Lokalt ikke-hypofysevæksthormon induceres med aldring og letter epitelskader

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

RESUMÉ

Mikromiljøfaktorer, der modulerer aldersrelateret DINA-skader, er uklare. Ikke-hypofysevæksthormon (np) induceres i den humane colon, ikke-transformerede humane colonceller og fibroblaster og i 3-dimensionelle intestinale organoider med aldersassocieret DNA-skade. Autokrin/parakrin npGH undertrykker p53 og dæmper DNA-skaderespons (DDR) ved at inducere TRIM29 og reducere ATM-phosphorylering, hvilket fører til reduceret DNA-reparation og DNA-skadeakkumulering. Organoider dyrket i op til 4 måneder udviser ældningsmarkører, p16 og SA- -galactosidase og nedsat telomerlængde, såvel som DNA-skadeakkumulering med øget npGH, undertrykt p53 og svækket DDR. Undertrykkelse af GH i ældede organoider øger p53 og mindsker DNA-skader. WT-mus udviser aldersafhængig akkumulering af tyktarms-DNA-skader, mens i gamle mus uden colon-GH-signalering forbliver DNA-skader lav med forhøjet p53. Da aldersassocieret npGH-induktion muliggør et pro-proliferativt mikromiljø, kan ophævelse af npGH-signalering målrettes som anti-aldringsterapi ved at forhindre DNA-skader og aldersrelaterede patologier.

INTRODUKTION

Biologiske funktioner falder med aldring samtidig med øget aldersrelateret sygdom.flavonoiderAldersrelaterede patologier er drevet af akkumulerede DNA-skader og mangler i DNA-reparation, der forårsager mutationer og aldersassocierede kromosomafvigelser. Vedvarende DNA-beskadigelse kan også blokere celleproliferation, hvilket resulterer i ældning og apoptose, og derved drive aldringsprocessen yderligere (Ou og Schumacher, 2018). DNA-skader akkumuleres med alderen i vildtype (WT), ikke-transformerede humane og murine celler, som det fremgår af øget phosphoryleret histon 2A-variant (yH2AX), en markør for dobbeltstrengede DNA-brud (DSB'er) (Sedelnikova et al., 2004) og ikke-repareret DNA-skade (Dolle et al., 1997; Hasty et al., 2003; Lombard et al., 2005; Petr et al., 2020). Genomisk ustabilitet som følge af defekt DNA-skadereparation kan favorisere cellulær transformation (Negrini et al., 2010). DNA-skader udløser phosphorylering af ataksi-telangiectasia-muterede (ATM) gener, der er ansvarlige for reparationen af ​​enkeltstrengede DNA-brud og DSB'er. ATM phosphorylerer og stabiliserer tumorsuppressor p53 og sikrer således DNA-skadereparation ved at lette adskillige DNA-reparationsveje. ATM spiller således en nøglerolle i aktivering af både DNA-skaderespons (DDR) og DNA-reparation (Ou og Schumacher, 2018).

Klik venligst her for at vide mere

ATM-ekspression og aktivitet forringes med alderen (Feng et al..2007; Gutierrez-Martinez et al., 2018), hvilket sandsynligvis resulterer i aldersrelateret funktionelt p53-tab og fører til akkumuleret DNA-skade og kromosomal ustabilitet (Simon et al., 2009) .p53-reaktioner på stressfaktorer såsom stråling er lavere hos ældre mus (Feng et al., 2007) og i humane dermale fibroblaster afledt af ældre individer (Goukassian et al., 2000). Kendetegnene for aldring inkluderer således nedsat DDR-aktivitet og p53-undertrykkelse med akkumuleret urepareret DNA-skade, hvilket alt sammen muliggør et gunstigt miljø for epithelial spredning (Lopez-Otin et al., 2013).

