Omfattende profilering af sekretomformuleringer fra føtale og perinatale humane fostervandsstamceller, del 1

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

Abstrakt:Vi har tidligere rapporteret, at c-KIT plus htaman amnionvæske-afledte stamceller opnået fra resterende prøver af rutinemæssig Ⅱ trimester prænatal diagnose (føtal hAFS) er udstyret med regenerativt parakrint potentiale, der driver pro-overlevelse, anti-fibrotiske og proliferative effekter. have kan også isoleres fra kliniske affaldsprøver i III trimester under planlagte kejsersnit (perinatal hAFS), hvilket giver et lettere tilgængeligt alternativ sammenlignet med føtal hAFS. Ikke desto mindre vides der kun lidt om den parakrine profil af perinatal hAFS. Her giver vi en detaljeret karakterisering af det totale hAFS-sekretom (dvs. hele opløselige parakrine faktorer frigivet af celler i det konditionerede medium, hAFS-CM) og de ekstracellulære vesikler ( hAFS-EV'er) i det, fra Ⅱ trimester føtale versus III trimester perinatale celler. Føtal- og perinatal hAFS blev karakteriseret og underlagt hypoxisk prækonditionering for at øge deres parakrine potentiale. hAFS-CM- og hAFS-EV-formuleringer blev analyseret for protein- og kemokin/cytokinindhold, og EV-lasten blev yderligere undersøgt ved RNA-sekventering. Fænotypen af ​​føtal- og perinatal hAFS sammen med deres tilsvarende sekretomformuleringer overlappede; dog viste føtal hAFS umoden oxidativ phosphoryleringsaktivitet sammenlignet med perinatale. Profileringen af ​​deres parakrine last afslørede nogle forskelle i forhold til svangerskabsstadiet og hypoxisk prækonditionering. Begge cellekilder gav formuleringer beriget med neurotrofiske, immunmodulerende, anti-fibrotiske og endotelstimulerende faktorer, og det umodne føtale hAFS-sekretom blev defineret af en mere udtalt pro-vaskulogen, regenerativ, pro-opløsende og anti-aldringsprofil. Lille RNA-profilering viste mikroRNA-berigelse i både føtal- og perinatal hAFS-EV-last med en stabilt udtrykt pro-resolverende kerne som en referencemolekylær signatur. Her bekræfter vi, at hAFS repræsenterer en tiltalende kilde til regenerative parakrine faktorer; valget af enten føtale eller perinatale hAFS-sekretomformuleringer til fremtidig parakrin terapi bør evalueres under hensyntagen til det specifikke kliniske scenarie.

Nøgleord:fostervand; stamceller; parakrine virkninger; ekstracellulære vesikler; cellekonditioneret medium; kemokin; cytokiner; proteomik; RNA-sekventering; mikroRNA

Klik venligst her for at vide mere

1. Introduktion

Regenerativ medicin har for nylig udviklet sig som et spirende område for at give funktionel genoprettelse af skadet væv ved hjælp af flere strategier. Efterhånden som vævstekniske tilgange er gået betydeligt frem i de seneste år, er undersøgelsen af ​​stamcelle-parakrine virkninger samtidig blevet intensiveret mere og mere. Det terapeutiske potentiale af transplanterede stamceller har i store træk vist sig at være for det meste medieret af deres udskilte opløselige faktorer, som kan orkestrere et pro-regenerativt mikromiljø i værtsvævet, mens det udløser aktiveringen af ​​endogene mekanismer for funktionel genopretning [1,2]. Derfor er stamcellen udskiller hele cellefrigivne parakrine trofiske molekyler, såvel som membranbundne ekstracellulære vesikler, i stigende grad blevet foreslået som et innovativt terapilægemiddel af flere uafhængige prækliniske undersøgelser rettet mod kardiovaskulære, neurologiske og/eller inflammatoriske sygdom. Følgelig kan stamceller forestilles som biologiske fabrikker til udnyttelse af deres terapeutiske sekretom ved at tilbyde brugsklare og off-the-shelf regenerative behandlinger. Ved at anvende en sådan cellebaseret, men alligevel cellefri strategi, kan mange begrænsende aspekter forbundet med kanonisk celleterapi overvindes, mens de stadig sikre gavnlige effekter.hvad er en cistancheI dette perspektiv er mesenkymale stromale celler (MSC) blevet grundigt testet som formodede cellekandidater? Faktisk er MSC og stam-/progenitorceller blevet konstrueret og/eller stimuleret af forskellige prækonditioneringsstrategier for at forbedre deres regenerative kapacitet og sekretoriske potentiale [3,4] med en eksplicit interesse i den biologiske relevans af deres udskilte ekstracellulære vesikler (EV'er).

