Longitudinel immunprofilering afslører dominerende epitoper, der medierer langsigtet humoral immunitet hos COVID-19-rekonvalescente individer

Baggrund: Svært akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) er en højpatogen og smitsom coronavirus, der har forårsaget en global pandemi med 5,2 millioner dødsfald til dato. Spørgsmål vedrørende serologiske træk ved langvarig immunitet, især dominante epitoper, der medierer holdbare antistofresponser efter SARS-CoV-2-infektion, mangler at blive belyst.

Objektiv: Vi havde til formål at dissekere kinetikken og levetiden af ​​immunresponser hos patienter med coronavirus sygdom 2019 (COVID-19), såvel som epitoper, der er ansvarlige for vedvarende langsigtet humoral immunitet mod SARS-CoV-2.

Metoder: Vi vurderede SARS-CoV-2 immundynamik op til 180 til 220 dage efter sygdomsdebut hos 31 personer, der overvejende oplevede moderate symptomer på COVID-19, og udførte derefter en proteomdækkende profilering af dominante epitoper, der er ansvarlige for vedvarende humorale immunresponser.

Resultater: Longitudinel analyse afslørede vedvarende SARS-CoV-2-spidsproteinspecifikke antistoffer og neutraliserende antistoffer hos COVID-19-patienter sammen med aktivering af cytokinproduktion i tidlige stadier efter SARS-CoV-2-infektion. Meget reaktive epitoper, der var i stand til at mediere langsigtede antistofresponser, blev vist at være lokaliseret ved spidsen og ORF1ab-proteinerne. Nøgleepitoper af SARS-CoV-2-spidsproteinet blev kortlagt til det N-terminale domæne af S1-underenheden og S2-underenheden med varierende grader af sekvenshomologi blandt endemiske humane coronavirus og høj sekvensidentitet mellem de tidlige SARS- CoV-2 (Wuhan-Hu- 1) og nuværende cirkulerende varianter.

cistanche supplement fordele - hvordan man styrker immunsystemet

Konklusion: SARS-CoV-2-infektion inducerer vedvarende humoral immunitet hos COVID-19-rekonvalescente individer ved at målrette mod dominante epitoper placeret ved spidsen og ORF1ab-proteiner, der medierer langsigtede immunresponser. Vores resultater giver en vej til at hjælpe rationelt vaccinedesign og diagnostisk udvikling. (J Allergy Clin Immunol 2022;149:1225-41.)

Nøgleord:

SARS-CoV-2, COVID-19, langsigtet immunrespons, humoral immunitet, proteomdækkende peptidmikroarray, dominerende epitop

Svært akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV- 2), det forårsagende patogen til den igangværende coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) pandemi, tilhører Betacoronavirus-slægten, som omfatter 2 andre kendte højpatogene mennesker coronavirus: det alvorlige akutte respiratoriske syndrom (SARS) og mellemøstlige respiratoriske syndrom (MERS) coronavirus.1 Siden begyndelsen af ​​det første registrerede tilfælde i slutningen af ​​december 2019 har SARS-CoV-2-infektion resulteret i mere end 263 mio. bekræftede tilfælde og 5,2 millioner dødsfald på verdensplan pr. november 2021, hvilket påvirker 220 lande og regioner på tværs af 5 kontinenter.2 Efter infektion spænder de kliniske præsentationer vidt, herunder asymptomatiske infektioner, milde eller moderate symptomer eller endda livstruende alvorlig lungebetændelse.3 På trods af tilgængeligheden af ​​flere typer vaccinetilgange, kæmper mange lande stadig for at begrænse nye bølger af infektioner, med virusvarianter, der ser ud til at udvise øget overførbarhed og resistens over for antivirale immunresponser. Et effektivt humoralt immunrespons medieret af neutraliserende antistoffer bør have en kraftig og uundværlig adaptiv immunitet til at blokere infektion og eliminere virale patogener. Efter SARS-CoV-2-infektion blev der observeret en høj rate (over 90 %) af robust serokonversion blandt inficerede individer 7 til 14 dage efter sygdomsdebut.4-6 Produktionen af ​​antigenspecifik IgA, IgG, og IgM, der genkendte spidsproteinet (S) og nukleocapsidproteinet (N) af SARS-CoV-2, kunne påvises under sygdommens akutte fase og det tidlige stadie af rekonvalescens.4,5,7 Størrelsen af ​​neutraliserende antistoffer så ud til at være forbundet med alder, symptomatisk infektion og sygdommens sværhedsgrad. Ældre patienter og personer, der udviser alvorlige COVID--19-symptomer, har tendens til at udvikle højere niveauer af neutraliserende antistoffer.4,8-10 Adskillige undersøgelser vedrørende antistofresponsernes levetid har vist, at trods tab af serum/plasma-reaktivitet over for virus antigener og faldende neutraliserende antistoftitre over tid i nogle symptomatiske COVID-19-tilfælde blev der observeret et vedvarende niveau af overordnet langsigtet humoral immunitet i op til 8 til 12 måneder efter infektion hos COVID-19-rekonvalescente individer .10-13 Desuden forblev antallet af SARS-CoV-2-antigenspecifikke hukommelses-B-celler stabilt i mindst 6 til 12 måneder,12,13 sammen med løbende selektion og akkumulering af B-cellekloner, der udtrykker neutraliserende antistoffer,12,14 indikerer opretholdelse af vedvarende humoral immunitet efter SARSCoV-2-infektion.

cistanche supplement fordele-øge immunitet

Neutraliserende antistoffer spiller en fundamental rolle i værtens forsvar mod viral infektion. Et panel af meget potente monoklonale antistoffer af SARS-CoV-2 er blevet identificeret,15-17 primært målrettet mod epitoper lokaliseret ved det receptorbindingsdomæne af S-proteinet, der samles til trimerer på virionoverfladen og letter virusindtrængning og fusion om at engagere den angiotensin-konverterende enzym 2-receptor.18 Andre regioner af S-protein, herunder det N-terminale domæne (NTD) af S1-underenheden og S2-underenheden, indeholder også immunogene epitoper, der er i stand til at inducere neutraliserende antistoffer.16 ,19,20 Udover neutralisering kan antistoffer af SARS-CoV-2 give beskyttelse in vivo via Fc-medierede effektorfunktioner, såsom antistofafhængig fagocytose udløst af naturlige dræberceller og antistofafhængig cytotoksicitet af monocytter eller makrofager. 21,22 Ud over at bekæmpe virusinfektioner kan antistoffer genereret ved naturlig infektion eller vaccination lette viruspatogenesen, enten ved øget inflammationsaktivering eller øget virussmitteevne gennem antigen-/antistofimmunkompleksdannelse eller ved Fc-afhængige funktioner,23-25 selvom den forstærkede virusinfektion ikke er blevet observeret i forbindelse med SARS-CoV-2 in vivo. Disse divergerende roller af antistofresponser nødvendiggør en systematisk karakterisering af SARSCoV-2-epitoper, såvel som egenskaber af langvarige antistoffer, der er målrettet mod neutraliserende eller ikke-neutraliserende epitoper. På trods af nylige fremskridt med hensyn til kinetikken og varigheden af ​​antistofresponser efter SARS-CoV-2-infektion, er longitudinelle analyser vedrørende fremtrædende epitoper, der opretholder langsigtede humorale immunresponser, stadig begrænset. Tidligere undersøgelser har profileret epitoper af antistofrespons hos COVID-19-inficerede individer, hovedsageligt ved hjælp af ELISA-baserede assays, 26,27 fag- eller bakterie-display-baserede tilgange,28-31 og mikroarray-baserede teknologier.30,{{ 38}} Adskillige immundominante epitoper af SARS-CoV-2 S-protein er blevet identificeret; de hyppigst påviste regioner blev kortlagt tæt på eller spænder over fusionspeptidet (FP) af S2-underenheden, den anden heptad-gentagelse inden for S2-underenheden og på det C-terminale domæne af S1-underenheden.26,28-30, 32,33 Derudover afslørede serologisk screening også epitoper lokaliseret ved andre proteiner på tværs af SARS-CoV-2-proteomet, herunder N-protein, membran-(M)-protein og ORF1ab, ORF3a og ORF7a.28-30, 34,35 Selvom tidligere undersøgelser har givet vigtig indsigt i antigene epitoper, har disse undersøgelser i høj grad fokuseret på epitopprofileringen af ​​COVID-19 patienter i den tidlige rekonvalescensfase. De nøjagtige epitoper, der medierer holdbare SARS-CoV-2-specifikke antistofresponser samt dynamikken i epitopgenkendelse, mangler at blive belyst. For at opnå en dybere forståelse af kinetikken og levetiden af ​​humorale immunresponser hos COVID-19-patienter, især epitoper, der er ansvarlige for vedvarende langsigtet immunitet mod SARS-CoV-2, udførte vi en omfattende longitudinel analyse af immunprofilering hos 31 COVID-19 patienter op til 180 til 220 dage efter symptomdebut. Baseret på evalueringen af ​​antigenbindende og neutraliserende antistoffer samt serumcytokinniveauer identificerede vi yderligere et panel af epitoper lokaliseret ved ORF1ab, S og N proteiner af SARSCoV-2, der medierer vedvarende humorale immunresponser ved hjælp af et peptid mikroarray, der omfatter det komplette proteom af SARS-CoV-2. Vores resultater kaster lys over egenskaberne ved langvarig immunitet for at overvinde virusinfektion og vil hjælpe med at informere rationelt vaccinedesign og udviklingen af ​​forbedrede serologiske diagnostiske værktøjer.