Da sekretion af hypofysevæksthormon (GH) falder med alderen, er ændret GH-signalering blevet impliceret i ældningsprocessen (Ho og Hoffman, 1993). Ikke desto mindre understøtter en mængde beviser de gavnlige virkninger af GH-dæmpning på aldring.I cellen, murine og humane sygdomsmodeller (Brown-Borg et al., 1996; Junnila et al., 2013), stammer fordelene ved GH-mangel primært fra observationer, der favoriserer sekundære faktorer, der forlænger levetiden, herunder øget insulinfølsomhed, nedsat leverproteinoxidation , nedsat kræftforekomst og nedsat aldersassocieret inflammation (Aguiar-Oliveira og Bartke, 2019; Bartke, 2016; Junnila et al., 2013; Spadaro et al., 2016). Afkom af Leiden-undersøgelsesfamilier med familiær levetid og lavere dødelighed end miljømæssigt matchede kontroller har lavere integrerede cirkulerende GH-niveauer (van der Spoeletal., 2016), mens GHexcess reducerer levetiden, som det ses hos patienter med akromegali (Chesno-kova et al., 2019a; Melmed, 2020; Waters and Barclay, 200 7) og i transgene murine modeller, der overudtrykker GH (Bartke, 2003).hesperidin brugerNogle har foreslået en negativ sammenhæng mellem højde og levetid hos mennesker (He et al., 2014; Samaras og Storms, 1992) og hos hunde (Greer et al., 2007). Vi antog, at negative GH-effekter på aldring i det mindste kan delvist tilskrives akkumuleret DNA-skade (Ches-nokova og Melmed, 2020). Til støtte for denne forudsætning udviser lymfocytter afledt af akromegalipatienter DNA-skader med øgede kromosomafvigelser (Bayram et al., 2014), mens ikke-reparerede DNA-skader akkumuleres i leveren af ​​en zebrafisk-akromegalimodel (Elbialy et al., 2018). Høje cirkulerende GH-niveauer dæmper murin tyktarms-DNA-reparation, hvilket udløser akkumulering af DNA-skader, mens DNA-skade dæmpes efter blokering af GH-receptor (GHR) i humane tyktarmsceller og i mus med ophævet GHR-signalering (Chesnokova et al., 2019a).

Ikke-hypofyse GH (np) syntetiseret lokalt i perifere væv er identisk med endokrin GH1 produceret af hypofysen og virker gennem autokrine/parakrine mekanismer via det bredt udtrykte GHR (Ballesteros et al., 2000), der genkender både hypofyse GH og (npGH ligander) Waters og Barclay, 2007; Waters et al., 2006).tabt imperium cistancheDa DDR-aktivering inducerer npGH (Chesnokova et al., 2013), antog vi, at aldersassocieret akkumuleret colon-DNA-skade inducerer npGH-ekspression, hvilket igen ville begrænse reparationen af ​​DNA-skader yderligere.

Cistanche kan anti-aging

Ved at bruge både in vitro og ex vivo humane modeller, der afspejler ældning, viser vi her, at npGH induceres, og DNA-skader akkumuleres i ældede humane væv, som det fremgår af øget H2AX-phosphorylering (yH2AX). Ydermere er tyktarms-DNA-skader signifikant øget i gamle WT-mus, mens epitel-DNA-skader forbliver lav i aldersmatchede GHR---mus uden GH-signalering og i tyktarmsspecifikke GHR-knockout-mus (GHRcolKO).

Lokal npGH blev også induceret i ældede 3-dimensionelle (3D) intestinale organoider genereret fra inducerede humane pluripotente stamceller (iPSC'er) (Barrett et al, 2014; Chesnokova et al, 2019a). Organoid npGH undertrykte til gengæld p53 og svækkede DNA-skadereparation.mikroniseret oprenset flavonoidfraktion 1000 mg brugerVirkningerne af npGH var sandsynligvis parakrine, da co-dyrkning af GH-udtrykkende fibroblaster med Colon Intestine-Chip mikrofluidiske enheder indlejret med human colonoidslæde for at undertrykke p53/p21 og øget DNA-skade. Derimod forhindrede undertrykkelse af GH i gamle organoider DNA-skade.

Således viser vi, at epitelial npGH er stærkt induceret under aldring, og at npGH reducerer DNA-reparation og letter aldersassocieret DNA-skadeakkumulering. Samlet set tyder resultaterne på, at lokal colon epitelial npGH udløser en slimhindefeltændring, hvilket skaber et miljø af kromosomal ustabilitet, der er gunstigt for neoplastisk udvikling i aldrende væv.

Det er vigtigt, selvom der er en udbredt uhensigtsmæssig brug af GH som et "anti-aldrings"-hormon på trods af manglen på overbevisende indvirkning på aldringsprocessen (Blackman et al., 2002; Clemmons et al..2014; Lieut al., 2007; Melmed, 2019), viser vores resultater, at lokal GH-signalering bidrager til vævsmikromiljøet og fremmer udviklingen af ​​aldersrelaterede patologier. Undertrykkelse af lokal npGH-signalering for at begrænse skadelig epitel-DNA-skade kan derfor tilbyde et terapeutisk mål med anovulant-aldring. Resultaterne af disse undersøgelser informerer om en innovativ tilgang til forlængelse af levetiden (dvs. undertrykkelse snarere end induktion af lokal GH-signalering). RESULTATER

Human colon DNA-skade og npGH akkumuleres med aldring

Aldersassocieret DNA-skade blev vurderet i ikke-tumorøse humane colon paraffinvævsprøver afledt af patientkohorter, der spænder over 3 aldersgrupper: unge (18-39 år), midaldrende (40-60 år) og alderen ( 61-88 år). Når der blev scoret for yH2AX, udviste 3 ud af 11 prøver (27 procent) i den unge kohorte DNA-skade, 8 ud af 16 (50 procent) udviste DNA-skade i middelalderen, og 8 ud af 18 (45 procent) gamle prøver udviste DNA-skader (figurer) 1A-1C og 1J).

