015, 38, E394-E402. [CrossRef]

5. Guzik, TJ; Hoch, NE; Brown, KA; McCann, LA; Rahman, A.; Dikalov, S.; Goronzy, J.; Weyand, C.; Harrison, DG T-cellens rolle i tilblivelsen af ​​angiotensin II-induceret hypertension og vaskulær dysfunktion. J. Exp. Med. 2007, 204, 2449-2460. [CrossRef][PubMed]

6. Kleinewietfeld, M.; Manzel, A.; Titze, J.; Kvakan, H.; Yosef, N.; Linker, RA; Muller, DN; Hafler, DA Natriumchlorid driver autoimmun sygdom ved induktion af patogene TH17-celler. Nature 2013, 496, 518–522. [CrossRef]

7. Mattson, DL; Lund, H.; Guo, C.; Rudemiller, N.; Geurts, AM; Jacob, H. Genetisk mutation af rekombinationsaktiverende gen 1 inDahl saltfølsomme rotter dæmper hypertension og nyreskade. Er. J. Physiol. Regul. Heltal. Comp. Physiol. 2013, 304, 407-414.[CrossRef]

8. Mattson, DL Infiltrerende immunceller inyreved saltfølsom hypertension og nyreskade. Er. J. Physiol. Ren. Physiol.2014, 307. [CrossRef] [PubMed]

9. Lu, X.; Crowley, SD Inflammation i saltfølsom hypertension og nyreskade. Curr. Hypertens Rep. 2018, 20. [CrossRef][PubMed]

10. Baker, J.; Kempinski, K. Rolle afmelatonini blodtryksregulering: Et supplerende anti-hypertensivt middel. Clin. Exp. Pharm.Physiol. 2018, 45, 755-766. [CrossRef] [PubMed]

11. Grossman, E.; Laudon, M.; Zisapel, N. Effekt af melatonin på natligt blodtryk: Meta-analyse af randomiserede kontrollerede forsøg. Vasc. Sundhedsrisikostyring. 2011, 7, 577-584. [CrossRef] [PubMed]

12. Pozo, D.; Delgado, M.; Fernandez-Santos, JM; Calvo, JR; Gomariz, RP; Martin-Lacave, I.; Ortiz, GG; Guerrero, JM Ekspression af Mel1a-melatoninreceptor mRNA i T- og B-undergrupper af lymfocytter fra rottethymus og milt. Faseb J. Off. Publ. Fed.Am. Soc. Exp. Biol. 1997, 11, 466-473. [CrossRef]

13. Guerrero, JM; Pozo, D.; García-Mauriño, S.; Osuna, C.; Molinero, P.; Calvo, JR Inddragelse af nukleare receptorer i den forbedrede IL-2-produktion af melatonin i Jurkat-celler. Ann. NY Acad. Sci. 2000, 917, 397-403. [CrossRef] [PubMed]

14. Farez, MF; Mascanfroni, ID; Méndez-Huergo, SP; Yeste, A.; Murugaiyan, G.; Garo, LP; Balbuena Aguirre, ME; Patel, B.; Ysrraelit, MC; Zhu, C.; et al.MelatoninBidrager til sæsonbetingelsen af ​​multipel sklerosetilbagefald. Cell 2015, 162, 1338-1352.[CrossRef] [PubMed]

15. Kirabo, A.; Fontana, V.; de Faria, APC; Loperena, R.; Galindo, CL; Wu, J.; Bikineyeva, AT; Dikalov, S.; Xiao, L.; Chen, W.; et al. DC isoketal-modificerede proteiner aktiverer T-celler og fremmer hypertension. J. Clin. Undersøg. 2014, 124, 4642-4656. [CrossRef][PubMed]

16. Leibowitz, A.; Volkov, A.; Voloshin, K.; Shemesh, C.; Barshack, I.; Grossman, E. Melatonin forhindrernyreskade i en høj saltdiæt-induceret hypertensionsmodel ved at reducere oxidativt stress. J. Pineal Res. 2016, 60, 48-54. [CrossRef] [PubMed]

17. Hawkins, P.; Morton, DB; Burman, O.; Dennison, N.; Honess, P.; Jennings, M.; Lane, S.; Middleton, V.; Roughan, JV; Wells, S.; et al. En guide til at definere og implementere protokoller til velfærdsvurdering af laboratoriedyr: Elvte rapport fra BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Lab. Anim. 2011, 45, 1-13. [CrossRef]

18. Simko, F.; Reiter, RJ; Paulis, L.Melatoninsom et rationelt alternativ i den konservative behandling af resistent hypertension.Hypertens Res. 2019, 42, 1828-1831. [CrossRef] [PubMed]