METODER

Studiedeltagere og prøveindsamling

For at evaluere kinetikken af ​​SARS-CoV-2-rettede immunresponser i længderetningen, blev der indsamlet 101 serumprøver fra 31 SARS-CoV-2-inficerede individer, som blev indlagt på Nantong Third Hospital, tilknyttet Nantong University (Nantong) , Kina) mellem januar og marts 2020. Alle patienter blev diagnosticeret med bekræftet SARS-CoV-2-infektion gennem omvendt transkription kvantitativ PCR-testning; Sygdommens sværhedsgrad blev defineret som mild til moderat (ikke-alvorlig) eller svær COVID-19 i henhold til version 7 af Diagnosis and Treatment Protocol for Novel Coronavirus Pneumonia udgivet af National Health Commission of People's Republic of China.36 Patienterne blev fulgt op på langs i 4 til 8 måneder efter bedring efter akut infektion. Blodprøver blev indsamlet i en langsgående måde fra 4 til 219 dage efter symptomdebut for 20 patienter blandt 31 undersøgelsesdeltagere (median 4,5 prøver pr. andre 11 personer, som var i en sen rekonvalescent sygdomsfase (dage 122 til 214 efter sygdomsdebut). Derfor blev sera (n 5 20) fra alders- og kønsmatchede raske donorer også inkluderet som kontrolgruppen. Ingen undersøgelsesdeltagere havde en dokumenteret tidligere infektion med SARS eller MERS.

Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité på Nantong Third Hospital tilknyttet Nantong University (godkendelse EL2020006). Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra hver af undersøgelsens deltagere. Serum blev adskilt fra perifert blod i serumgelrør via centrifugering, formet til alikvoter og opbevaret ved 2808°C før brug.

Cellelinjer

HEK293T- og Huh7-celler blev dyrket i Dulbecco-modificeret Eagle-medium (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Gibco), 100 U/mL penicillin (Gibco) og 100 mg/ ml streptomycin (Gibco) ved 378°C med 5% CO2.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Påvisning af IgG-antistof ved ELISA

Niveauerne af antigenbindende IgG-antistoffer i humane serumprøver blev bestemt ved ELISA. 96-brønds ELISA-plader (Corning, Corning, NY) blev præcoated med SARS-CoV-2 nukleocapsidprotein (Sino Biological, Beijing, Kina, katalognr. 40588-V08B , 50 ng pr. brønd) eller spidsprotein (Sino Biological, 40589-V08B1, 100 ng pr. brønd), SARS-CoV spidsprotein (Sino Biological, 40634-V08B, 100 ng pr. brønd), eller MERS-CoV-spidsprotein (Sino Biological, 40069-V08B, 50 ng pr. brønd) natten over ved 48C. Efter blokering med 5 % fedtfri mælk i fosfatbufret saltvand (PBS) indeholdende 0,05 % Tween 20 (PBS-T) i 2 timer ved 378C, 3-fold seriefortyndede varmeinaktiverede serumprøver ved en startfortynding på 1 :200 blev tilsat til præcoatede plader i 2 timer ved 378°C. Brønde blev vasket 3 gange mellem hvert trin med PBS-T. Reaktioner blev visualiseret ved inkubation med peberrodsperoxidase-konjugeret anti-humant IgG-antistof (Abcam, Cambridge, Storbritannien, 1:100,000 fortynding) i 1 time ved 378C, efterfulgt af tilsætning af tetramethylbenzidinsubstrat (Life Technologies, Carlsbad , Californien). Udviklingsreaktionerne blev stoppet med 2 mol H2SO4, og absorbansen blev målt ved 450 nm med korrektionsbølgelængden sat til 630 nm (OD450 2 OD630). Til beregning af endepunktstiteren for bindingsantistoffer blev data lineariseret ved at plotte log10 af serumfortyndinger versus de korrigerede optiske densitet (OD) værdier (OD450 2 OD630) inden for den lineære del af kurven (y 5 kx 1 b , r2 > 0,99), og serumfortyndingen, ved hvilken den justerede OD-værdi (OD450 2 OD630) 5 0 blev beregnet for at give en slutpunktstiter. Antigenspecifikke IgG-antistoffer i peptidimmuniserede mus blev vurderet ved peptidbaseret ELISA. Kort fortalt blev 96-brønds ELISA-plader (Thermo Fisher Scientific) coatet med 1 mg pr. brønd af 4 blandede peptider (peptider 318, 356, 510 og 530) i carbonatbuffer (pH 9,6) natten over ved 48C. Efter blokering med PBS-T indeholdende 5 % fedtfri mælk blev brøndene inkuberet med serumprøver fortyndet ved 1:40 i 1 time ved 378°C. Efterfølgende blev pladerne vasket og inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret anti-muse IgG-antistof (Abcam). Reaktioner blev visualiseret med tetramethylbenzidinsubstrat (Life Technologies), og absorbansen ved 450 nm blev målt efter stop af reaktioner med 2 mol H2SO4.

Pseudovirus produktion og titrering

Det kodonoptimerede gen, der koder for SARS-CoV-2 (NC_045512) eller SARS-CoV (AY291315.1) spikeprotein med C-terminal 19 aa deletion eller MERS-CoV (JX{{10 }}) spidsprotein trunkeret med C-terminal 16 aa blev klonet i henholdsvis pcDNA3.1(1) vektor. HEK 293T-celler dyrket i en 100 mm vævskulturskål blev cotransficeret med 1 mg af et plasmid, der koder for spikeprotein og 15 mg af en env-deficient, luciferase-udtrykkende rygrad (pNL4-3.luc.RE) under anvendelse af polyethylenimin (Polysciences) Warrington, Pa). Pseudovirus-holdige cellekultursupernatanter blev opsamlet 48 timer efter transfektion, filtreret og opbevaret ved 2808°C i alikvoter. Til bestemmelse af virustitere (50 % vævskultur infektiøs dosis) blev seriefortyndinger af pseudovirus tilsat til 1 3 104 Huh7-celler forudsået i 96-brøndsplader. Efter 12 timers infektion blev det virusholdige medium erstattet med et frisk vækstmedium, og cellerne blev dyrket i yderligere 48 timer. Luciferaseaktivitet af cellelyse blev målt med Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, Wisc) under anvendelse af en mikropladelæser (BioTek Instruments, Winooski, Vt), og brønde, der producerede relative luminescensenheder højere end 10 gange den gennemsnitlige baggrundsværdi, blev overvejet positiv.

Pseudovirus neutraliseringsassay

Varmeinaktiverede serumprøver fra COVID-19-patienter eller raske donorer blev 2-fold seriefortyndet og inkuberet med 200 pseudovira ved 50 % vævskulturinfektiøs dosis i 1 time ved 378C. Blandingerne blev derefter påført til at inficere Huh7-celler forudsået i 96-brøndsplader i to eksemplarer. Brønde blev genopfyldt med frisk vækstmedium 12 timer efter infektion, og luciferaseaktiviteten af ​​celler blev bestemt 48 timer senere. 50 % neutraliseringstiterne (NT50) mod SARS-CoV-2 og SARS-CoV-pseudovirus blev beregnet ved ikke-lineær regression ved hjælp af GraphPad Prism 8.0-software (GraphPad Software, La Jolla, Calif); og NT50 af MERS-CoV pseudovirus blev defineret som den højeste fortynding af serum, der resulterede i en 50 % reduktion af relative luminescensenheder sammenlignet med viruskontrollen uden at påføre serumprøver.

Protein mikroarray-baseret cytokindetektion

Den kvantitative måling af flere cytokiner (IL-1a, IL-1b, IL- 4, IL-6, IL-8, IL-10 , IL-13, MCP-1, IFN-g og TNF-a) i serumprøver blev udført under anvendelse af et multipleks ELISA-array (RayBiotech, Peachtree Corners, Ga) i henhold til producentens protokol. Kort fortalt blev objektglas præcoatet med cytokinspecifikke antistoffer blokeret med prøvefortyndingsmiddel ved stuetemperatur i 30 minutter, efterfulgt af tilsætning af 60 ml 2-fold fortyndede serumprøver eller cytokinstandardfortyndinger. Efter inkubation natten over ved 48°C blev objektglassene vasket 5 gange og farvet med 80 ml biotinyleret detektionsantistofcocktail og derefter Cy3-ækvivalent farvestofkonjugeret streptavidin ved stuetemperatur i 1 time. Fluorescensintensiteten blev detekteret af InnoScan 300 mikroarray-scanneren (Innopsys, Chicago, Ill) ved 532 nm, og data blev analyseret med Q-Analyzer-software (RayBiotech).

Peptidsyntese og konjugering med bovint serumalbumin

I alt 515 peptider (15 aa i længden, overlappende med 11 aa), der dækker SARS-CoV-2-proteomet, blev syntetiseret af GL Biochem (Shanghai, Kina) på basis af aminosyresekvensen af ​​SARS-CoV -2 stamme Wuhan-Hu-1. Peptider blev konjugeret med bovint serumalbumin (BSA) under anvendelse af tværbinderen Sulfo-SMCC (Thermo Fisher Scientific) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev Sulfo-SMCC tilsat med 30-fold molært overskud til BSA efterfulgt af dialyse til PBS. Efterfølgende blev peptidet indeholdende cystein tilsat i et forhold på 1:1 (vægt/vægt), inkuberet i 2 timer og yderligere dialyseret med PBS for at eliminere frie peptider.