Som vi tidligere har vist, at DNA-skade inducerer npGH (Chesnokova et al, 2013), søgte vi at bestemme, om den aldersafhængige ophobning af DNA-skade var forbundet med GH-ekspression i ikke-tumorøst colonvæv. Da nej udtrykkes i neuroendokrine colonceller (Chesnokova et al, 2016), udelukkede vi disse celler fra analyse.

Epitelial GH-ekspression blev påvist i 16 procent -17 procent af normale kolonprøver afledt af midaldrende og aldrende kohorter (henholdsvis 38 og 42 prøver), men kun i 2 procent af den unge kohorte (37 prøver), mens GH-ekspressionsscore blev øget i den midaldrende kohorte og yderligere øget i de gamle kohorteprøver (p.<0.01) (figures="" 1d-1f="" and="" 1k).="" furthermore,="" colon="" mrna="" gh="" expression="" increased="" in="" both="" middle-aged="" (30%="" of="" 10="" samples)="" and="" aged="" (26%="" of="" 14="" samples)="" versus="" young="" cohort="" samples(17%="" of9=""><0.01 and=""><0.05, respectively)(figures="" 1g-1).="">oteflavonoidSammenfattende peger disse resultater på ophobning af DNA-skader uden induktion i den aldrende tyktarm.

DDR-aktivering inducerer lokal npGHin murin og human colon

Dernæst overvejede vi, om aktiveret DDR udløser lokal npGH-ekspression i tyktarmen og behandlede mus med nutlin3 for at stabilisere p53 (Vassilev et al, 2004) og observerede induceret tyktarm p53 og op (Figur 2A). Desuden i tyktarmsadenokarcinomprøver afledt af de samme patienter før og efter DNA-skadelige terapier (tabel S1), observerede vi beskeden før-behandling baseline epitelial npGH-ekspression og øget npGH-ekspression efter terapi i alle 6 undersøgte patientprøver (p<0.01) (figure="" 2b).="" enhanced="" gh="" expression="" was="" also="" observed="" in="" tumor-associated="" fibroblasts="" after="" dna="" damage(figure="" 2c),="" indicating="" that="" these="" findings="" are="" likely="" not="">

DDR aktiverer GH-ekspression in vitro

Vi brugte topoisomerase Il-hæmmeren etoposid til at producere både enkeltstrengede DNA-brud og DSB'er (Walles et al, 1996) og til at bestemme, om DDR aktiverer GH in vitro. Den DNA-skade-inducerede npGH i NCC, hNCF og HCT116human colon adenocarcinomceller (figur 3A og S1A-S1C); i organo-ids, etoposid-induceret GH og GH mRNA (figur 3B og S1D), mens IGF1 og prolactin mRNA niveauer var uændrede (figur S1E). STAT5-phosphorylering, et nedstrøms GH-signal (Waters, 2016), blev induceret i alle celletyper (figur 3A-3C og S1A-S1C). I modsætning hertil forhindrede ophævelse af npGH med GH lille interfererende RNA (siRNA) etoposid i at inducere pSTAT5 (figur 3C og S1F), hvilket gav bevis for, at DNA-skade-induceret kolon npGH er funktionelt aktiv. Billeddannelse af NCC behandlet med etoposid i 24 timer viste GH og yH2AX co-ekspression i flere celler (figur 3D).

Epitelceller, der gennemgår DNA-skade, udskiller GH For at bestemme, om induceret intracellulær npGH udøver autokrine/parakrine virkninger, vurderede vi GH-niveauer udskilt i NCC og organoid dyrkningsmedium efter etoposidbehandling. Medium indsamlet fra ANCC 8 og 24 timer efter behandling og fra organoider ved 4-48 timer efter behandling viste tidsafhængige GH-stigninger efter DDR-aktivering (figur 3E). Fordi NCC og organoider udtrykker GH-receptorer ligesom humant tyktarmsvæv (Chesnokova et al., 2016), tyder disse resultater på, at lokal GH induceret som reaktion på DNA-beskadigelse kan udsætte aldrende væv for autokrine/parakrine virkninger.