19. Rapp, JP Dahl Salt-modtagelige og salt-resistente rotter. Hypertension 1982, 4, 753-763. [CrossRef]

20. Dahl, LK; Knudsen, KD; Heine, MA; Leitl, GJ Virkninger af kronisk overskydende saltindtagelse. Ændring af eksperimentel hypertension hos rotter ved variationer i kosten. Circ. Res. 1968, 22, 11-18. [CrossRef] [PubMed]

21. Rapp, JP; Dene, H. Udvikling og karakteristika af indavlede stammer af Dahl salt-følsomme og salt-resistente rotter. Hypertens 1985,7, 340-349. [CrossRef]

22. Brower, M.; Grace, M.; Kotz, CM; Koya, V. Sammenlignende analyse af vækstkarakteristika for Sprague Dawley-rotter opnået fra forskellige kilder. Lab. Anim Res. 2015, 31, 166-173. [CrossRef]

23. Talbot, SR; Biernat, S.; Bleich, A.; van Dijk, RM; Ernst, L.; Häger, C.; Hilgers, SOA; Koegel, B.; Koska, I.; Kuhla, A.; et al. Definition af kropsvægtreduktion som et humant endepunkt: En kritisk vurdering. Lab. Anim 2020, 54, 99-110. [CrossRef] [PubMed]

24. Geschka, S.; Kretschmer, A.; Sharkovska, Y.; Evgenov, OV; Lawrenz, B.; Hucke, A.; Hocher, B.; Stasch, J.-P. Stimulering af opløselig guanylatcyclase forhindrer omdannelse af fibrotisk væv og forbedrer overlevelsen hos saltfølsomme Dahl-rotter. PLoS ONE 2011, 6, e21853. [CrossRef] [PubMed]

25. Wang, Y.; Mu, JJ; Liu, FQ; Ren, KY; Xiao, HY; Yang, Z.; Yuan, ZY Saltinduceret epitel-til-mesenkymal overgang i Dahlsalt-følsomme rotter er afhængig af forhøjet blodtryk. Braz. J. Med. Biol. Res. Rev. Bras. Pesquisa Med. E Biol. 2014, 47, 223-230.[CrossRef]

26. Holmes, SW; Sugden, D. Proceedings: Virkningen af ​​melatonin på pinealektomi-induceret hypertension hos rotter. Br. J. Pharm.1976, 56, 360P-361P.

27. Zanoboni, A.; Zanoboni-Muciaccia, W. Eksperimentel hypertension hos pinealektomiserede rotter. Life Sci. 1967, 6, 2327-2331. [CrossRef]

28. Zanoboni, A.; Forni, A.; Zanoboni-Muciaccia, W.; Zanussi, C. Effekt af pinealektomi på arterielt blodtryk og føde- og vandindtag hos rotter. J. Endocrinol. Undersøg. 1978, 1, 125-130. [CrossRef] [PubMed]

29. Pechánová, O.; Zicha, J.; Paulis, L.; Zenebe, W.; Dobesová, Z.; Kojsová, S.; Jendeková, L.; Sládková, M.; Dovinová, I.; Simko, F.; et al. Virkningen af ​​N-acetylcystein og melatonin hos voksne spontant hypertensive rotter med etableret hypertension. Eur. J.Pharmcol. 2007, 561, 129-136. [CrossRef] [PubMed]

30. Leibowitz, A.; Peleg, E.; Sharabi, Y.; Shabtai, Z.; Shamiss, A.; Grossman, E. Rollen afmelatonini patogenesen af ​​hypertension hos rotter med metabolisk syndrom. Er. J. Hypertens 2008, 21. [CrossRef] [PubMed]

31. De Miguel, C.; Das, S.; Lund, H.; Mattson, DL T-lymfocytter medierer hypertension ognyreskader hos Dahl saltfølsomme stoffer. Er. J. Physiol. Regul. Heltal. Comp. Physiol. 2010, 298, R1136–R1142. [CrossRef] [PubMed]

32. Evans, LC; Petrova, G.; Kurth, T.; Yang, C.; Bukowy, JD; Mattson, DL; Cowley, AW Øget perfusionstryk driver nyre-T-celleinfiltration i den Dahl-saltfølsomme rotte. Hypertension 2017, 70, 543-551. [CrossRef]

33. Abais-Battad, JM; Alsheikh, AJ; Pan, X.; Fehrenbach, DJ; Dasinger, JH; Lund, H.; Roberts, ML; Kriegel, AJ; Cowley, AWJ; Kidambi, S.; et al. Kostpåvirkninger på Dahl-saltfølsom hypertension, nyreskade og T-lymfocyttranskriptomet.Hypertens 2019, 74, 854–863. [CrossRef] [PubMed]