Peptid mikroarray fabrikation

For at forberede peptidmikroarrayet, peptider af SARS-CoV-2, såvel som den negative kontrol (BSA) og positive kontroller (anti-humane IgG og anti-humane IgM-antistoffer; Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo) , blev immobiliseret på PATH-substratglas (Grace Bio-Labs, Bend, Ore) i tre eksemplarer under anvendelse af en Super Marathon-printer (Arrayjet, Edinburgh, Skotland, Storbritannien). Derefter blev peptidmikroarrays bevaret ved 2808C til yderligere anvendelse.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Mikroarray-baseret epitopkortlægning

Mikroarray-baseret serumanalyse blev udført som Li et al,37 med mindre modifikationer. For at skabe individuelle kamre til de identiske subarrays blev en 14-kammergummipakning monteret på hvert peptidmikroarray-glas. Slide-arrayerne blev opvarmet til stuetemperatur før brug og derefter blokeret med 3% BSA i PBS-T i 3 timer. Serumprøverne fra COVID-19-patienter eller poolede sera fra 20 raske donorer (kontrolgruppe) blev fortyndet ved 1:200 i PBS-T for de fleste prøver og derefter inkuberet med hver subarray i 2 timer kl. 48C. Arrays blev vasket med PBS-T og inkuberet med Cy3-konjugeret gede-anti-humant IgG og Alexa Fluor 647-konjugeret æsel-anti-humant IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa) ved 1:1000 fortynding hver i 1 time ved stuetemperatur. Efter inkubation blev arrays vasket med PBS-T og derefter tørret fuldstændigt ved centrifugering ved stuetemperatur. Efterfølgende blev arrays scannet ved hjælp af en LuxScan 10K-A mikroarray-scanner (CapitalBio, Beijing, Kina), og FL-fluorescensintensitetsdataene blev opnået og analyseret af GenePix Pro 6.0-software (Molecular Devices, Sunnyvale, Californien).

FIG 1. Længdegående dynamik af antistofresponser hos COVID-19-patienter. Et skema over undersøgelsens design. I alt 31 SARS-CoV-2-inficerede individer og 20 raske donorer blev indskrevet i undersøgelsen. Serumprøvetagning blev udført longitudinalt på flere tidspunkter for 20 patienter blandt 31 SARS-CoV-2-inficerede individer, mens prøveudtagning på et enkelt tidspunkt blev udført for de andre 11 patienter. Antallet af deltagere og serumprøver anvendt i forskellige assays er opført. B og C, I alt 101 serumprøver fra 31 COVID-19-patienter blev testet med ELISA for SARS-CoV-2 N-protein (B) og S-protein (C)-bindende IgG-antistoffer på forskellige tidspunkter efter symptomdebut (dage 1-30, n 5 37; dage 31-61, n 5 18; dage 100-150, n 5 21; dage {{21 }}, n 5 25). Serumprøver fra 20 raske donorer blev inkluderet som kontrolgruppe. D, NT50 mod SARS-CoV-2 pseudovirus over tid blev beregnet ved ikke-lineær regression. E, Fordeling af serumneutraliserende aktivitet hos COVID-19-patienter på angivne tidspunkter efter sygdomsdebut er præsenteret. Prøver med en NT50-titer under 20 blev defineret som ingen neutraliserende

Peptid mikroarray dataanalyse

IgG- og IgM-dataene blev henholdsvis analyseret. Signalintensiteten af ​​hver plet blev defineret som forgrunden minus baggrunden og gennemsnittet af de tredobbelte pletter for hvert peptid. Cutoff-værdien for det positive peptidrespons af COVID-19-prøver blev sat til det dobbelte af signalintensiteten af ​​den raske donorkontrol. Peptider med positive rater over 80 % blandt prøver testet på alle 3 prøvetagningstidspunkter (dage 10-60, 100-150 og 180-220 efter sygdomsdebut) blev defineret som dominante og persistente peptider og peptider med en positiv svarfrekvens på over 60 % på alle 3-tidspunkter blev betragtet som subdominerende og vedvarende. Den gennemsnitlige signalintensitet for hvert peptid i 3 prøveudtagningstidspunktgrupper blev beregnet; peptider, der viste høj signalintensitet (over middelværdien 1 SD for signalintensiteter for alle testede prøver) blev også udvalgt. Databehandling og analyse blev udført af R v3.6.3-software (https://www.r-project.org/), og signifikante signalintensitetsændringer blandt forskellige samplingstidspunktgrupper blev evalueret baseret på Limma. Forskelle med P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante.

Immunisering af mus

BALB/c hunmus i alderen 6 til 8 uger blev købt fra Beijing Vitalstar Biotechnology (Beijing, Kina). Alle mus blev anbragt i specifikke patogenfrie faciliteter, og dyreforsøget blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Tianjin Medical University (Tianjin, Kina). Til immunisering blev grupper af mus (n 5 5) injiceret intramuskulært med 25 mg pr. dosis af hvert peptid (hhv. peptid 318, 356, 510 og 530) blandet med 50 mg alun (InvivoGen, San Diego, Californien) og 10 mg CpG-adjuvanser og boostet to gange med 50 mg pr. dosis peptider i nærværelse af adjuvanser med 2-ugers intervaller. Vaccination med adjuvanser alene tjente som den negative kontrol. Sera blev opsamlet fra immuniserede mus på dag 10 eller dag 14 efter den anden og tredje immunisering.

Statistiske og strukturelle analyser

Alle grafer blev plottet af GraphPad Prism. Statistiske sammenligninger mellem grupper i fig. 1, 2 og 4 blev udført ved 1-måde ANOVA med Tukey-multipel sammenligning. Korrelationer vist i Fig. 1 Fig. E9 og Fig. E10 i Online Repository tilgængeligt på www.jacionline.org blev bestemt ved Pearson-korrelationsanalyse. Forskelle med P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante. Strukturerne af SARS-CoV-2 spidsprotein (Protein Data Bank [PDB; http://www.wwpdb.org/] ID: 6VXX og PDB ID: 6ZGI) og dimeriseringsdomænet af SARS-CoV{{ 13}} nukleocapsidprotein (PDB ID: 6YUN) blev brugt til at dissekere de strukturelle detaljer af identificerede epitoper lokaliseret på spidsproteinet og dimeriseringsdomænet af nukleocapsidproteinet. Sekvensjustering og homologianalyse blandt forskellige humane coronavirus blev udført af Clustal W-algoritmen i MEGA v10.1.6-software.

RESULTATER

SARS-CoV-2-infektion inducerer vedvarende antigenspecifik binding og neutraliserende antistoffer

For at vurdere antistofreaktioner i længderetningen efter SARS-CoV-2-infektion blev der indsamlet 101 serumprøver fra 31 personer med PCR-bekræftet SARS-CoV-2-infektion (Fig. 1, A). Undersøgelsesdeltagere inkluderede 26 patienter med moderat COVID-19, 1 med asymptomatisk præsentation, 2 med mild sygdom og 2 med svære symptomer (se tabel E1 i online-depotet tilgængeligt på www.jacionline.org). Patienter inkluderet i denne undersøgelse varierede fra 17 til 66 år (medianalder, 45 år), med en omtrent ligelig fordeling af mandlige (51,6 %) og kvindelige (48,4 %) forsøgspersoner. De mest almindelige symptomer blandt deltagerne i undersøgelsen omfattede feber (83,9 %), hoste (67,7 %), myalgi (22,6 %) og kulderystelser (22,6 %) med en median varighed af sygdom på 15 dage. I alt 90 serumprøver fra 20 COVID-19-patienter blev indsamlet under indlæggelse og udskrivelse efter bedring på flere tidspunkter op til 219 dage efter symptomdebut (fig. 1, A og se tabel E2 i online-depotet). Prøvetagning fra de andre 11 deltagere blev udført på et enkelt tidspunkt under sen rekonvalescens (dage 122 til 214 efter symptomdebut). Derudover blev prøver fra 20 raske donorer med matchende alders- og kønsfordeling inkluderet som kontrolgruppe (tabel E1). Antigenspecifikke IgG-antistoffer i serumprøver blev kvantificeret ved ELISA præcoated med SARS-CoV-2 N-protein eller S-protein. Sammenlignet med raske donorer blev både anti-N- og anti-S IgG-antistoffer udviklet hos COVID-19-patienter inden for 30 dage efter symptomernes begyndelse, med en geometrisk gennemsnitlig slutpunktstiter på 4,10 (log10 anti-N IgG) og 4.20 (log10 anti-S IgG) (Fig. 1, B og C; og se Tabel E3 i Online Repository på www.jacionline.org; Fig. E1, A og B; og Fig. E2), i overensstemmelse med tidligere observationer, at serokonversion opstår 1 til 2 uger efter SARS-CoV-2-infektion.5,38 Bagefter faldt antigenbindende antistoftitre i varierende grad over tid. Hurtigt og dramatisk faldende anti-N IgG-antistofniveauer blev observeret hos COVID-19-patienter, hvorimod højere niveauer af anti-S IgG-titre blev opretholdt op til 180 til 220 dage efter sygdomsdebut sammenlignet med raske donorer (fig. 1, B) og C). Korrelationsanalyse afslørede en signifikant korrelation mellem log10 anti-N IgG titere og anti-S IgG titere (r 5 0.50 og P <.001; Fig. 1, F). Ud over at kvantificere bindingsantistoffer blev dynamikken af ​​funktionelle neutraliserende antistoffer hos individer med COVID-19 yderligere bestemt ved hjælp af pseudotypebestemt SARS-CoV-2. Over 95 % af patienternes serumprøver (35/37) indsamlet mellem 4 og 30 dage efter symptomdebut havde robuste neutraliserende aktiviteter mod SARS-CoV-2, og en stor del af prøverne udviste moderate (NT50 80-320 ) til stærk (NT50 > 320) neutraliserende aktivitet (fig. 1, D og E). Det skal bemærkes, at 2 prøver med ingen eller lave neutraliserende titere (NT50 ved en minimumserumfortynding på 1:20) blev indsamlet i en tidlig periode efter virusinfektion (på dag 4 og dag 11 efter symptomdebut), før de fremkaldte potente neutraliserende antistoffer (fig. 1, D og Fig. E1, C). På trods af faldende niveauer af SARS-CoV-2-neutraliserende antistoffer i COVID{104}}-patienter over tid, var de fleste patientserumprøver (24/25) opnået i løbet af 180 til 220 dage efter symptomdebut vedvarende positivitet for neutralisering mod SARS- CoV-2, med et 2.8--fold fald i geometriske middelværdier af NT50-titere (Fig. 1, D og E; Tabel E3; Fig. E3). Som forventet blev der, sammenlignet med anti-N IgG-antistoffer, identificeret en stærkere korrelation mellem SARS-CoV-2 S-bindende IgG-titre og neutraliserende antistoftitre (r 5 0.61 og P < .001; Fig. 1 , G og H), i overensstemmelse med resultaterne af, at SARS-CoV-2 S-protein er hovedmålet for neutraliserende antistoffer. S-proteinet i SARS-CoV-2 deler en høj sekvenslighed med meget virulent SARS-CoV (76 % sekvensidentitet) og viser en lav sekvenshomologi med MERS-CoV (34 % sekvensidentitet). Serologisk krydsreaktivitet blandt coronavirus er blevet rapporteret; 8,10,28,29 men data om longitudinelle opfølgningsevalueringer af krydsreaktivitet af antistoffer mod SARS-CoV-2 mod andre coronavirus er fortsat begrænsede. Vi bestemte krydsbinding og krydsneutraliserende antistoffer i longitudinelle sera fra SARS-CoV-2-inficerede individer. Resultaterne viste, at mere end 80 % af patienternes serumprøver bandt til S-proteiner af SARS-CoV og/eller MERS-CoV inden for 1 måned efter symptomdebut, hvor 27 % af prøverne udviste dobbelt krydsreaktivitet (fig. 1, I). Reaktivitet over for SARS-CoV S-protein havde en større andel (73 %) end MERS-CoV (35 %) blandt prøver testet i en tidlig periode (1-30 dage efter sygdomsdebut) (Fig. 1, I). De dobbelte krydsbindings- og SARS-CoV-krydsbindende antistoffer udviste et gradvist fald over tid, med kun 8 % dobbelt krydsbinding og 20 % SARS-CoV enkelt krydsbindingsprøver 180 til 220 dage efter sygdomsdebut (fig. , I; i onlinelageret tilgængeligt på www.jacionline.org, se fig. E4, A; fig. E5, A; og fig. E6 i denne artikels onlinelager på www.jacionline.org). Spændende nok forblev positiviteten af ​​MERS-CoV S-proteinreaktive antistoffer relativt konstant over tid (fig. 1, I). Forskellig fra den høje krydsbindingskapacitet krydsneutraliserede kun et lille antal patienters serumprøver SARS-CoV og/eller MERS-CoV pseudovirus (Fig. 1, I; Fig. E4, B; Fig. E5, B; og se Fig. E7 i Online-depot). Cirka 27 % af prøver indsamlet 1 til 30 dage efter symptomdebut viste krydsneutraliserende aktivitet, og dette tal faldt til 20 % efter 180 til 220 dage med mere dramatiske ændringer i SARS-CoV krydsneutraliserende aktivitet (fig. 1, I ). En højere andel af prøver krydsneutraliserede SARSCoV end MERS-CoV inden for 30 dage efter sygdomsdebut. Det er værd at bemærke, at på trods af lignende andele af prøver, der viste SARS-CoV og MERS-CoV krydsneutralisering, var NT50-værdierne for MERS-CoV meget lavere end for SARSCoV blandt serumprøver, der var positive for krydsneutralisering (Fig E4, B; Fig. E5, B; Fig. E7).