Autokrin/parakrin GH undertrykker human coloncelle p53

Da endokrin GH undertrykker murint tyktarm p53 (Chesnokova et al, 2016), bestemte vi, om lokal GH udøver lignende au-autokrine/parakrine virkninger i humane epitheliale colonceller. Analyse af to separate NCC-linjer afledt af to forskellige patienter efter nukleofektion med hGH eller infektion med lentivirus-udtrykkende GH (lenti-GH) (figur 4A, 4B og S2) samt organoider, der stabilt udtrykker hGH (figur 4C), viste undertrykt p53 og samtidig overekspression. Celler afledt af organo-id'er inficeret med lenti-GH eller tom vektor (lenti-V) pulseret med bromodeoxyuridin (BrdU) viste p53-undertrykkelse efterfulgt af beskeden, men signifikant øget BrdU-inkorporering vurderet ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) (figur S3A). I modsætning hertil førte GH-undertrykkelse med lentivirus, der udtrykker lille hårnåle-GH (GH), til nedsat kolonidannelse og kolonistørrelse i NCC (figur S3B og S3C), hvilket indikerer pro-pro-litteratur npGH-handlinger.

Parakrine GH-effekter i humane colon Intestine-Chip For at vurdere de parakrine virkninger af npGH på intestinale slimhindeepitelceller, co-dyrkede vi UNCF inficeret med lenti-GH og Colon Intestine-Chip mikrofluidiske enheder (Kasendra et al, 2020) udsået med sund colon organoid-afledte epitelceller i 8 dage. Lokal GH-sekretion fra hNCF ind i mediet blev bekræftet ved ELISA (338ng/mL/1×10 graders celler).5-Ethynyl-2'-deoxyuridin （EdU） （20 μM） blev tilføjet på dag 7 , blev chips fikseret 24 timer senere og farvet for EdU og H2AX, og EdU plus kerner blev talt i epitelceller. Et separat sæt chips udsået

med epitelceller blev anvendt til at vurdere p53/p21 ved western blot. Proliferationen af ​​chipepitelceller steg (s<0.05), likely="" due="" to="" decreased="" p53="" and="" p21="" (figures="" 4d="" and="" 4e).="" moreover,="" dna="" damage="" accumulation="" was="" evident,="" with="" increased="" numbers="" of="" cells="" expressing="" γh2ax="" （p=""><0.01） （figure="">

Autokrin/parakrin GH undertrykker DDR

Aktivering af ATM ved DNA-skade phosphorylerer H2AX, som markerer beskadigede DNA-steder for at aktivere DDR og fremme reparation (Turinetto og Giachino, 2015). ATM phosphorylerer også p53, hvilket yderligere forbedrer DNA-reparation (Blackford og Jackson 2017). I hNCC såvel som i organoider inficeret enten med pIRES2-ZsGreen1hGH eller med linse-GH, undertrykte GH-overekspression phosphoryleringen af ​​ATM og DNA-proteinkinase (PK)cs, begge involveret i DNA-reparation (Blackford og Jackson. 2017), og nedsat phosphorylering af et målprotein p53 (figur 5A-5C).

Tip60 histonacetylase aktiverer ATM (Jackson og Bartek, 2009) og er negativt reguleret af TRIM29 (Sho et al., 2011; Sun et al., 2005). Vi observerede, at GH-overekspression i NCC og i organoider også resulterede i TRIM29-induktion, som igen undertrykte Tip60 (figur 5A-5C). Lignende resultater blev observeret i den anden NCC-linje 48 timer efter nukleofektion med et plasmid, der udtrykker GH og 6 dage efter infektion med lenti-GH (figur S4A og S4B).

Autokrin/parakrin GH dæmper DNA-reparation

Vi målte derefter effekter på DSB reparationsmekanismer, specifikt fejltilbøjelige ikke-homologe endeforbindelser (NHEJ) (Jackson og Bartek, 2009) og fejlsikker homolog rekombination (HR) (Beucher et al., 2009 ; Blackford og Jackson, 2017; Chapman et al., 2012). Vi nukleoferede NCC stabilt udtrykkende NHEJ- og HR-reporterkassetter med pcDNA3.1-humane GH1 (hGH1)-plasmider, inducerede DSB'er ved at co-transficere med et plasmid, der koder for I-Excel-endonuklease, og målte genforening af DSB-reparationsreportere. Transfektionseffektiviteten blev kontrolleret ved co-transfektion med plasmid, der koder for DsRed (Seluanov et al, 2010). NHEJ-effektivitet efter pcDNA3.1-hGH1-nukleofektion var 0.77-0.83 og reduceret ved 48h(p)<0.05)(figure5d), and="" hr,while="" low(0.05),="" consistent="" with="" other="" reports="" (chitnis="" et="" al,2014;gatei="" et="" al.,2011),showed="" consistently="" decreased="" efficiency="" by="" up="" to="" 38.7%±3.5%="" (n="4" independent=""><0.05) at="" 72="">