EV'er er partikler i nanostørrelse afgrænset af et lipid-dobbeltlag og aktivt udskilt af alle celletyper. Elbiler inkluderer meget små (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 nm); de fungerer som kritiske biologiske transportører af intercellulær signalering ved at levere deres molekylære last fra en forældrecelle til en responder/målgruppe [5,6]. I betragtning af, at deres særlige parakrine potentiale ved at udøve gavnlige virkninger er sammenlignelige med deres oprindelsesceller, er stamcelle-EV'er opstået som tiltalende terapeutiske muligheder i prækliniske modeller af sygdomme, såsom iskæmi, inflammation eller skade, som udførligt gennemgået i [{{3 }}]. Fra et translationelt perspektiv, oven i cellemodulerende potentiale, er isolationsgennemførlighed og forhøjet selvfornyelse nøgleaspekter af den ideelle kilde til terapeutiske elbiler og opløselige faktorer. I et sådant scenarie kan føtal- og perinatal MSC tilbyde en interessant mulighed i betragtning af deres proliferative potentiale og udviklingsmæssigt umodne profil med mellemliggende træk mellem embryonale og voksne somatiske stamceller [10,11]. Føtal MSC kan isoleres fra ekstra-embryonale annekser under graviditeten som resterende prøvetagning opnået under prænatal screening (dvs. chorionvilli [12-14] og fostervand [15,16]) eller opnås som perinatale stamceller ved fødslen, fra klinisk affaldsmateriale (dvs. foster- og placentamembraner [17-21], navlestrengskomponenter [22-24] og term fostervand [25,26]).

Cistanche kan anti-aging

Navnlig er humane fostervandstamceller (hAFS) blevet fremhævet som lovende terapeutiske strategier inden for regenerativ medicin. og har vist sig at være bredt multipotente in vitro og in vivo [16,27,28], bidrager til den hæmatopoietiske afstamning efter in utero-transplantation [29], og transplanterer i skadede organer, mens de udøver immunmodulerende virkninger [26,30] og aktiverer endogene reparative responser, som udførligt beskrevet i [31]. Vores team og andre har yderligere demonstreret, at hAFS frigiver et sekretom, der er stærkt beriget med bioaktive trofiske molekyler, der er i stand til at målrette mod forskellige reparative mekanismer. hAFS parakrine faktorer er blevet rapporteret at give pro-overlevelsesstimuli med dæmpning af inflammation [32], yde kardiobeskyttelse mod langvarig iskæmi [33.34] og kardiotoksicitet [35] og stimulere lokal angiogenese med kardiomyocytcellecyklus genindtræden [ 34,36]. Da de fleste af disse effekter har vist sig at blive rekapituleret af hAFS-EV administration alene, har uafhængige undersøgelser fokuseret på at dissekere deres regenerative profil mod forskellige patologiske baggrunde, herunder skelet- og hjertemuskelskade, nyresygdom, slidgigt, osteoporose, nekrotiserende enterocolitis og neurodegenerativ modeller [34,37-44].

Selvom evidens kan understøtte den kliniske oversættelse af hAFS-EV'er til fremtidig parakrin terapi, er det vigtigt at overveje, at de fleste af disse undersøgelser hovedsageligt har undersøgt det modulerende potentiale af føtal hAFS opnået under prænatal screening i Ⅱ trimester. Faktisk er en komplet profil af sekretomet fra den perinatale har modpart (dvs. fra III trimester c-sektioner) er endnu ikke blevet undersøgt i detaljer. Tredje trimester perinatal hAFS har vist karakteristiske immunregulerende egenskaber sammenlignet med mig- og II-trimester [26], mens de har bibeholdt relevant endotel regenerativt potentiale [25].hvor meget cistanche at tageDet skal bemærkes, at den nylige rapport om den heterogene morfologi af føtalt hAFS[45] har givet ny indsigt i deres stamness og genekspressionsprofil.bioflavonoiderDette har totalt kastet nyt lys over den regenerative værdi af de forskellige cellulære fraktioner af hAFS[46]. Derfor tiltrækker omfattende karakterisering af de forskellige underpopulationer af hAFS stigende opmærksomhed. Vi har tidligere rapporteret, at en 24 timers hypoxisk og serumfri stimulering repræsenterer en effektiv strategi til at booste det parakrine potentiale af Ⅱ trimester føtal hAFS [34,35,37]. Da der er lidt kendt om sammensætningen af ​​sekretomet fra III trimester hAFS, rapporterer vi her den omfattende sammenligning af Ⅱ versus Ⅲ trimester hAFS og deres sekretomfraktioner (inklusive hatte-EV'er), for at adressere indflydelsen af ​​svangerskabsstadiet og hypoxiske celler prækonditionering af celle- og sekretomegenskaber.