cistanche planteforøgende immunsystem

SARS-CoV-2-infektion resulterer i aktivering af cytokinproduktion

For at kunne karakterisere de immunologiske ændringer efter SARS-CoV-2-infektion, vurderede vi yderligere ændringer i dynamikken i cytokinniveauer i sera fra COVID-19-patienter. 55 longitudinelle serumprøver, der blev indsamlet inden for de første 2 måneder efter symptomdebut, blev brugt til påvisning af cytokinproduktion ved hjælp af proteinbaseret mikroarray. Forhøjede serumniveauer af flere cytokiner blev observeret i løbet af den første måned af sygdom, inklusive IL-1a (proinflammatorisk), IL-6 (proinflammatorisk) og IL-10 (anti-inflammatorisk ), som er blevet forbundet med cytokinfrigivelsessyndrom i alvorlige COVID-19-tilfælde,39,40 samt IFN-g (TH1-type) og IL-4 (TH2-type) (Fig. 2, A, og Fig. E8 i Online Repository tilgængeligt på www.jacionline.org). Specifikt steg serumniveauerne af IL-6, IL-10 og IFN-g inden for 15 dage efter symptomernes begyndelse hos patienter og faldt i senere faser, hvorimod frigivelsen af ​​IL-1 a og IL-4 viste sig at være bemærkelsesværdigt øget i løbet af 16 til 30 dage fra sygdomsdebut og faldt hurtigt til normal efterfølgende (fig. 2, A). Korrelationsanalyse indikerede en svag eller ingen lineær sammenhæng mellem antigenspecifikke antistofresponser og cytokinproduktion efter SARS-CoV-2-infektion, selvom der blev observeret en statistisk signifikans mellem niveauer af IL-10 og SARS-CoV{{ 34}} N-proteinbindende antistof (r 5 0.321 og P < .05), mellem IL-1b-produktion og S-proteinbindende antistof (r 5 20.335 og P<.05), and between TNF-a and S protein binding antibody levels (r 5 20.335 and P <.05; see Fig E9 in the Online Repository). To allow direct visualization and comparison among patient samples across multiple cytokine responses over time, we constructed a heat map showing fold changes in cytokine release relative to the healthy donor control group (Fig 2, B). Consistent with our findings presented above, elevated serum cytokine levels after SARS-CoV-2 infection were predominantly observed during the acute phase and an early period of convalescence (within 30 days after disease onset) (Fig 2, A and B). Among cytokines tested, proinflammatory IL-6 exhibited the most robust response, with a 4.9-fold increase and a 2.9-fold increase on average for samples collected during 1 to 15 days and 16 to 30 after onset of symptoms, respectively (Fig 2, B). Of note, 1 serum sample (sample Pt-S22, collected on day 18 after disease onset) obtained from a COVID–19–infected individual with moderate disease, exhibited a marked increase in the production of multiple proinflammatory cytokines, including IL-1a, IL-1b, IL-6, and TNF-a (Fig 2, B). Additionally, hyperproduction of cytokines including IL- 1a, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, and IFN-g was also detected in 1 sample (sample Pt-S11, collected at day 15 after disease onset) collected from a severe case of COVID-19; presumably, these are associated with disease severity and outcome (Fig 2, B). These results indicate broad inflammatory activation and changes over time involving the concomitant release of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as well as TH1-type and TH2-type cytokines in COVID-19 patients.

Proteomdækkende epitopkortlægning identificerer dominante epitoper, der medierer vedvarende humorale immunresponser hos COVID-19 patienter

For bedre at karakterisere de karakteristiske træk ved humoral immunitet over for SARS-CoV-2 over tid anvendte vi en proteomomfattende epitopkortlægning ved hjælp af peptidbaserede mikroarrays. Et peptidbibliotek, der dækker SARS-CoV-2-proteomet, blev genereret og immobiliseret på objektglas, hvor hvert peptid var 15 aa langt med en 11 aa overlapning. I alt 51 longitudinelle serumprøver fra 19 patienter med enten asymptomatisk (n 5 1) eller mild (n 5 2) til moderat (n 5 15) eller svær (n 5 1 ) SARS-CoV-2-infektioner blev testet (tabel I). For at opnå relativt afbalancerede prøveudtagningstal, intervaller og tidspunkter blev prøver indsamlet sekventielt på 2 eller 3 tidspunkter fra hver COVID{18}}-deltager i området fra 16 til 219 dage efter symptomdebut. Størstedelen af ​​patienterne (18/19) genererede neutraliserende antistoffer efter virusinfektion, bortset fra det enkelte individ med asymptomatisk infektion (tabel I). I henhold til de forskellige prøvetidspunkter blev prøverne opdelt i 3 grupper: dage 10-60 (n 5 18), dage 100-150 (n 5 18) og dage {{28 }} (n 5 15). Longitudinel vurdering af virusepitop-pro-filer i COVID-19-patienter blev udført for både serum-IgG- og IgM-antistoffer, med poolede sera fra 20 raske donorer brugt som negativ kontrol. Ved at bruge SARS-CoV-2-proteom-mikroarrayet blev kinetikken af ​​peptidbindende antistofresponser bestemt og analyseret for (1) bindingssignalintensitet og (2) procentdel af positive-reaktive prøver (positiv hastighed) for hvert peptid . Baseret på cutoff-værdien for et positivt peptidbindende respons, som blev sat til det dobbelte af signalintensiteten af ​​den negative kontrol, identificerede vi i alt 460 positive peptider for IgG og 479 positive peptider for IgM, der var reaktive med mindst 1 patient serumprøve. Positive peptidtal og fordelingen af ​​responser på tværs af forskellige åbne læserammer (ORF'er) af SARS-CoV-2 var relativt stabile blandt forskellige prøveudtagningsgrupper, med en tendens til et let fald i positive peptidtal over tid (fig 3, EN). Den største reaktivitet blev identificeret i replikasepolyproteinet ORF1ab, som er den største ORF, der omfatter mere end to tredjedele af hele genomet (fig. 3, A). Interessant nok observerede vi moderate til stærke grader af korrelation mellem positive peptidbindingsresponser og serumcytokinniveauer tidligt efter SARS-CoV-2-infektion (dage 10-60 efter sygdomsdebut; se Fig. E10 i Online-depotet på www.jacionline.org). Antallet af positive bindingspeptider for IgM blev vist at være forbundet med serumniveauer af IL-6 og IL-10; ligeledes viste den gennemsnitlige signalintensitet af totale reaktive peptider og den for ORF1ab-bindende peptider for IgM positive associationer med IL-6- og IFN-g-produktion i serumprøver. Disse data tyder på, at ændringer i cytokinniveauer efter SARS-CoV-2-infektion kan påvirke størrelsen og bredden af ​​epitoper, der genkendes af antigenspecifikke humorale responser. Baseret på identifikation af positive epitoper udvalgte vi yderligere de mest almindelige epitoper, der konsekvent forblev reaktive i mere end 80 % af COVID-19-prøverne blandt hver af de 3 prøveudtagningsgrupper (benævnt dominante og persistente epitoper). Resultater afslørede, at disse stærkt dominerende epitoper, der er i stand til at mediere langsigtede humorale immunresponser, var lokaliseret ved SARS-CoV-2 ORF1ab-polyproteinet og S-proteinet, med flere epitoper genkendt af IgM-antistoffer (n 5 33) end IgG-antistoffer (n 5 10) (Fig. 3, B og Tabel II; se Fig. E11 og Fig. E12 i Online Repository på www.jacionline.org). ORF1ab-polyproteinet havde det maksimale antal dominante epitoper, der medierede langsigtede responser, og epitoper var bredt fordelt på regionerne af ikke-strukturelle proteiner (nbsp) 2-5, nbsp 8-10, nbsp 12-14, og nbsp 16 (tabel II). Vi identificerede især én immundominant epitop, 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), der kunne genkendes af IgG- og IgM-antistoffer fra 100 % af COVID-19-patienterne, uanset tidspunkter for serumprøvetagning (fig. 3, B og tabel II; se fig. E13 og fig. E14 i online-arkivet). Dette meget reaktive peptid er placeret inden for helicase (nsp 13)-regionen af ​​ORF1ab-polyproteinet, som er essentielt for at afvikle dobbeltstrengede RNA-skabeloner under SARS-CoV-2-replikation.41 Blandt udvalgte peptider af ORF1ab, 2 immundominante peptider med de højeste gennemsnitlige signalintensiteter genkendt af IgG-antistoffer, nummer 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) og nummer 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), er begge placeret på nsp 13. For IgM-responser, peptid 685 (ORF1ab, aa 249-263) på nsp 2 og peptid 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) på nsp 13 præsenterede de mest robuste bindingsintensiteter (fig. 3, B). I betragtning af variationen i basislinjesignaler (poolet sera fra raske donorer) for forskellige peptider (fig. 3, B), beregnede vi yderligere foldændringer af signalintensiteter vedrørende hvert nøglepeptid i forhold til den raske kontrolgruppe. Resultaterne viste, at peptid 2073 (IgG-binding) og peptid 1985 (IgM-binding) placeret på nsp 13-regionen opretholdt de øverste peptidbindingsintensiteter (foldændring) blandt patientsera opsamlet i op til 180 til 220 dage (Fig. E13 og Fig. E14).