Autokrin/parakrin GH øger ikke-repareret DNA-skade

Ved at undersøge, om npGH øger DNA-skade, observerede vi, at NCC og organoider stabilt transficeret med lenti-GH viste øget endogen ikke-repareret DNA-skade som målt ved Comet-assay (p.< 0.05)="" (lee="" and="" paull,="" 2007)(figures="" 5e="" and="" 5f).="" levels="" of="" unrepaired="" dna="" were="" also="" markedly="" increased="" in="" a="" second="" ncc="" line="" in="" cells="" nucleofected="" with="" a="" plasmid="" expressing="" gh="" or="" infected="" with="" lenti-gh="" (figures="" s4c="" and="" s4d).="" overall,="" these="" results="" show="" that="" npgh="" is="" induced="" in="" response="" to="" dna="" damage="" and="" enhances="" dna="" damage="" accumulation="" by="" interfering="" with="" both="" ddr="" and="" dna="" repair="">

GH induceres i forældede 3D humane intestinale organoider og dæmper DDR

Efter den observerede øgede GH-ekspression og DNA-beskadigelse i gamle humane tyktarmsprøver, "aldrede" vi organo-id'er genereret fra tre uafhængige iPSC-linjer for at rekapitulere en model af aldrende humant væv. Disse organoider er sammensat af enterocytter, bægerceller, Paneth-celler og enteroendokrine celler og udtrykker caudal-type homeobox 2(CDX2) (Barrett et al..2014; Gao et al.,2009; Workman et al.,2017). To ud af tre iPSC-linjer (linje 1 og 3) blev opnået fra personer over 60 år, og den tredje iPSC-linje (linje 2) var afledt af fibroblaster fra et 30-årigt individ. Organoider genereret fra linje 1 og 3 blev dyrket i op til 2 måneder, på hvilket tidspunkt celleproliferation aftog betydeligt. I modsætning hertil prolifererede organoider genereret fra linje 2 robust i kultur i op til 4 måneder. Cellulær aldring blev bekræftet i alle 3 linjer af øget p16 såvel som ved nedsat telomerlængde (p<0.05)(figures 6a="" and="" 6b).="" in="" aged="" organoids,="" we="" also="" found="" increased="" senescence-associated="" β-galactosidase="" (sa-β-galactosidase)="" activity,="" which="" has="" been="" shown="" to="" increase="" with="" age="" (kurz="" et="" al.,="" 2000;="" lee="" et="" al.,="" 2006),="" as="" well="" as="" increased="" β-galactosidase="" protein="" expression,="" which="" correlates="" with="" sa-β-galactosidase="" enzymatic="" activity(figures="" 6a="" and="">

Da disse in vitro organoide træk ser ud til at rekapitulere cellulære ændringer i overensstemmelse med aldrende menneskeligt væv (Baker et al.,2011;Lieut al.,2019; Lopez-Otin et al.,2013), brugte vi dette model til yderligere at studere signalmekanismer, der ligger til grund for ældning af menneskets tyktarmsepitel. I linje 1 blev GH mRNA-niveauer induceret efter 1 måned i kultur og øget yderligere efter 2 måneder (p < 0,05)="" (figur="" 6c),="" hvilket="" er="" i="" overensstemmelse="" med="" signifikant="" øget="" npgh="" set="" i="" ældede="" organoider="" på="" både="" western="" blot="" og="" immunhistokemi="" (ihc)="" (figur="" 6d,="" 6e="" og="" s5b).="" yh2ax="" blev="" også="" stærkt="" induceret="" med="" forlænget="" dyrkning,="" hvilket="" indikerer="" akkumuleret="" endogen="" dna-skade="" med="" in="" vitro-ældning.="" i="" overensstemmelse="" med="" resultater,="" der="" viser="" undertrykt="" p53="" i="" ncc="" og="" organoider="" transficeret="" med="" gh="" (figur="" 4a-4c),="" observerede="" vi="" undertrykt="" p53="" ved="" 1="" og="" 2="" måneders="" dyrkning,="" i="" overensstemmelse="" med="" øget="" npgh="" (figur="" 6e="" og="" s5b).="" lignende="" resultater="" (="" a="" og="" b)="" western="" blot="" af="" (a)="" ancc-,="" hncf-="" og="" hct116-celler="" og="" (b)="" organoider.="" celler="" blev="" behandlet="" med="" angivne="" doser="" af="" etoposid="" og="" analyseret="" 24="" timer="" senere.="" organoider="" blev="" behandlet="" med="" 3="" um="" etoposid="">

(C) NCC nucleofed med GH siRNA (siGH RNA) eller scramble RNA (Scr RNA) som kontrol i 24 timer blev behandlet med angivne doser af etoposid (Etop) og analyseret 24 timer senere. ImageJ kvantificering af western blots er afbildet i figur S1.