2. Resultater

2.1.Perinatal hAFS Præsenterer en tæt fænotypisk match til føtal har

Der blev ikke vurderet nogen statistisk relevant forskel i donoralder mellem fostervandsprøver fra føtal Il trimester og perinatal III trimester. Foster c-KIT* hAFS (f-hAFS fra II trimester fostervandsprøver) og perinatal c-KIT* hAFS (p-hAFS fra III trimester fostervand klinisk affald) bekræftede lignende træk med fibroblastlignende og oval-rund morfologi (figur 1A) og mesenkymal stromal fænotype (data ikke vist), som tidligere rapporteret [16,25]. Både f-hAFS og p-hAFS dyrket in vitro op til passage 5 viste ubetydelige niveauer af senescens fra alderdomsassocieret- -galactosidase (SA- -Gal) aktivering i omkring 4 procent af cellerne (figur 1B) . Både f-hAFS og p-hAFS præsenterede et højt niveau af co-ekspression af de mesenkymale markører CD107a og CD146, som for nylig er blevet rapporteret at definere en meget sekretorisk fænotype[47]. CD107at CD146*-celler repræsenterede størstedelen af ​​f-hAFS-populationen (ca. 64 procent,*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

Figur 1. Fosteret har og perinatalt har fænotypisk evaluering. (A) Repræsentative billeder af føtal hAFS (f-hAFS, venstre panel) og perinatal hAFS (p-hAFS, højre panel) dyrket in vitro under standardbetingelser; målestok: 200 um. (B) Analyse af den senescerende markør beta-galactosidase(SA- -Gal, i blåt) via cytokemifarvning på f-hAFS og p-hAFS efter 5 passager i kultur; Repræsentative billeder rapporteres i venstre panel, skalabjælke: 200 um. Den tilsvarende procentdel af -Gal-positive celler/felt er rapporteret i grafen i højre panel (f-hAFS:4,12±0,58 procent og p-hAFS:3,88±2,10 procent ;p=0.1424,n{ {24}} eksperimenter). (C) Immunfænotype af hAFS, der udtrykker CD146 og CD107a mesenkymale markører. Repræsentative flowcytometri plots af f-hAFS og p-hAFS (venstre panel) og tilsvarende værdier refereret til dobbelt positive CD107a plus CD146 plus celler; CD107a plus CD146* f-hAFS:63,68±5,82 procent ,*p=0.016sammenlignet med restg36,32±5,82 procent f-hAFS (Andet);CD107at CD146 plus p-hAFS:52,07±6,47 procent med resterende. 93±56,76 procent p-hAFS (Andet); CD107a plus CD146 plus f-hAFS vs CD107a plus CD146 plus p-hAFS p=0.2403,n=4 eksperimenter. Andet: samlet mængde resterende CD107a-CD146~hAFS, CD107a~CD146*hAFS og CD107at CD146-hAFS. Alle værdier er udtrykt som middelværdi ± sem af uafhængige eksperimenter. SA- -Gal: Alderdomsassocieret- -galactosidase.