FIG 2. Kinetik af cytokinproduktion hos COVID-19 patienter. Sv: Cytokinproduktionsniveauerne i 55 serumprøver indsamlet fra 16 COVID-19-patienter under den akutte fase og et tidligt stadie af rekonvalescens blev påvist ved protein-mikroarray-baseret ELISA (dage 1-15, n) 5 11; dage 16-30, n 5 26; dage 31-61, n 5 18; sunde donorer, n 5 20). Hver prik repræsenterer en individuel serumprøve; stiplede linjer angiver grænsen for detektion. Statistisk signifikans blev bestemt ved 1-måde ANOVA med Tukey multiple sammenligninger. *P <.05, **P <.01 og ****P <.0001. B, foldændring af hvert cytokinproduktionsniveau hos COVID-19-patienter vist i (A) sammenlignet med middelværdierne af 20 prøver fra raske donorer. Hver kolonne angiver en særskilt serumprøve indsamlet fra angivne tidspunkter efter symptomernes begyndelse; hver række repræsenterer 1 individuelt testet cytokin.

TABEL I. Karakteristika for COVID-19-patienter og prøvekohorter i epitopkortlægning

FIG 3. IgM- og IgG-genkendelse af dominante epitoper, der bidrager til langsigtede antistofresponser hos SARS-CoV-2-inficerede individer. Longitudinel analyse af serumgenkendelse af epitoper hos 19 individer med COVID-19 ved hjælp af et peptidmikroarray, der dækker proteomet af SARS-CoV-2. Cutoff-værdien for det positive respons af peptidbinding i patientprøver (n 5 51) ​​blev sat til det dobbelte af signalintensiteten af ​​de poolede sera fra 20 raske donorer. A, Peptidtal og fordeling af positive bindingspeptider, der var påviselige i 1 eller flere prøver indsamlet efter 10-60 dage (n 5 18), 100-150 dage (n 5 18), og 180- 220 dage (n 5 15) efter sygdomsdebut. Tal angiver de samlede identificerede IgG- og IgM-epitoper fra hver ORF. B, Signalintensiteter af dominerende og vedvarende IgG- og IgM-epitoper (x-akse), der var bæredygtigt reaktive i mere end 80 % af prøverne inden for alle 3 prøvetagningstidspunkter. Hver prik angiver det samlede sera fra raske donorer (øverst) eller en særskilt patientserumprøve, der er indsamlet fra angivne tidspunkter efter symptomdebut. E, kappeprotein.

TABLE II. Epitopes with >80 % positiv rate på alle 3 prøvetagningstidspunkter

Dominante og vedvarende epitoper af SARS-CoV-2 S-protein er lokaliseret ved NTD- og S2-underenheder

I alt 4 dominante og persistente epitoper fra SARSCoV-2 S-proteinet blev identificeret: peptid 318 (S, aa 45-59) og peptid 356 (S, aa 197-211), som er lokaliseret inden for NTD-regionen; peptid 510 (S, aa 813-827), som dækker S2'-spaltningsstedet og dele af FP af S2-underenheden, og peptid 530 (S, aa 893-907), som er placeret i forbindelsesområdet mellem FP og den første heptad-gentagelsesregion af S2-underenheden (fig. 3, B og tabel II). Blandt disse nøglepeptider af S-protein, som vi valgte, besad peptid 318, placeret ved NTD af S-proteinet, den mest robuste bindingsintensitet (foldændring i forhold til kontrollen; Fig. E13 og Fig. E14). Strukturelle analyser afslørede, at disse epitoper er fuldstændigt eksponeret på overfladen af ​​monomert S-protein; nogle rester af epitoper for peptid 318, 356 og 530 er imidlertid skjult under overfladen af ​​det trimere S-protein (fig. 4, A og B), hvilket tyder på, at både S-monomer- og trimerstrukturer genkendes effektivt af værtens immunsystem under visse omstændigheder. For at være specifik eksponeres 2 loop-segmenter af peptid 318 (aa 45-46 og aa 56-59) på det trimere S-protein med den centrale b-streng begravet indeni; og de fleste rester af peptid 356 er tilgængelige på overfladen, inklusive en kerne b-streng (aa 203-209) og et loop-segment (aa 210-211). Peptid 510 indeholder et S2'-spaltningssted og en central helix af FP, som begge er fuldt præsenteret på overfladen af ​​S-protein; rester af peptid 530 er for det meste kryptiske, med kun en lille del af løkken (aa 893-895) eksponeret på det trimere S-protein (fig. 4, C). Sekvenshomologianalyse blandt 7 almindelige humane coronavirusser afslørede, at 2 epitoper lokaliseret ved S2-underenheden (peptiderne 510 og 530) deler høj sekvensidentitet med andre coronavirusser, hvilket tyder på serologisk krydsreaktivitet rettet mod disse epitoper blandt humane coronavirusser (Fig. 4, D). Sekvensen af ​​peptid 318 udviste høj lighed med SARSCoV, mens et lavt niveau af sekvenshomologi for peptid 356 blev vist blandt coronavirus, hvilket tyder på SARS-CoV-2-specifikke antistofresponser rettet mod denne region (fig. 4, D). I betragtning af nye fremkommende og cirkulerende SARS-CoV-2 varianter globalt udførte vi yderligere sekvensjustering med hensyn til nøgleepitoper af S-proteinet mellem den tidlige SARS-CoV-2-stamme (Wuhan-Hu{{52} }) og 5 varianter af bekymring (Alfa, Beta, Gamma, Delta og Omicron), samt 2 varianter af interesse (Lambda og Mu), i henhold til Verdenssundhedsorganisationens klassificering af variantvirus (opdateret den 30. november 2021) ). Resultater viste, at sekvenser af disse dominante og vedvarende epitoper er næsten identiske blandt analyserede varianter, bortset fra en enkelt N211I-mutation identificeret i den nye Omicron-variant (Fig. 4, E). Disse data indikerer, at antistoffer genereret af tidlige SARS-CoV-2-stammer konsekvent kan genkende nuværende cirkulerende varianter, og at disse dominerende epitoper kan være i stand til at mediere vedvarende langsigtede antistofresponser på infektion af SARS-CoV-2 varianter. For yderligere at bestemme de immunologiske karakteristika af identificerede epitoper på S-proteinet og for yderligere at undersøge den potentielle værdi af disse S-proteinepitoper som peptidvaccinekandidater, udførte vi en museimmuniseringsundersøgelse under anvendelse af udvalgte peptider. BALB/c-mus blev inokuleret 3 gange med hvert peptid i nærvær af alun og CpG-adjuvanser (fig. 4, F). Blandt de 4 udvalgte peptider fremkaldte vaccination med peptid 356 antigenspecifikke antistoffer efter den anden og tredje dosis (fig. 4, G). Resultaterne af serumneutraliseringsassayet afslørede, at immunisering med lineære peptider ikke genererede signifikante niveauer af neutraliserende antistoffer mod SARS-CoV-2 (Fig. 4, H), hvilket tyder på, at disse lineære peptider fungerer dårligt til at inducere robuste neutraliserende antistofresponser.