（D） Repræsentativt billede af NCC behandlet med 20 μM etoposid i 24 timer. GH, rød; yH2AX, grøn; phalloidin, grå; DAPI, blå. En lys grøn kerne indikerer apoptose. Målestok, 20 um. Kontrol, ubehandlede celler.

(E) Western blot af GH i dyrkningsmediet af ANCC og organoider behandlet med henholdsvis 20 eller 5 uM etoposid. Mediet blev opsamlet fra varme 8 og 24 timer og fra organoider ved 4-48 timer efter behandling. Ponceau blev brugt som lastkontrol. Repræsentative blots fra mindst 3 uafhængige eksperimenter er vist.

blev opnået ved at dyrke organoider genereret fra iPSC-linje 2 og 3 i henholdsvis 4 og 2 måneder (figur S6A-S6D).

Desuden var øget npGH i ældede organoider forbundet med svækket DDR med undertrykt phosphorylering af både ATM og DNA-PKcs og lavere niveauer af phosphoryleret p53 (figur 6E og S5B). Disse resultater tyder på, at undertrykt DDR-aktivitet fører til akkumuleret ikke-repareret DNA-skade, hvilket også fremgår af yH2AX-induktion (figur 6E og S5B). Efter 2 måneder i kultur viste ældede organoider inficeret med GH shRNA øget p53 (figur 6F og S7A) og nedsat DNA-skade målt ved Comet assay (p.<0.01)(figure 6g),="" indicating="" a="" requirement="" for="" npgh="" in="" age-related="" dna="" damage="" accumulation="" in="" this="">

GH-signaleringsmangel dæmper in vivo colon-DNA-skader hos aldrende mus

For at bekræfte vores resultater opnået i ældede organoider undersøgte vi gamle WT- og GHR-7-mus in vivo. Tykktarms-DNA-skader var signifikant øget hos gamle (24-måned gamle) versus unge (3-måned gamle) WT-mus(p<0.01), but,="" strikingly,="" was="" not="" increased="" in="" aged="" ghr-mice="" (figures="" 7a="" and="" s7b),="" likely="" due="" to="" p53="" in-duction.="" we="" also="" generated="" transgenic="" mice="" with="" colon-specific="" ghr="" excision="" (car1-cre/ghr"loxmox,="" ghrcolko)(figure="" s7d).="" control="" mice="" were="" derived="" from="" the="" same="" breeding,="" but="" they="" did="" not="" harbor="" the="" cre="" enzyme.="" colon="" dna="" damage="" was="" much="" reduced="" in="" 20-month-old="" male="" ghrcolko="" mice="" with="" ghr="" excision="" compared="" to="" control="" mice,="" but="" not="" in="" the="" small="" intestine="" with="" intact="" ghr(figure="" 7d).="" thus,="" it="" appears="" that="" dna="" is="" repaired="" more="" efficiently="" in="" mice="" devoid="" of="" gh="" signaling,="" likely="" due="" to="" the="" higher="" colon="" p53="" expression="" we="" observed="" in="" both="" ghr-/-and="" in="" ghrcolko="" animals(figures="" 7b,7c,="" 7e,="" s7c,="" and="" s7e).="" these="" in="" vivo="" results="" buttress="" our="" hypothesis="" that="" npgh="" en-hances="" age-associated="" colon="" dna="" damage="">

DISKUSSION

Vi viser her, at npGH stiger med alderen i humant kolonvæv og i 3D humane tarmorganoider. Vi demonstrerer flere evidenslinjer, der tyder på, at npGH i ældet humant tyktarmsvæv induceres af DNA-skade, som observeret i humane modeller, herunder ikke-tumorøse epitelceller, normale tyktarmsfibroblaster, organoider og tyktarmskræftvæv fra patienter, der gennemgår DNA-skadelige behandlinger ; vi viser også lignende fund in vivo i tyktarmen på mus med aktiveret DDR.

Ved at bruge 3D humane intestinale organoider observerede vi øget p16, senescens og telomerforkortelse, alt i overensstemmelse med aldersrelaterede ændringer i humant væv (Baker et al., 2011; Liu et al., 2019; Lopez-Otin et al., 2013 ). På trods af begrænsningerne af den organoide model understøtter vores resultater intestinale organoider som en trofast menneskelig rekapitulation for at studere signalmekanismer, der ligger til grund for aldersassocierede kolonændringer (Hu et al., 2018).