2.2.Fetal hAFS viser en anden metabolisme end perinatal hAFS

For at evaluere, om svangerskabsstadiet kan påvirke mitokondriel metabolisme, blev f-hAFS og p-hAFS analyseret i standard in vitro kulturbetingelser ved biokemiske analyser. Evaluering af aerob metabolisme viste, at iltforbrugshastigheden (OCR) og ATP-syntese var lavere i f-hAFS i forhold til p-hAFS, både når de blev stimuleret med pyruvat plus malat (P/M;***p)<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3. Hypoxisk prækonditionering påvirker ikke føtal og perinatal har levedygtighed og opretholder deres sekretoriske aktivitet

For at definere hAFS-sekretomformuleringer blev celler dyrket under serumfrie betingelser for at undgå enhver kontaminering fra FBS. Vi har tidligere vist, at 24 timers serumfri (SF) og 1 procent O2 hypoxiske dyrkningsbetingelser ikke signifikant ændrede levedygtigheden af ​​Ⅱtrimester føtal hAFS (f-hope), mens de understøttede frigivelsen af ​​regenerative parakrine faktorer i deres cellekonditionerede medium (hAFS-CM) og i ekstracellulære vesikler (hAFS. EVs)[34,35,37,49]. Heri, ud over at profilere p-hAFS-sekretomfraktionerne for første gang, evaluerede vi, om p-har præsenteret lignende adfærd under det samme prækonditioneringsregime ved at bruge den normoxiske kulturbetingelse som kontrol. f-hAFS og p-hAFS levedygtighed blev analyseret efter 24 timer i følgende indstillinger: normoksisk (20 procent O2) tilstand i komplet kontrol (Ctrl) kulturmedium (Ctrlf-hAFSnormo og Ctrl p-hAFSnormo), en normoksisk tilstand i SF medium (SF f-hAFSnormo og SF p-hAFSnormo), hypoxisk (1 procent O2) tilstand i komplet kontrolmedium (Ctrlf-har hypo og Ctrl p-hAFSnypo) og hypoksisk tilstand i SF medium (SF f-har hypo og SF p -har hypo, figur 3A). Vi bekræftede, at f-has levedygtighed var uændret under både Ctrl- og SF-betingelser og under hypoxisk stimulering, hvor mere end 80 procent (op til næsten 88 procent) af de samlede celler var upåvirkede. Tidlige og sene apoptotiske celler varierede fra ca. 13 procent til 18 procent i SF-forhold, uden nogen statistisk signifikant relevans. Ligeledes var perinatal levedygtighed i intervallet 80-92 procent, og tidlige og sene apoptotiske celler repræsenterede op til 18 procent under SF-betingelser. p-hAFS var kun marginalt påvirket under de kombinerede hypoxiske og SF-betingelser; medens prækonditionering ikke påvirkede celleoverlevelse, når p-hAFS blev dyrket i et komplet medium, viste den tilsvarende SF-tilstand en stigning med ca. 4-fold (* s<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

Figur 2. Metabolisk karakterisering af føtal- og perinatalhAFS. (A) Oxygenforbrugshastighed (OCR), ATP-syntese gennem F1-F.ATP-syntase og P/O-forhold i f-have og-have i nærvær af pyruvat plus malat (P/M) eller succinat (Succ);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistanche AustralienSammenligningen af ​​procentdelen af ​​inhibering af OCR- og ATP-syntese i f-og-hAFS på grund af inhibitorerne angivet ovenfor er rapporteret i det nederste panel B. For OCR-eksperimenter: hAFS plus Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

Vi evaluerede derefter udbyttet af sekretomfraktioner opnået fra f-hAFS versus p-hAFS baseret på proteinberigelse. Totalen har sekretom, da helheden af ​​de celleudskilte parakrine faktorer her er repræsenteret ved hAFS-CM. Proteinkoncentrationen af ​​f-hAFS-CM og p-hAFS-CM i SF-medium efter hypoxisk celleprækonditionering vs kontrolnormoksisk tilstand som baseline (nemlig f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo og p -hAFS-CMHypo,) blev evalueret ved BCA-assay og målt i henhold til 10§ celler.cistanchDe opnåede resultater tydede på, at f-has-CM og p-hAFS-CM viste en lige positiv tendens i proteinberigelse efter hypoxisk priming (f-hAFS-CMnypo'166.10±22.13 ug/10 gradceller;p-hAFS-CMNypo∶182,30±29,71 ug/10 gradsceller） over deres normoksiske modstykker (f-hAFS-CMnormo:105,50±19,89 ug/10 graders celler; p- hAFS-CMhypoi 91,12±24,39 ug/10 graders celler. Ligeledes blev overfladeproteinkoncentrationen af ​​hAFS-EVs målt i f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-hAFS-EVSnormo og p-hAFS-EVShypo EV'er viste sammenligneligt udbytte, når de blev opnået fra f-hAFS eller p-hAFS. Som for hAFS-CM-formuleringer, var en positiv tendens i stigningen i proteinindholdet på f-hAFS-EV'er og p-hAFS. EV'er blev værdsat efter hypoxisk stimulering over tilsvarende normoksisk tilstand （f-hAFS-EVSHypo∶2,03±0,67 ug/10 graders celler og p-hAFS-EVSHypo∶1,85±0,47 ug/10 graders celler;f-have-EVsnormo∶1,28±0,36 ug/10 grader -hAFS-EVsnormo∶1,19±0,31 ug/10 graders celler, figur 3C).