N-protein af SARS-CoV-2 mangler de fleste reaktive epitoper, der medierer holdbare antistofresponser efter virusinfektion

En række undersøgelser har belyst den potente antigenicitet af SARS-CoV-2 N-proteinet.4,11,12 Vi formåede imidlertid ikke at identificere dominante og persistente epitoper lokaliseret ved N-proteinet på basis af de nuværende selektionskriterier (over 80 % positiv rate ved alle 3 prøveudtagningstidspunkter). Til longitudinel evaluering af epitopprofiler af N-proteinet hos individer med COVID-19 udførte vi en anden runde epitopscreening, der var baseret på data opnået fra peptidmikroarrayet til udvælgelse af subdominante epitoper, der konsekvent forblev positiv reaktivitet i mere end 60 % af COVID-19-prøverne for hvert af de 3 prøvetidspunkter (kaldet subdominante og persistente epitoper). I alt 4 subdominante og persistente epitoper af SARS-CoV-2 N-proteinet blev identificeret, blandt hvilke peptid 2455 (N, aa 213-227) viste reaktivitet over for både IgG- og IgM-antistoffer i COVID{{16 }} patienter med relativt højere niveauer af signalintensitet (fig. 5, A og B, og se tabel E4 i online-arkivet på www.jacionline.org). De 2 overlappende peptider, peptid 2455 (N, aa 213-227) og peptid 2456 (N, aa 217-231), er placeret i den Ser/Arg-rige linker-region mellem det N-terminale RNA-bindingsdomæne og C-terminalt dimeriseringsdomæne af N-proteinet. Peptid 2482 (N, aa 321-335) og peptid 2491 (N, aa 357-371) er helt eller delvist placeret inden for dimeriseringsdomænet af N-proteinet (tabel E4). På grund af manglen på 3-D-strukturer vedrørende den intakte konformation af N-proteinet, udførte vi kun strukturelle analyser af 2 identificerede epitoper på den dimere struktur af det C-terminale dimeriseringsdomæne. Rester af peptid 2482 danner 2 b-strenge, der er arrangeret på en antiparallel måde i dimeriseringsgrænsefladerne, hvorimod aa 357-364 af peptid 2491 danner helix-baserede strukturer, der er placeret i modsatte ender af dimeren (fig. 5, C) . Sekvensjustering mellem tidlig SARS-CoV-2 (stamme Wuhan-Hu-1) og 7 nye varianter afslørede yderligere, at sekvenser af disse subdominante og persistente epitoper i N-protein er næsten identiske blandt nuværende cirkulerende varianter, med en enkelt G215C-substitution af peptid 2455, der forekommer i Delta-varianten, og en enkelt G214C-mutation af peptid 2455 identificeret i Lambda-varianten, hvilket tyder på, at antistoffer, der retter sig mod disse peptider, potentielt genkender antigen fra nye SARS-CoV-2-varianter (fig. 5, D) ).

FIG 4. Dominante epitoper af SARS-CoV-2 spike protein i form af mediering af holdbare humorale immunresponser. A og B, placeringer af de dominerende og persistente epitoper på 3-D-strukturer af det monomere (A) og trimere (B) S-protein (PDB ID: 6VXX). Epitoper er fremhævet med grønt (peptid 356, aa 197-211), rødt (peptid 318, aa 45-59), blåt (peptid 510, aa 813-827) og lilla (peptid 530, aa 893-907), henholdsvis. De tre S-monomerer i lukket konformation er afbildet i henholdsvis grå, pink og cyan. C, Detaljeret strukturanalyse af dominante epitoper i SARS-CoV-2 S-protein på den lukkede tilstand af S-trimeren (PDB ID: 6VXX). D, Sekvensjustering af identificerede epitoper blandt almindelige humane coronavirus. Epitoprester, der er bevaret mellem SARS-CoV-2 og andre humane coronavirus, er gråtonet. E, Epitopbevaringsanalyse af den tidlige SARS-CoV-2 (stamme Wuhan-Hu-1) og 7 nye varianter. Sorte prikker repræsenterer identiske rester mellem Wuhan-Hu-1-stammen og den angivne.

FIG 5. Subdominante epitoper lokaliseret ved SARS-CoV-2 nukleocapsidproteinet er i stand til at mediere vedvarende antistofresponser. A-, IgG- og IgM-genkendelsesfrekvenser af subdominante peptider (varigt reaktive i mere end 60 % prøver) blandt patientserumprøver indsamlet på flere tidspunkter efter sygdomsdebut. B, Signalintensitetskinetik af identificerede subdominante epitoper over tid. Hver prik repræsenterer en særskilt patientserumprøve opnået fra COVID-19-patienter på angivne tidspunkter efter symptomdebut. Stiplede vandrette linjer angiver cutoff-værdier for positiv respons for hvert peptid. C, Detaljeret strukturanalyse af epitoper på det C-terminale dimeriseringsdomæne af N-proteinet (PDB ID: 6YUN). Epitoper er mærket med blåt (peptid 2482, aa 321-335) ​​og brunt (peptid 2491, aa 357-364). De 2 monomere strukturer er afbildet i henholdsvis grå og cyan. D, Sekvensjusteringsanalyse af de identificerede N-proteinepitoper mellem den tidlige SARS-CoV-2 (stamme Wuhan-Hu-1) og 7 nye varianter. Sorte prikker angiver identiske sekvenser mellem Wuhan-Hu-1-stammen og den angivne variant. Ændringer i aminosyresekvens er fremhævet med rødt.

FIG 6. Liner-epitoper med høj bindingsintensitet og faldende reaktive frekvenser over tid, genkendt af SARS-CoV-2-inficerede individer. A og B, Longitudinel analyse og fordeling af identificerede peptider, der udviser høj bindingssignalintensitet (over middel 1 SD af signalintensiteter af alle testede prøver), men faldende positiv hastighed over tid. Genkendelsesfrekvensen (A) og signalintensiteten (B) af epitoper blev plottet med 3 prøvetagningstidspunkter efter symptomdebut. Hver prik i (B) står for en individuel patientserumprøve opsamlet på angivne tidspunkter efter symptomdebut; stiplede vandrette linjer angiver cutoff-værdier for positivitet for hvert peptid. Statistisk signifikansanalyse blev udført baseret på Limma of R v3.6.3-softwaren. *P < 0,05 og **P < 0,01. C, Placering og sekvenssammenligninger af 2 tilstødende epitoper, peptid 510 (dominant og persistent) og peptid 511 (høj signalintensitet og faldende positivitet over tid), på SARS-CoV-2 S-proteinstruktur (PDB ID: 6ZGI) . De overlappende områder mellem de 2 epitoper er fremhævet med grønt; unikke sekvenser er mærket med rødt og blåt.

Longitudinel serologisk analyse identificerer epitoper med høj signalintensitet, men aftagende reaktivitet over tid

Ud over de udvalgte meget reaktive epitoper, der er ansvarlige for vedvarende humorale immunresponser nævnt ovenfor, identificerede og karakteriserede vi yderligere et panel af 9 positive peptider, der viste robuste bindingsintensiteter (over middelværdien 1 SD af signalintensiteter for alle testede prøver) med en tendens til faldende reaktivitet (positive rateændringer over 20 %) blandt serumprøver fra COVID-19-patienter over tid, i overensstemmelse med en generel tendens til aftagende humorale immunresponser. Disse epitoper er placeret inden for de 3 dominerende antigener: ORF1ab-, S- og N-proteiner (Fig. 6, A; og se tabel E5 i Online Repository på www.jacionline.org). Derudover blev der observeret signifikante reduktioner i signalintensiteter af 4 peptider fra ORF1ab (peptider 784-IgG, 1617-IgM og 1986-IgM) og N (peptid 2457-IgG) proteiner mellem prøver fra en tidlig periode med prøvetagningstidspunkter (dage 10-60 efter sygdomsdebut) og den senere fase af prøvetagningstidspunkter (dage 100-150 eller dage 180-220 efter symptomdebut) (fig. 6 , B). På trods af stort set overlapning med hinanden udviste 2 peptider af S-proteinet peptid 510 (dominant og persistent; Fig. 3, B) og peptid 511 (høj signalintensitet og faldende positiv hastighed over tid; Fig. 6, A) forskellige mønstre af reaktivitet blandt patientserumprøver over tid. Sekvens- og lokaliseringsanalyse indikerede, at peptid 510 indeholder et S2'-spaltningssted og yderligere aminosyrer af 813-SKRS-816, hvorimod peptid 511 er fuldstændig inden for FP med udvidet 828-LADA{{29 }} rester, der er fuldstændigt eksponeret på overfladen af ​​trimert S-protein (fig. 6, C). Disse resultater afslørede nye træk ved epitoper, der i sidste ende kan bidrage til længerevarende og stærkere humoral immunitet mod SARS-CoV-2.

DISKUSSION

En systematisk karakterisering af langsigtede immunresponser på SARS-CoV-2-infektion er afgørende for udviklingen af ​​forbedret diagnostik, effektive terapeutiske interventioner og vacciner. I den aktuelle undersøgelse udførte vi en omfattende longitudinel analyse af COVID-19-patienter over 180 til 220 dages opfølgning, der viste vedvarende humorale immunresponser og aktiveret cytokinproduktion efter virusinfektion.