Vi fandt, at lokal npGH, der virker på en autokrin/parakrin måde, undertrykker p53 og øger nabocelleproliferation. Induceret GH undertrykker også DDR- og DNA-reparation, hvilket yderligere forbedrer ophobning af DNA-skader. Resultaterne er også i overensstemmelse med de observerede effekter på DNA-skadeakkumulering i GH-udskillende humane hypofysetumorer (Ben-Shlomo et al., 2020).

GH-virkninger i normalt tyktarmsvæv fremmer udviklingen af ​​et pro-proliferativt miljø, der kan ligge til grund for aldersrelateret øget forekomst af tyktarmspolypper, eksemplificeret ved aldersassocieret DNA-skade og kromosomal ustabilitet som årsagerne til tyktarmskræftprævalens hos patienter ældre end 50 år (Aunan et al.,2017). Den aldersrelaterede øgede DNA-skade, vi viser her, stemmer også overens med rapporter om, at yH2AX stiger lineært med alderen i normale tyktarmsprøver (Risques et al., 2008). Vores observerede markante opregulering af yH2AX i aldrende organoider er tegn på DNA-skadeakkumulering, da yH2AX markerer DNA-skadesteder for at tiltrække DNA-reparationsproteiner (Turinetto og Giachino, 2015). Disse resultater kan tilsyneladende være inkonsistente med det faktum, at GH induceret i aldrende celler undertrykker H2AX-phosphorylering. Imidlertid fortolker vi disse observationer for at vise, at GH nedsætter DDR-aktivitet ved at reducere phosphorylering af ATM, hvilket igen reducerer (men ikke fuldstændigt afskaffer) fosforyleringen af ​​nedstrømsproteiner inklusive H2AX. Når DDR ikke er korrekt aktiveret, ændres DNA-reparation, men yH2AX akkumuleres stadig, da det markerer ikke-reparerede DNA-skadesteder. Således afspejler yH2AX-niveauer observeret i aldrende humant væv og organoider et nettoresultat af DDR-aktivitet og mængden af ​​ikke-repareret DNA.

DNA-skader kan akkumuleres i aldrende væv på grund af tab af baseudskæringsreparation, sandsynligvis fra tab af p53-respons på DNA-skade (Cabelof et al., 2006; Simon et al., 2009, 2012). I vores eksperimenter faldt p53 i tyktarmsceller og organoider, der udtrykker npGH, i overensstemmelse med tidligere resultater af GH, der undertrykker p53 (Chesnokova et al., 2016). I modsætning hertil udviser gamle GHR-/-mus, som er resistente over for kræft og har en længere levetid (Basu et al., 2018), såvel som kolonspecifikke GHRcolKO-mus en øget ekspression af colon p53, hvilket sandsynligvis forbedrer DNA-reparation. Da GH undertrykker p53 (Chesnokova et al., 2013), kan npGH-induktion resultere i ændringer i det lokale mikromiljø i overensstemmelse med aldersassocieret nedsat p53 (Feng et al., 2007; Goukassian et al., 2000). GH-promotoren indeholder et p53-bindingssted (Chesnokova et al., 2013), og DNA-skade-induceret p53 aktiverer GH-ekspression (Chesnokova et al. 2013,2019a). Vores resultater viser således, at i ældede organoider inducerer akkumulering af DNA-skader npGH, som igen nedregulerer p53.

Det er vigtigt, at da npGH udskilles lokalt fra DNA-beskadigede celler, kunne en parakrin virkning for udskilt GH på naboceller være operativ. Mens vi dyrkede GH-udtrykkende hNCF med Colon Intestine-Chip, observerede vi øget DNA-beskadigelse og proliferation og nedregulerede p53/p21 i chip-indlejrede epitelceller udsat for de parakrine virkninger af fibroblast-afledt op. Disse resultater tyder på, at lokal ikke-induceret aldring i humant væv ændrer vævsmikromiljøet ved at undertrykke tumorsuppressorproteiner og øge epitelproliferation og DNA-skade.

Resultaterne stemmer overens med observationer af, at eksogen GH-behandling øger proliferativ kapacitet, kolonidannelse og metastaser i DJ-1 KO-mus (Chien et al., 2016), og med beviser for, at GH-induktion i humane tumorceller er forbundet med progressionen af ​​flere kræftformer (Perry et al., 2017); disse stemmer overens med vores resultater, der viser færre koloniformationer og mindre kolonistørrelse med GH-undertrykkelse.