34. Fehrenbach, DJ; Dasinger, JH; Lund, H.; Zmaj, J.; Mattson, DL Splenocytoverførsel forværrer saltfølsomme hypertension hos rotter. Exp. Physiol. 2020, 105, 864–875. [CrossRef] [PubMed]

35. Ren, W.; Liu, G.; Chen, S.; Yin, J.; Wang, J.; Tan, B.; Wu, G.; Bazer, FW; Peng, Y.; Li, T.; et al. Melatoninsignalering i T-celler: Funktioner og anvendelser. J. Pineal Res. 2017, 62. [Krydsref.]

36. Álvarez-Sánchez, N.; Cruz-Chamorro, I.; López-González, A.; Utrilla, JC; Fernández-Santos, JM; Martínez-López, A.; Lardone, PJ; Guerrero, JM; Carrillo-Vico, A. Melatonin kontrollerer eksperimentel autoimmun encephalomyelitis ved at ændre T-effektor/regulatorisk balance. Hjernens adfærd. Immun. 2015, 50, 101-114. [CrossRef]

37. Chen, S.-J.; Huang, S.-H.; Chen, J.-W.; Wang, K.-C.; Yang, Y.-R.; Liu, P.-F.; Lin, G.-J.; Sytwu, H.-K.Melatoninøger interleukin 10-ekspression og undertrykker kemotaksi for at hæmme inflammation in situ og reducere sværhedsgraden af ​​eksperimentel autoimmuneencephalomyelitis. Int. Immunopharmacol. 2016, 31, 169-177. [CrossRef] [PubMed]

38. Griffith, JW; Sokol, CL; Luster, ADChemokinesog kemokinreceptorer: positionering af celler til værtsforsvar og immunitet.Annu. Rev. Immunol. 2014, 32, 659-702. [CrossRef] [PubMed]

39. Alsheikh, AJ; Dasinger, JH; Abais-Battad, JM; Fehrenbach, DJ; Yang, C.; Cowley, AWJ; Mattson, DL CCL2 medierer tidlig renal leukocytinfiltration under saltfølsom hypertension. Er. J. Physiol. Ren. Physiol. 2020, 318, F982–F993. [CrossRef][PubMed]

40. Liu, L.; Callahan, MK; Huang, D.; Ransohoff, RM Kemokinreceptor CXCR3: En uventet gåde. Curr. Top. Dev. Biol.2005, 68, 149-181. [CrossRef] [PubMed]

41. Groom, JR; Luster, AD CXCR3 ligander: redundante, kollaborative og antagonistiske funktioner. Immunol. Cell Biol. 2011, 89.207-215. [CrossRef] [PubMed]

42. Van Raemdonck, K.; Van den Steen, PE; Liekens, S.; Van Damme, J.; Struyf, S. CXCR3-ligander i sygdom og terapi. CytokineGrowth Factor Rev. 2015, 26, 311-327. [CrossRef] [PubMed]

43. Youn, J.-C.; Yu, HT; Lim, BJ; Koh, MJ; Lee, J.; Chang, D.-Y.; Choi, YS; Lee, S.-H.; Kang, S.-M.; Jang, Y.; et al. Immunosenescent CD8 plus T-celler og CXC kemokinreceptor type 3kemokinerer øget ved human hypertension. Hypertens 2013, 62, 126-133.[CrossRef] [PubMed]

44. Stumpf, C.; Auer, C.; Yilmaz, A.; Lewczuk, P.; Klinghammer, L.; Schneider, M.; Daniel, WG; Schmieder, RE; Garlichs, CDSerum-niveauer af Th1 kemoattraktant interferon-gamma-inducerbart protein (IP) 10 er forhøjet hos patienter med væsentlig hypertension. Hypertens Res. 2011, 34, 484-488. [CrossRef] [PubMed]

45. Rudemiller, NP; Lund, H.; Priestley, JRC; Endres, BT; Prokop, JW; Jacob, HJ; Geurts, AM; Cohen, EP; Mattson, DL Mutation of SH2B3 (LNK), en kandidat til en genom-dækkende associationsundersøgelse til hypertension, dæmper Dahl saltfølsom hypertension via inflammatorisk modulering. Hypertens 2015, 65, 1111-1117. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Wade, B.; Petrova, G.; Mattson, DL Rolle af immunfaktorer i angiotensin II-induceret hypertension og nyreskade hos Dahlsalt-følsomme rotter. Er. J. Physiol. Regul. Heltal. Comp. Physiol. 2018, 314, R323–R333. [CrossRef] [PubMed]