Ved at drage fordel af det peptidbaserede mikroarray, der spænder over proteomet af SARS-CoV -2, afslørede vi yderligere kinetikken af ​​epitopgenkendelse og identificerede et panel af dominante epitoper, der er i stand til at mediere langsigtet humoral immunitet. De fund, vi rapporterer her vedrørende levetiden af ​​humorale immunresponser efter SARS-CoV-2-infektion bekræfter nogle tidligere publicerede data5,10,12,13,42, men udvider dem ved at udføre dyb serologisk profilering og epitopscreening ved hjælp af longitudinelle serumprøver fra personer med COVID-19 gennem den proteomomfattende mikroarray-tilgang. I denne undersøgelse identificerede vi 4 dominante epitoper (peptid 318, 356, 510 og 530) i SARS-CoV-2 S-proteinet, der var i stand til vedvarende at reagere med mere end 80 % COVID-19-patient prøver testet, op til 180 til 220 dage efter symptomdebut. Peptid 510 (S, aa 813-827), der omfatter S2-spaltningsstedet og FP af S2-underenheden, er almindeligvis blevet identificeret i tidligere undersøgelser af andre grupper.26,28,32-34 Funktionelle analyser indikerede antistoffer målretning mod denne region kan udvise begrænset neutraliseringsstyrke mod SARS-CoV-226,33 på trods af at den er meget eksponeret på overfladen af ​​S-proteinet (fig. 4, AC). I tilfælde af peptid 530 (S, aa 893-907), som er placeret mellem FP og den første heptad-gentagelsesregion i S2-underenheden, er rester generelt begravet inde i den trimere struktur af S-proteinet, hvilket gør det svært tilgængelige via robuste neutraliserende antistoffer mod SARS-CoV-2 (fig. 4, AC). Derudover blev 2 S1-NTD-rettede peptider, der kunne mediere langsigtede antistofresponser af SARS-CoV-2, også udvalgt. Analyser vedrørende peptidsekvensen og placeringen indikerede, at rester af disse 2 peptider - peptid 318 (S, aa 45-59) og peptid 356 (S, aa 197-211) - er i umiddelbar nærhed af de rapporterede genkendte epitoper ved infektionsforøgende antistoffer23,25, men bortset fra nøglestederne for stærkt potente neutraliserende antistoffer rettet mod NTD af S1-underenheden, 16,19,43, hvilket tyder på muligheden for epitopgenkendelse af ikke-neutraliserende antistoffer mod disse 2 identificerede peptider. Ud over detaljerne nævnt ovenfor indikerede museimmunisering med udvalgte peptider yderligere den lave effektivitet af disse lineære peptider i ikke-receptorbindende domæne til at inducere robuste neutraliserende antistofresponser (fig. 4, G). Samlet tyder disse data på, at dominerende lineære epitoper, der medierer langsigtede humorale immunresponser på SARS-CoV-2-infektion, sandsynligvis inducerer antistoffer med ingen eller begrænset neutraliserende styrke. En større forståelse af epitoplandskabet af SARS-CoV-2-antistoffer, især S-protein-rettede epitoper, giver ny indsigt i den funktionelle dissektion af antistoffer, hvilket yderligere letter innovativt og rationelt vaccinedesign. Neutraliserende antistoffer giver beskyttelse for at eliminere virusinfektioner, hvorimod ikke-neutraliserende antistoffer kan spille en gavnlig, neutral eller endda skadelig rolle under virusclearance. Ikke-neutraliserende antistoffer giver yderligere beskyttelse in vivo via en række Fc-medierede effektorfunktioner i sammenhæng med antistofafhængig fagocytose og antistofafhængig cytotoksicitet. I modsætning hertil har nogle undersøgelser foreslået muligheden for en patogen rolle af ikke-neutraliserende antistoffer i coronavirus-infektion. Tidligere undersøgelser med flere typer vaccinekandidater til SARS-CoV og MERS-CoV observerede forbedret immunopatologi hos vaccinerede små dyr og ikke-menneskelige primater efter virusudfordringen.24,44-50 For nylig rapporterede undersøgelser af 2 grupper, at ikke-neutraliserende antistoffer rettet mod NTD af SARS-CoV-2 S-protein var i stand til at forstærke virusinfektion in vitro gennem Fcg-receptor-uafhængige mekanismer,23,25, selvom passivt administrerede infektionsforstærkende antistoffer i dyremodeller har vist sig at være beskyttende mod SARS -CoV-2-infektion in vivo. I betragtning af antistoffernes kontroversielle roller under coronavirusinfektion er der behov for yderligere undersøgelser for at validere antistoffernes potentielle rolle i at genkende disse dominerende og vedvarende epitoper i bekæmpelse af virusinfektion in vivo. Det næste trin af rationelt vaccinedesign for SARS-CoV-2 kunne udtænkes ved at fremkalde stærkt potente neutraliserende antistoffer og beskyttende ikke-neutraliserende antistoffer sammen med en reduktion af præsentationen af ​​infektionsforstærkende epitoper eller immundominante epitoper, der ikke har nogen gavnlige virkninger. Selvom en række tidligere undersøgelser kun har fokuseret på S-proteinet i SARS-CoV-2 med det formål at afgrænse antistoffunktioner vedrørende neutralisering, udførte vi en omfattende proteomomfattende epitopkortlægning og identificerede et panel af epitoper i ORF1ab-polyproteinet, der blev konsekvent genkendt af en høj andel af patientserumprøver over tid. Selvom disse ORF1ab-rettede peptider fordelt på de multiple ikke-strukturelle proteiner muligvis ikke fremkalder funktionelle antistoffer rettet mod SARS-CoV-2 virion, kunne de være anvendelige som et diagnostisk værktøj til at hjælpe med at differentiere naturlig infektion fra vaccination. Med det stigende antal vaccinemodtagere verden over, står nuværende serologiske test baseret på S-proteinet og N-proteinet over for udfordringer som en effektiv tilgang til at hjælpe molekylære tests til påvisning af SARS-CoV-2-infektion, og også for bestemmelse af immunstatus efter virusinfektion. Ved at udnytte de mest almindelige og vedvarende reaktive peptider i ORF1ab blandt COVID-19-inficerede individer, vil serologisk diagnose af naturlig infektion blive udført uden hensyntagen til vaccinationsstatus, der involverer receptorbindingsdomæne-baseret, S-protein- baserede og inaktiverede virusbaserede vaccinemetoder. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at vurdere reaktiviteten, sensitiviteten og specificiteten af ​​identificerede ORF1ab-peptider i større kohorter, der omfatter både SARSCoV-2-inficerede individer og vaccinemodtagere. Yderligere evaluering af detektionseffektiviteten gennem multiple peptidkombinationsstrategier vil være påkrævet for at overvinde den lavere følsomhed af peptider sammenlignet med proteinet i fuld længde og den mulige krydsreaktivitet blandt almindelige humane coronavirus. De største begrænsninger i vores undersøgelse er de relativt få prøver, der er opnået fra en lille patientkohortestørrelse, og størstedelen af ​​deltagerne oplevede ikke-alvorlige COVID-{106}}-sygdomme. Disse kan begrænse nogle af vores konklusioner med hensyn til den positive responsfrekvens og størrelsen af ​​immunresponser, som kan variere alt efter sygdommens sværhedsgrad. Ikke desto mindre giver de data, der præsenteres i denne undersøgelse, værdifuld indsigt i kinetikken af ​​immunresponser over tid efter SARS-CoV-2-infektion og træk ved dominante epitoper, der er i stand til at mediere vedvarende humoral immunitet hos individer med COVID-19. Tilsammen giver disse resultater en dybere forståelse af levetiden af ​​naturlig immunitet induceret af en virusinfektion og har brede implikationer for innovative vaccinationsstrategier og forbedrede diagnostiske tilgange.

REFERENCER

1. Lu R, Zhao X, Li J, Niu P, Yang B, Wu H, et al. Genomisk karakterisering og epidemiologi af 2019 ny coronavirus: implikationer for virusoprindelse og receptorbinding. Lancet 2020;395:565-74.

2. Verdenssundhedsorganisationen (WHO). WHO coronavirus (COVID-19) dashboard, 2021. Tilgængelig på: https://COVID19.who.int/. Åbnet den 30. november 2021.

3. Wu Z, McGoogan JM. Karakteristika for og vigtige erfaringer fra udbruddet af coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) i Kina: resumé af en rapport med 72314 tilfælde fra det kinesiske center for sygdomskontrol og -forebyggelse. JAMA 2020;323:1239-42.

4. Rydyznski Moderbacher C, Ramirez SI, Dan JM, Grifoni A, Hastie KM, Weiskopf D, et al. Antigen-specifik adaptiv immunitet over for SARS-CoV-2 ved akut COVID-19 og sammenhænge med alder og sygdommens sværhedsgrad. Cell 2020;183:996-1012.e19.

5. Wu J, Liang B, Chen C, Wang H, Fang Y, Shen S, et al. SARS-CoV-2-infektion inducerer vedvarende humorale immunresponser hos rekonvalescente patienter efter symptomatisk COVID-19. Nat Commun 2021;12:1813.

6. Long QX, Liu BZ, Deng HJ, Wu GC, Deng K, Chen YK, et al. Antistofreaktioner på SARS-CoV-2 hos patienter med COVID-19. Nat Med 2020;26:845-8.

7. Sterlin D, Mathian A, Miyara M, Mohr A, Anna F, Claer L, et al. IgA dominerer det tidlige neutraliserende antistofrespons på SARS-CoV-2. Sci Transl Med 2021;13: eabd2223.

8. Zhang J, Wu Q, Liu Z, Wang Q, Wu J, Hu Y, et al. Spike-specifikke cirkulerende T-follikulær hjælpecelle og krydsneutraliserende antistofresponser hos COVID-19 – rekonvalescerende individer. Nat Microbiol 2021;6:51-8.

9. Wang P, Liu L, Nair MS, Yin MT, Luo Y, Wang Q, et al. SARS-CoV-2 neutraliserende antistofresponser er mere robuste hos patienter med alvorlig sygdom. Emerg Microbes Infect 2020;9:2091-3.

10. Vanshylla K, Di Cristanziano V, Kleipass F, Dewald F, Schommers P, Gieselmann L, et al. Kinetik og korrelater af det neutraliserende antistofrespons på SARSCoV-2-infektion hos mennesker. Cell Host Microbe 2021;29:917-29.e4.

11. Xiang T, Liang B, Fang Y, Lu S, Li S, Wang H, et al. Faldende niveauer af neutraliserende antistoffer mod SARS-CoV-2 hos rekonvalescerende COVID-19-patienter et år efter symptomdebut. Front Immunol 2021;12:708523.

12. Wang Z, Muecksch F, Schaefer-Babajew D, Finkin S, Viant C, Gaebler C, et al. Naturlig forbedret neutraliserende bredde mod SARS-CoV-2 et år efter infektion. Nature 2021;595:426-31.

13. Dan JM, Mateus J, Kato Y, Hastie KM, Yu ED, Faliti CE, et al. Immunologisk hukommelse til SARS-CoV-2 vurderet i op til 8 måneder efter infektion. Science 2021;371:eabf4063.