DNA-skade reparationsveje beskytter mod kromosomal ustabilitet, der driver cellulær transformation (Negrini et al. 2010). For eksempel aktiverer Tip60 ATM (Jackson og Bartek, 2009), og ATM, en central regulator af DDR, phosphorylerer og stabiliserer p53. Aldrende celler udviser reduceret ATM- og p53-undertrykkelse, såvel som DNA-reparationsdysregulering med efterfølgende ikke-repareret DNA-skade (Lan et al., 2019). I tyktarmsceller ophobes DNA-skader således med alderen (Risques et al., 2008; Schu-macher et al., 2008), i det mindste delvist på grund af faldende DDR-effektivitet (Jackson og Bartek, 2009) og undertrykte p53 i respons på y-bestråling i aldrende mus blev tilskrevet aldersrelateret fald i p53-stabiliserende ATM (Feng et al, 2007). I vores eksperimenter undertrykte ikke induceret som reaktion på DNA-skade også Tip60, hvilket sandsynligvis førte til til nedsat DNA-reparation som vist ved henholdsvis svækket ATM og p53-phosphorylering. Disse resultater tyder på, at lokal npGH-overekspression kan bidrage til aldersrelateret dysreguleret DDR- og DNA-reparation. I ældede organoider svækkede GH-induktion DDR, mens GH-undertrykkelse aktiverede DDR, hvilket fremgår af nedsat DNA-skade. Disse resultater understøttes af vores tidligere observationer om, at blokering af GH-signalering i ANCC førte til nedsat DNA-skade (Chesnokova et al., 2019a). Desuden viser vi, at colon-DNA-skader ikke akkumuleres i colon-målrettede GHRcolKO-mus med udskåret GHR, men den akkumuleres i tyndtarmen, hvor GHR var intakt. Disse resultater, sammen med vores demonstration af, at gamle GHR-7-mus ikke akkumulerer colon DNA-beskadigelse, giver in vivo støtte til hypotesen om, at lokal npGH-induktion med alder kan gøre celler modtagelige for transformation og måske også bidrage til cancerterapiresistens, som er blevet foreslået (Basu og Kopchick, 2019).

Resultaterne vist her rejser også muligheden for, at GH-effekter kan medieres af insulinlignende vækstfaktor 1(IGF1). I modsætning til GH aktiverer IGF1-signalering DNA-reparation i ikke-tumorøse og tumorøse celler (Chesnokova og Melmed, 2020; Chitnis et al., 2014; Turney et al., 2012), og vi har vist, at GH-undertrykkelse af p53 og induktion af DNA skade opstår uafhængigt af IGF1 i normalt tyktarmsvæv (Ches-nokova et al., 2019a, 2019b). I celler og væv, hvori GH aktiverer IGF1, kan sidstnævnte vækstfaktor imidlertid også signalere på en cellespecifik måde for at modvirke GH-virkning på genomstabilitet.

Resultaterne tyder på, at npGH induceret i aldrende tyktarmsvæv som reaktion på akkumuleret DNA-skade letter yderligere DNA-skade og ser ud til at være en negativ determinant for DNA-skadereparation. Ekstrapolering af disse resultater giver en platform for flere potentielle kliniske anvendelser. Da ophobning af DNA-skader er et kendetegn for aldersrelaterede sygdomme, kan målretning af GH-signalering for at blokere autokrine/parakrine virkninger vise sig at være nyttige til at forhindre aldersrelateret epitel-DNA-skade og i sidste ende forbedre progressionen af ​​aldersrelaterede epitelpatologier (Miman et al. ,2016) En sådan tilgang kan også gavne cancerpatienter, der gennemgår DNA-skadelige behandlinger, hvor epitelfeltændringer forårsaget af autokrine/parakrine virkninger kan beskadige normalt nabovæv. I denne forbindelse kan forstyrrelse af GH-signalering med en godkendt GHR-antagonist (List et al., 2011; Trainer et al., 2000) give kliniske fordele. Det er vigtigt, at menneskelig GH er blevet uhensigtsmæssigt promoveret som en ikke-godkendt anti-aging og styrkeforstærkende terapi (Giordano et al., 2008; Holt og Ho, 2019; Medeiros og Siegel Watkins, 2018; Melmed, 2019). I betragtning af de skadelige parakrine virkninger af npGH, som vi rapporterer her, kan langvarig uhensigtsmæssig GH-administration som en anti-aldringseliksir fremkalde GHR-signalering og risikere udvikling af epitelcelle-DNA-beskadigelse såvel som den potentielle aktivering af okkulte proliferative læsioner.

Denne artikel er uddraget fra Cell Reports 37, 110068, 14. december 2021, ª 2021 The Author(s). 1 Dette er en artikel med åben adgang under CC BY-NC-ND-licensen (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)