2.4.Føtale- og perinatale hAFS-frigivelses-EV'er med analog morfologi og størrelsesfordeling

Morfologisk analyse ved transmissionselektronmikroskopi (TEM) øgede den høje EV-sekretoriske prolife af både f-hAFS og p-hAFS (figur 4). Vi undersøgte yderligere størrelsen og arealet af f-hAFS-EV'er og p-hAFS-EV'er (figur 4B) efter hypoxisk prækonditionering sammenlignet med normoxisk baseline. Føtal- og perinatal har frigivet EV'er af heterogene størrelse, i intervallet 40-250 nm, og inkluderer derfor både exosomer/små EV'er og mikrovesikler/udskillende vesikler. Den gennemsnitlige størrelse af EV'er/felt i de forskellige grupper var sammenlignelig, føtale hAFS-EV'er målte 90-100 nm (f-hAFS-EVsnormo:104.00 ±3.00 nm;f -have-EVSHvpo:97.10±10.10 nm)og perinatale målt 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo:94.60±19.53 nm; p-hAFS-EVShypo:76.43±4.86 nm, nm, 4B, venstre panel). Hvad angår udbyttet, viste hAFS stimuleret under hypoxi en positiv tendens i stigningen i mængden af ​​små elbiler, selvom denne stigning ikke var statistisk signifikant. f-hAFS-EVStypo målte 40-70 nm, hvilket var næsten det dobbelte sammenlignet med deres normoksiske modstykke. Perinatal-has-EVSHypo, der målte 40-70 nm, 70-100 nm og 100-130 nm, var næsten tredobbelt i forhold til dem, der blev opnået i normoksisk kultur (figur 4B).

Nanopartikelsporingsanalyse (NTA) viste et forhøjet antal partikler i både f-hAFS-EV og p-hAFS-EV præparater og bekræftede stigningen af ​​EV'er i de hypoxiske prøver, som også observeret fra de tidligere analyser (f-hAFS- EVsnormo:182±0.10'partikler/10 graders celler; f-have-EVshypo: 3,30±0,22×10 graders partikler/10 graders celler ;p-hAFS-EVsnormo:2,43±0,80×10 graders partikler/10 graders celler; p-hAFS-EVshypo:3,05±0,62x10 graders partikler/10 graders celler, figur 4C).

Figur 4. Morfologisk karakterisering af føtal- og perinatale have-EV'er. (A) Repræsentative billeder af transmissionselektronmikroskopi (TEM) af f-hAFS og p-hAFS (henholdsvis øverste og nederste venstre panel med sorte pile, der indikerer intracytoplasmatiske multi-vesikulære legemer med små EV'er / exosomer indeni dem) og af f -hAFS-EV'er og p-hAFS-EV'er (henholdsvis øverste og nederste højre panel) frigivet under serumfrie forhold og under normoxisk versus hypoxisk prækonditionering (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo; og henholdsvis f-hAFS-EVshypo), skala søjler: 200 nm. (B) Venstre panel: TEM-analyse af hAFS-EVs størrelsesfordeling; højre panel: fordeling af antallet af f-hAFS-EV'er og p-hAFS-EV'er pr. feltstørrelsesintervaller fra 40 nm op til 250 nm blev overvejet; værdier er udtrykt som gennemsnit±sæd af n=3 uafhængige eksperimenter. (C) Nanopartikelsporingsanalyse for hAFS-størrelse og distribution. Venstre panel: repræsentativt billede af det grafiske output; højre panel: hAFS-EVs-koncentration målt som 10 graders partikler pr. 10 graders udskillende celler; nm: nanometer; ml: milliliter.