14. Sokal A, Chappert P, Barba-Spaeth G, Roeser A, Fourati S, Azzaoui I, et al. Modning og persistens af anti-SARS-CoV-2 hukommelse B-cellerespons. Cell 2021; 184:1201-13.e14. 15. Ju B, Zhang Q, Ge J, Wang R, Sun J, Ge X, et al. Humane neutraliserende antistoffer fremkaldt af SARS-CoV-2-infektion. Nature 2020;584:115-9.

16. Liu L, Wang P, Nair MS, Yu J, Rapp M, Wang Q, et al. Potente neutraliserende antistoffer mod flere epitoper på SARS-CoV-2-spids. Nature 2020;584:450-6.

17. Zost SJ, Gilchuk P, Case JB, Binshtein E, Chen RE, Nkolola JP, et al. Potentielt neutraliserende og beskyttende humane antistoffer mod SARS-CoV-2. Natur 2020; 584:443-9.

18. Xu C, Wang Y, Liu C, Zhang C, Han W, Hong X, et al. Konformationel dynamik af SARS-CoV-2 trimert spike glycoprotein i kompleks med receptor ACE2 afsløret af cryo-EM. Sci Adv 2021;7:eabe5575.

19. McCallum M, De Marco A, Lempp FA, Tortorici MA, Pinto D, Walls AC, et al. N-terminalt domæne antigen kortlægning afslører et websted med sårbarhed for SARSCoV-2. Cell 2021;184:2332-47.e16.

20. Sauer MM, Tortorici MA, Park YJ, Walls AC, Homad L, Acton OJ, et al. Strukturelt grundlag for bred coronavirus-neutralisering. Nat Struct Mol Biol 2021;28:478-86.

21. Tortorici MA, Beltramello M, Lempp FA, Pinto D, Dang HV, Rosen LE, et al. Ultrapotente humane antistoffer beskytter mod SARS-CoV-2-udfordring via flere mekanismer. Science 2020;370:950-7.

22. Pinto D, Park YJ, Beltramello M, Walls AC, Tortorici MA, Bianchi S, et al. Krydsneutralisering af SARS-CoV-2 af et humant monoklonalt SARS-CoV-antistof. Nature 2020;583:290-5.

23. Liu Y, Soh WT, Kishikawa JI, Hirose M, Nakayama EE, Li S, et al. Et infektivitetsforøgende sted på SARS-CoV-2-spidsproteinet målrettet af antistoffer. Cell 2021; 184:3452-66.e18.

24. Liu L, Wei Q, Lin Q, Fang J, Wang H, Kwok H, et al. Anti-spike IgG forårsager alvorlig akut lungeskade ved skævvridning af makrofagresponser under akut SARS-CoV-infektion. JCI Insight 2019;4:e123158.

25. Li D, Edwards RJ, Manne K, Martinez DR, Sch€afer A, Alam SM, et al. In vitro og in vivo funktioner af SARS-CoV-2 infektionsforstærkende og neutraliserende antistoffer. Cell 2021;184:4203-19.e32. 26. Poh CM, Carissimo G, Wang B, Amrun SN, Lee CY, Chee RS, et al. To lineære epitoper på SARS-CoV-2-spidsproteinet fremkalder neutraliserende antistoffer hos COVID{10}}-patienter. Nat Commun 2020;11:2806.

27. Zhang BZ, Hu YF, Chen LL, Yau T, Tong YG, Hu JC, et al. Udvinding af epitoper på spidsprotein af SARS-CoV-2 fra COVID-19-patienter. Cell Res 2020;30:702-4.

28. Stoddard CI, Galloway J, Chu HY, Shipley MM, Sung K, Itell HL, et al. Epitopprofilering afslører bindende signaturer af SARS-CoV-2-immunrespons ved naturlig infektion og krydsreaktivitet med endemiske humane CoV'er. Cell Rep 2021;35: 109164.

29. Shrock E, Fujimura E, Kula T, Timms RT, Lee IH, Leng Y, et al. Viral epitopprofilering af COVID-19-patienter afslører krydsreaktivitet og korrelerer med sværhedsgrad. Science 2020;370:eabd4250.

30. Zamecnik CR, Rajan JV, Yamauchi KA, Mann SA, Loudermilk RP, Sowa GM, et al. ReScan, en multipleks diagnostisk pipeline, panorerer humant sera for SARS-CoV-2- 2-antigener. Cell Rep Med 2020;1:100123.

31. Haynes WA, Kamath K, Bozekowski J, Baum-Jones E, Campbell M, Casanovas Massana A, et al. Kortlægning af epitop i høj opløsning og karakterisering af SARS-CoV-2-antistoffer i store kohorter af forsøgspersoner med COVID-19. Commun Biol 2021;4:1317.

32. Li Y, Lai DY, Lei Q, Xu ZW, Wang F, Hou H, et al. Systematisk evaluering af IgG-responser på SARS-CoV-2-spidsproteinafledte peptider til overvågning af COVID-19-patienter. Cell Mol Immunol 2021;18:621-31.

33. Li Y, Ma ML, Lei Q, Wang F, Hong W, Lai DY, et al. Lineært epitoplandskab af SARS-CoV-2-spidsproteinet konstrueret af 1.051 COVID-19-patienter. Cell Rep 2021;34:108915.

34. Wang H, Wu X, Zhang X, Hou X, Liang T, Wang D, et al. SARS-CoV-2 Proteome Microarray til kortlægning af COVID-19-antistofinteraktioner ved aminosyreopløsning. ACS Cent Sci 2020;6:2238-49.

35. Yi Z, Ling Y, Zhang X, Chen J, Hu K, Wang Y, et al. Funktionel kortlægning af B-celle lineære epitoper af SARS-CoV-2 i COVID-19 rekonvalescent population. Emerg Microbes Infect 2020;9:1988-96.

36. National Health Commission & National Administration of Traditional Chinese Medicine. Diagnose- og behandlingsprotokol for ny coronavirus-lungebetændelse (forsøgsversion 7). Chin Med J (Engl) 2020;133:1087-95; https://doi.org/10.1097/ CM9.0000000000000819.

37. Li Y, Li CQ, Guo SJ, Guo W, Jiang HW, Li HC, et al. Longitudinel serum-autoantistof-repertoireprofilering identificerer kirurgi-associerede biomarkører i lungeadenokarcinom. EBioMedicine 2020;53:102674.

38. Zhao J, Yuan Q, Wang H, Liu W, Liao X, Su Y, et al. Antistofreaktioner på SARSCoV-2 hos patienter med ny coronavirussygdom 2019. Clin Infect Dis 2020;71: 2027-34.

39. Lucas C, Wong P, Klein J, Castro TBR, Silva J, Sundaram M, et al. Longitudinelle analyser afslører immunologisk fejltænding ved svær COVID-19. Nature 2020;584: 463-9.

40. Moore JB, juni CH. Cytokinfrigivelsessyndrom ved svær COVID-19. Science 2020;368:473-4.

41. Chen J, Malone B, Llewellyn E, Grasso M, Shelton PMM, Olinares PDB, et al. Strukturelt grundlag for Helicase-Polymerase-kobling i SARS-CoV-2-replikations-transskriptionskomplekset. Cell 2020;182:1560-73.e13.

42. Wajnberg A, Amanat F, Firpo A, Altman DR, Bailey MJ, Mansour M, et al. Robuste neutraliserende antistoffer mod SARS-CoV-2-infektion varer ved i flere måneder. Videnskab 2020; 370:1227-30.

43. Chi X, Yan R, Zhang J, Zhang G, Zhang Y, Hao M, et al. Et neutraliserende humant antistof binder sig til det N-terminale domæne af spidsproteinet i SARS-CoV-2. Science 2020;369:650-5.

44. Tseng CT, Sbrana E, Iwata-Yoshikawa N, Newman PC, Garron T, Atmar RL, et al. Immunisering med SARS coronavirus-vacciner fører til pulmonal immunopatologi ved udfordring med SARS-virus. PLoS One 2012;7:e35421.

45. Bolles M, Deming D, Long K, Agnihothram S, Whitmore A, Ferris M, et al. En dobbelt-inaktiveret coronavirus-vaccine til alvorligt akut respiratorisk syndrom giver ufuldstændig beskyttelse i mus og inducerer øget eosinofil proinflammatorisk lungerespons ved udfordring. J Virol 2011;85:12201-15.

46. ​​Weingartl H, Czub M, Czub S, Neufeld J, Marszal P, Gren J, et al. Immunisering med modificeret vacciniavirus Ankara-baseret rekombinant vaccine mod alvorligt akut respiratorisk syndrom er forbundet med øget hepatitis hos fritter. J Virol 2004;78:12672-6.

47. Yasui F, Kai C, Kitabatake M, Inoue S, Yoneda M, Yokochi S, et al. Tidligere immunisering med alvorligt akut respiratorisk syndrom (SARS)-associeret coronavirus (SARS-CoV) nukleocapsidprotein forårsager alvorlig lungebetændelse hos mus inficeret med SARS-CoV. J Immunol 2008;181:6337-48.

48. Deming D, Sheahan T, Heise M, Yount B, Davis N, Sims A, et al. Vaccineeffektivitet hos ældre mus udfordret med rekombinante SARS-CoV-bærende epidemiske og zoonotiske spidsvarianter. PLoS Med 2006;3:e525.

49. Wang Q, Zhang L, Kuwahara K, Li L, Liu Z, Li T, et al. Immundominante SARS-coronavirusepitoper hos mennesker fremkaldte både forstærkende og neutraliserende virkninger på infektion hos ikke-menneskelige primater. ACS Infect Dis 2016;2: 361-76.

50. Agrawal AS, Tao X, Algaissi A, Garron T, Narayanan K, Peng BH, et al. Immunisering med inaktiveret Mellemøsten respiratorisk syndrom coronavirus-vaccine fører til lungeimmunopatologi ved udfordring med levende virus. Hum Vaccin Immunother 2016;12:2351-6.