2.5.Proteomisk karakterisering af føtal vs. perinatal hAFS fremhæver forskelle i deres sekretomsammensætning i henhold til svangerskabsalder og hypoxisk prækonditionering

Proteomisk karakterisering af både f-hAFS- og p-hAFS-sekretomformuleringer blev udført ved hjælp af en shotgun-mærkefri platform, baseret på koblingen af ​​nanovæskekromatografi og højopløsningsmassespektrometri (nLC-HRMS). Otteogfyrre proteomiske profiler blev erhvervet ved dobbeltanalyse af tre biologiske replikater af hAFS-CM og have-EV'er fra f-hAFS og p-hAFS, der undergik hypoxisk celleprækonditionering sammenlignet med den normoxiske tilstand som kontrol. I alt 4179 forskellige proteingrupper blev identificeret med mindst ét ​​unikt peptid og med molekylvægte fra 2 til 3900 kDa og isoelektriske punkter fra 3,6 til 13. En højere gennemsnitlig proteinekspression i hAFS-EV'er blev observeret sammenlignet med hAFS-CM . Justeringen af ​​alle opnåede proteinlister blev udført på basis af identificerede proteiner. For hver eksperimentel tilstand blev der oprettet en unik liste, der normaliserer og gennemsnit[50] peptidspektrummatchværdierne (PSM'er) tilskrevet proteinerne, som repræsenterer antallet af massespektre tildelt hver og indirekte repræsenterer deres overflod i prøverne. Den komplette liste over proteiner identificeret i hAFS-CM og have-EV-formuleringer er rapporteret i tabel S1.

Anvendelsen af ​​lineær diskriminantanalyse (LDA[51]) på denne masterliste tillod ekstraktion af statistisk signifikante proteiner (Fratio større end eller lig med 4,5 og** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 i hAFS-CM og har-EV-formuleringer betragtet separat. Mens omkring 69,5 procent og 69,9 procent af proteinerne blev delt mellem hAFS-EV'er og hAFS-CM-betingelser, så det resterende indhold ud til at være eksklusivt i forskellige proportioner, varierende fra 3,7 procent til 13,4 procent, blandt formuleringerne.

For at undersøge de proteomiske ændringer kvantitativt blev der udført en mærkefri differentialanalyse ved at bruge den hjemmelavede MAProMa-software og anvende to algoritmer, DAve (Differential Average) og DCI (Differential Confidence Index, der repræsenterer forholdet og tilliden til differentielt udtryk, henholdsvis), på PSM'erne for hvert enkelt protein mellem de to sammenlignede udtryk. Brug af stringente filtre til DAve og DCI for at maksimere sikkerheden ved identifikation og til at overveje proteiner med en variation større end en foldændring på 1,5, parvise sammenligninger af f-hAFS-CM versus p-hAFS-CM og af f-hAFS-EVs versus p-hAFS-EV'er blev lavet i henhold til celle-gestationsstadiet. I alt 58 og 109 proteiner blev fundet differentielt udtrykt i henholdsvis de ovennævnte has-CM- og have-EV-rum (figur S1B, C for udvalgte detaljer og tabel S2-S3 i udvidet form). Blandt disse resulterede 30 proteiner opreguleret i f-hAFS-CM og 28 blev opreguleret i p-hAFS-CM (figur S1B); ligeledes resulterede 44 forskellige proteiner i opregulerede i f-have-EV'er, og 65 blev opregulerede i p-hAFS-EV'er (figur S1C). Især skal proteiner, der resulterede i opreguleret i f-have, betragtes som nedregulerede i p-has og omvendt.

værdier er rapporteret; se tabel S2 for den komplette liste og detaljerede parametre for de rapporterede proteiner. (C) Biologiske processer berigelsesanalyse af proteiner identificeret med en frekvens på mindst 2 i føtal hAFS-CM (venstre panel) og perinatal have-CM (højre panel) i henhold til cellehypoxisk prækonditionering. Baseret på FunRich-værktøjet vises genontologitermer i søjlediagrammer, der rapporterer procentdelen af ​​gener beriget for hver kategori (lyserøde søjler for-have-CMnormo, lilla søjler for f-hAFS-CMhypor lyseblå søjler for p-hAFS-CMnormo, og blå kugler for p-hAFS-CMhypo).køb cistancheKun genontologiske termer med Bonferroni korrigeret med*p<0.05 are="">

Denne artikel er uddraget fra Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms