-Liponsyre øger kollagensyntese og aflejring i ikke-diabetiske og diabetiske rottenyrer

Nevena Grdović et al

-Liponsyre (ALA) bruges i vid udstrækning som et kosttilskud og terapeutisk middel til behandling af diabetes. Veletablerede antioxidant- og hypoglykæmiske effekter af ALA blev anset for at være særligt vigtige i bekæmpelsen af ​​diabetiske komplikationer, herundernyreskade. Denne undersøgelse evaluerede potentialet af ALA til at påvirke profibrotiske hændelser inyresom kunne ændre dens struktur og funktion. ALA blev indgivet intraperitonealt (10 mg/kg) til ikke-diabetiske og streptozotocin-inducerede diabetiske Wistar-hanrotter i 4 og 8 uger. Effekterne af ALA blev vurderet startende fra strukturelle/morfologiske ændringer gennem ændringer, der karakteriserer profibrotiske processer, til regulering af kollagen-genekspression inyre. Her viste vi, at ALA forbedrede systemisk glukose- og urinstofniveau, reducerede dannelsen afnyreavancerede glycation slutprodukter (AGEs) og opretholdt renal strukturel integritet hos diabetiske rotter. Imidlertid blev profibrotiske hændelser fremkaldt i diabetes ikke lindret af ALA, da kollagensyntese/aflejring og ekspression af transformerende vækstfaktor- 1 (TGF- 1) og -glatmuskelaktin (-SMA) forblev forhøjet i ALA- behandlede diabetiske rotter, især efter 8 ugers diabetesdebut. Desuden førte 8 ugers behandling af ikke-diabetiske rotter med ALA til udviklingen af ​​profibrotiske egenskaber, der afspejles i øget kollagensyntese/aflejring. Udover TGF- 1-nedstrømssignalering involverer den yderligere mekanisme, der ligger til grund for opreguleringen af ​​kollagen IV i ikke-diabetiske rotter behandlet med ALA, nedsat DNA-methylering af dets promotor, der kunne opstå fra øget Tet1-ekspression. Disse resultater understreger den terapeutiske forsigtighed ved brugen af ​​ALA, især hos patienter mednyrediabetikerkomplikationer.

For flere oplysninger: ali.ma@wecistanche.com

Klik på Cistanche-ekstraktpulver til nyresygdom

1. Introduktion

Diabetikernyresygdom (DKD) eller diabetisk nefropati er en af ​​de mikrovaskulære komplikationer med en forekomst på 20-40 procent blandt diabetespatienter, som er ledsaget af progressive strukturelle ændringer og tab af nyrefunktioner [1]. Den patofysiologiske mekanisme, der ligger til grund for DKD, er kompleks og starter med kronisk hyperglykæmi, der igen udløser oxidativt stress, dannelse af avancerede glycation slutprodukter (AGEs), aktivering af MAPK/PKC signalveje og efterfølgende ekspression af adskillige proinflammatoriske og profibrotiske mediatorer [2, 3]. Krydstale mellem disse hændelser resulterer i akkumulering af ekstracellulære matrix (ECM) proteiner i mesangium og tubulointerstitium med et klassisk histopatologisk mønster afnyrefibrose. Det starter med strukturelle ændringer såsom fortykkelse af basalmembranen og mesangial ekspansion, der gradvist udvikler sig til glomerulosklerose og interstitiel fibrose, der til sidst kulminerer inyrefiasko[4, 5].

Transformerende vækstfaktor- 1 (TGF- 1) downstream-signalering er en del af sårhelingsprocessen, der ved vedvarende betændelse, hyperglykæmi eller oxidativt stress, der karakteriserer diabetes, omdannes til patofysiologisk fibrose [6] . TGF - 1 er en central mediator af DKD-patogenese, der er den vigtigste regulator af ECM-proteinekspression hos patienter med diabetes, sandsynligvis som følge af det hyperglykæmiske og forstyrrede oxidative miljø [7-10]. TGF- 1 inducerer ECM-akkumulering ved stimulering af type I- og IV-kollagen, -glatmuskelaktin (-SMA), laminin- og fibronectinsyntese samt ved inhibering af ECM-nedbrydende enzymer [11].

Kollagen type IV er den mest udbredte bestanddel af basalmembranen [12], udtrykt i glomerulære og tubulære basalmembraner under fysiologiske forhold [13]. Imidlertid er diabetisk nefropati ledsaget af en afvigende ekspression af kollagen type IV, som omfatter overdreven produktion og uregelmæssig fordeling gennem interstitium og mesangium [14-16]. Blandt seks isoformer af type IV kollagen (1- 6), er 1(IV) og 2(IV) universelt til stede i alle basalmembraner. Kollagen 1(IV)- og 2(IV)-kæder kodes af Col4a1- og Col4a2-gener, hvis transkriptionelle regulering afspejler velbeskrevne cis-trans-interaktioner [17], men nyere fund fremhæver den vigtige rolle af epigenetiske mekanismer, herunder DNA-methylering, i reguleringen af ​​deres udtryk [18-20].

I lyset af patofysiologiske mekanismer, der ligger bag DKD, er behandlingsstrategier ligetil og retter sig mod hyperglykæmi og oxidativt stress. Det hypoglykæmiske og antioxidantpotentiale af ALA, som er en af ​​de meget anvendte antioxidanter, har vist sig at forbedrenyrepatologiske ændringer forbundet med diabetisk nefropati [21-23]. Men relateret til hudens aldring blev de gavnlige virkninger af ALA gennem øget kollagen type I syntese i humane dermale fibroblaster rapporteret [24]. I betragtning af patofysiologien af ​​DKD kan en lignende effekt af ALA være skadelig for diabetespatienter mednyrekomplikationer. Med denne baggrund var nærværende undersøgelse fokuseret på at evaluere virkningerne af ALA på renale strukturelle/morfologiske træk og profibrotiske processer med vægt på kollagen type IV genekspression hos diabetiske og ikke-diabetiske rotter.

2. Materiale og metoder

2.1.Dyr, behandlinger og forsøgsopsætning.Alle eksperimenter blev udført på 2.5-måneder gamle albino Wistar hanrotter, der vejede mellem 220 og 250 g. Alle dyreprocedurer godkendt af den etiske komité for brug af forsøgsdyr fra Instituttet for Biologisk Forskning "Siniša Stan-ković," Universitetet i Beograd var i overensstemmelse med direktivet 2010/63/EU om beskyttelse af dyr anvendt til forsøg og andre videnskabelige formål. Dyrene i denne undersøgelse blev aflivet ved en fysisk aflivningsmetode ved hjælp af en guillotine i henhold til alle anbefalinger i retningslinjerne for aflivning af dyr. Døden indtræder øjeblikkeligt, og dyrene led ikke. Aflivning blev udført i operationsstuen, adskilt fra staldrummet, et dyr efter et (resten af ​​dyrene i forsøget blev holdt i forsøgsrummet, som er adskilt fra operationsstuen, hvor der blev udført aflivning for at undgå stress for den anden dyr). Eutanasi blev udført af veltrænede og erfarne stuFF. Udstyret, der blev brugt til halshugning, var i god stand (services er regelmæssigt for at give knivene skarphed).

Diabetes blev induceret af multiple lavdosis (40 mg/kg) injektioner af streptozoticin (STZ) (MP Biomedicals) i fem på hinanden følgende dage; kontrolrotter blev injiceret med bæreren alene (0,1 M natriumcitratbuffer, pH 4,5). Blodsukkerniveauet blev målt 24 timer efter den sidste STZ-injektion med et Accu-Chek Active blodglucometer, og dyrene blev betragtet som diabetikere, når det fastende blodsukkerniveau oversteg 20 mmol/l. Rotterne blev tilfældigt opdelt i fire forsøgsgrupper: kontrol (kontrol, n=8), kontrol behandlet med ALA (ALA, n=8), diabetiker (STZ, n=10) og diabetikergruppe behandlet med ALA (STZ/ALA, n=10). ALA (Ivančić i synovial, Beograd, Serbien) blev injiceret intraperitonealt (10 mg/kg) hver dag i 4 og 8 uger, startende fra den sidste STZ-injektion. Efter ofring og blodopsamling blev der lavet et abdominalsnit og begge delenyrerblev fjernet. Ennyreblev frosset i flydende nitrogen, holdt ved -80 grad og brugt til protein-, DNA- og RNA-isolering, mens den anden blev fikseret i 10 procent bufret formalin til histologiske undersøgelser.

2.2.Biokemisk analyse.Rotter har fastet natten over før de blev ofret. Blodserum blev opsamlet efter blodkoagulering og centrifugering ved 2,000 g i 10 min. Serumet blev brugt til bestemmelse af glukosekoncentrationer med et kommercielt kit (Gluco-quant Glucose/HK; Boehringer), serumtriglyceridniveau ved GPO-PAP-metoden under anvendelse af et enzymatisk kit (Randox Laboratories, UK), urinstofniveau ved Urea Assay Kit (Abcam, USA), og kreatininkoncentrationer ved hjælp af Caymans kreatininanalyse i henhold til producentens instruktioner.

2.3.Histologisk analyse og immunfarvning.Formalin-fikseretnyrevæv blev dehydreret i en aftagende serie af xylol og alkoholer til posterior inklusion i parafinblokke. Vævsblokke blev sektioneret ved 5 μm på en roterende mikrotom (RM 2125RT; Leica Microsystem). For at observere ændringer i nyremorfologi blev vævssnit farvet ved hjælp af Periodic Acid-Schiff (PAS) metoden. Yderligere blev farvede sektioner analyseret ved hjælp af Olympus-mikroskop (BX-51) udstyret med en mikroaktuator, motoriseret scene og kamera, styret af den nye CAST stereologiske softwarepakke Visiopharm Integrator System. De rørformede lumenområder blev opnået ved objektiv forstørrelse 40x og udtrykt som en procentdel (procent) pr. undersøgt område. Mesangial matrixfraktion blev evalueret som arealet af positiv PAS-farvning, udtrykt som procent pr. totalt glomerulært areal (objektiv forstørrelse 100x).

Til påvisning af kollagenfiber blev vævssnit farvet med Masson trichromfarvning. Efter farvning blev snit observeret under et lysmikroskop (DM RB Photomicroscope Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Tyskland, udstyret med Leica DFC 320 CCD-kamera; objektiv forstørrelse 40x). Billedanalyse blev udført af ImageJ-software (version 1.52p, National Institutes of Health). Billeder blev konverteret til RGB-stabler, og manuel tærskelværdi blev anvendt for at evaluere andelen af ​​kollagenareal pr. vævsområde.

Immunhistokemisk analyse blev udført som beskrevet i [25] under anvendelse af polyklonalt antistof mod N(?)-(carboxymethyl)lysin (CML) (fortynding 1:50) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) og sekundært antistof peberrodsperoxidase (1: 100) (Santa Cruz Bioteknologi). Vævssnit blev farvet med 3,3'-diaminobenzidin (DAB), modfarvet med hæmatoxylin og monteret og observeret under et lysmikroskop (Leica DM RB fotomikroskop; objektiv forstørrelse 40x). Billedanalyse blev udført af ImageJ-software (version 1.52p, National Institutes of Health). Billeder blev behandlet ved farvedekonvolution med H DAB-vektorindstillingen. CML-signalering blev beregnet som den gennemsnitlige grå intensitet af DAB-farvning normaliseret til antallet af kerner (opnået ved hjælp af Analyser Particles option).

2.4.Western blot-analyse.25 ug afnyrehomogenater blev adskilt ved SDS-PAGE, overført til polyvinylidendifluoridmembraner og probet med polyklonalt antistof mod GAPDH (FL-335) og monoklonale antistoffer mod rotte-TGF- 1 (3C11) og SMA (CGA7) alle fra Santa Cruz Biotechnology og alt fortyndet i forhold 1:1,000. Detektion blev udført af et forbedret kemiluminescensdetektionssystem (Santa Cruz Biotechnology). Kvantificering af de immunoreaktive bånd blev udført ved hjælp af TotalLab (Phoretix) elektroforesesoftware (version 1.10) og normaliseret til GAPDH, der blev brugt som belastningskontrol.

2.5. Real-Time Kvantitativ PCR (RT-qPCR).Total RNA blev isoleret franyrerved hjælp af RNeasy Mini Kit (Qiagen). Til cDNA-syntese blev 1 ug af det totale RNA behandlet med DNase I og revers-transkriberet med RevertAid First- Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Burlington, Canada) under anvendelse af en blanding af tilfældige hexamer og oligo (dT) primere. Niveauer af mRNA blev kvantificeret ved hjælp af 2x Maxima SYBR Green/- ROX qPCR Master Mix (Fermentas) på et QuantStudio 3 Real-Time PCR-system (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) blev brugt til at designe primerne (angivet i supplerende tabel S1) til vurdering af Col4a1, Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b og Tet1-genekspressioner. De termiske cyklusser bestod af indledende denaturering ved 95 grader/10 minutter og 40 cyklusser af to-trins PCR ved 95 grader/15 s og 60 grader/60 s. mRNA-ekspressionsniveauerne for generne af interesse blev normaliseret til mRNA-ekspressionsniveauet for Actb som referencegen ved 2-dCT-metoden.

2.6. Genomisk DNA-isolering og bisulfitkonvertering af DNA.Genomisk DNA blev isoleret ved hjælp af Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB) tilgang [26], i henhold til protokollen for DNA-ekstraktion fra pattedyrvæv (tilgængelig online på https://bomb.bio/protocols/). Genomisk DNA blev udsat for BOMB-bisulfitkonverteringsprotokol (tilgængelig online på https://bomb.bio/protocols/) [26].

2.7. Måling af globale niveauer af DNA-methylering.Globale DNA-methyleringsniveauer blev målt ved hjælp af 5-mC DNA ELISA-kittet (Zymo Research, Californien, USA) i henhold til producentens instruktioner. Oprenset genomisk DNA (100 ng) isoleret franyrerfra alle forsøgsgrupper blev anvendt, og hver prøve blev analyseret i to eksemplarer. Statistisk signifikans blev estimeret ved hjælp af envejs ANOVA med blokering, idet hver ELISA-plade blev behandlet som en blok.

2.8. Methyleringsspecifik PCR (MSP).Primerpar til MSP-analyse, designet på promotorregionen af ​​Col4a1, der omfatter transkriptionsstartsted (TSS), blev designet ved hjælp af MethPrimer (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi) (Supplerende tabel S2) ). Positioner af primere (i forhold til TSS for Col4a1, markeret som plus 1), der bruges til MSP-analyse, er som følger: M fw (-35, -14), M rev (plus 44, plus 64), U fw (-35, -14) og U rev ( plus 45, plus 69). Da hver primer dækker 2 CpG'er, blev 4 CpG'er i alt testet for methyleringsstatus pr. primerpar. Reaktionsblandingen for MSP indeholdt Maxima SYBR Green/ROX qPCRqRT-PCR Master Mix (Fermentas), 20 ng bisulfitkonverteret DNA og 0,5 μM af hver primer specifik for methyleret (M) og umethyleret (U) DNA ved et slutvolumen på 10 μL. MSP blev udført på QuantStudio 3 Real-Time PCR-systemet (Applied Biosystems). PCR-cyklusbetingelser var som følger: indledende denatureringstrin ved 95 grader/10 min og efterfulgt af 40 denatureringscyklusser ved 95 grader/15 s og annealing og forlængelse ved 58 grader/60 s. Det relative niveau af methyleret DNA blev udtrykt ved hjælp af methyleringsindekset defineret som 2 (demethyleret cyklus Ct) - (methyleret cyklus Ct) [27].

2.9.Statistisk analyse.Dataene blev udtrykt som middelværdien ± SD (standardafvigelse) for alle undersøgte parametre. Elevens t-test blev brugt til at sammenligne middelværdier af normalfordelte variable mellem to grupper. Statistiske forskelle mellem grupper blev analyseret ved hjælp af en-vejs variansanalyse (ANOVA), efterfulgt af Tukey multiple sammenligningstest ved hjælp af GraphPad Prism Software, ver. 5.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

3. Resultater

3.1. Effekt af ALA på biokemiske indekser hos diabetiske rotter.Glucose, triglycerider, urinstof og kreatinin blev bestemt i serum fra kontrol-, diabetiske og ALA-behandlede ikke-diabetiske og diabetiske rotter (figur 1). Den diabetiske tilstand blev fulgt 4 uger og 8 uger for at inkludere det tidsforløb, der var nødvendigt for, at skadelige processer kunne manifestere sig. Begge grupper af diabetiske rotter var karakteriseret ved hyperglykæmi, stigende tendenser for triglycerider og kreatininniveauer, men uden statistisk signifikans, og ved signifikant øgede niveauer af urinstof. Hos diabetiske rotter resulterede 4 ugers ALA-behandling i et fald i serumglukoseniveauet til kontrolværdien, mens glucoseniveauet efter 8 uger faldt, men stadig forblev signifikant forhøjet sammenlignet med kontroller. I begge diabetiske grupper behandlet med ALA var triglycerider og kreatinin ikke signifikant ændret. Behandling med ALA reducerede signifikant urinstofniveauet hos diabetiske rotter efter 4 uger, mens urinstofserumniveauet hos diabetiske rotter efter 8 uger faldt sammenlignet med diabetiske kontroller, men uden statistisk signifikans. Administration af ALA til kontrolrotter påvirkede ikke de undersøgte biokemiske parametre signifikant.

3.2.Morfologisk evaluering af nyrestruktur og CML-dannelse efter ALA-behandling.PAS-farvning fremhævede de karakteristiske nyrehistopatologiske træk forbundet med diabetes (figur 2(a)). Fortykkelse af den glomerulære basalmembran viste sig efter 4 ugers diabetesbegyndelse, mens mesangial matrixudvidelse og tubuli med udvidet lumen blev observeret efter 8 ugers diabetesbegyndelse. Histologisk analyse afslørede, at de tubulære lumen, glomerulære og mesangiale matrixområder steg signifikant i 8 ugers diabetiske rotter sammenlignet med kontrol- og ALA-behandlede kontrolrotter. Efter ALA-behandling faldt tubulær dilatation og mesangial matrix-ekspansion imidlertid signifikant, men forblev stadig over kontrolværdierne, mens det glomerulære område blev vendt fuldstændigt tilbage til kontrolniveauer. Hos kontrolrotter behandlet med ALA blev den mesangiale matrixfraktion fundet øget, hvilket tyder på, at langvarig brug af ALA kunne påvirke nogle af de strukturelle træk inyrer(Figur 2(a)).

AGE'er er patogene faktorer, der bidrager til nyreskade ved diabetes. For at undersøge om ALA påvirker akkumuleringen af ​​AGE-produkter inyreraf diabetiske rotter blev CML-nyreindholdet vurderet ved immunhistokemisk farvning i kontrol-, diabetiske rotter (4 og 8 uger) og ALA-behandlede kontrol- og diabetiske rotter (4 og 8 uger) (figur 2(b)). Farvning for CML var positiv i begge grupper af diabetiske rotter, hvilket afslørede, at CML hovedsageligt akkumuleres i tubulointerstitium og i mindre grad i glomeruli. Ifølge kvantificering af CML-indhold var disse ændringer statistisk signifikante sammenlignet med tilsvarende kontroller (figur 2(b)). Efter ALA-behandling af diabetiske rotter (4 og 8 uger) faldt både tubulointerstitiel og glomerulær CML-immunreaktivitet markant, mens CML-positiviteten i kontrolrotter behandlet med ALA forblev uopdagelig som i kontroller.

3.3. Effekten af ​​ALA på kollagenaflejring og Col4a1-genekspression.Masson-trikromfarvning afslørede kollagenaflejring i tubulointerstitielle områder og i glomeruli, især i basalmembraner i begge kompartmenter i diabetiske (4 og 8 uger) grupper af rotter (figur 3(a)). ALA-behandling (4 og 8 uger) af ikke-diabetiske rotter var også forbundet med øget kollagenaflejring karakteriseret ved glomerulære og tubulointerstitielle områder optaget af den kollagenfarvede matrix, men uden statistisk signifikans. Hos ALA-behandlede diabetiske rotter (4 og 8 uger) forblev kollagenaflejringen vedvarende, da der ikke blev påvist et signifikant fald sammenlignet med diabetiske rotter. For at verificere stigningen i kollagensyntese blev niveauet af Col4a1-genekspression vurderet ved RT-PCR (figur 3(b)). En signifikant stigning i Col4a1-genekspression i nyrerne hos diabetiske rotter på begge tidspunkter såvel som i nyrerne hos ALA-behandlede diabetiske og ikke-diabetiske rotter fra begge forsøgsgrupper (4 og 8 uger) blev påvist sammenlignet med respektive kontroller .

3.4.Profibrotiske ændringer forbundet med diabetes og ALA-behandling.Western blot-analyse afslørede, at TGF- 1-proteinniveauet ikke varierede signifikant efter 4 uger uanset behandling (figur 4(a)). Imidlertid blev statistisk signifikant induktion af TGF- 1-protein påvist efter 8 ugers diabetes, som blev lidt reduceret ved ALA-behandling, men forblev signifikant øget sammenlignet med kontrol. Desuden blev lignende induktion af TGF- 1 observeret i ikke-diabetiske dyr behandlet med ALA (figur 4(a)). For at undersøge, om TGF- 1-induktion var ledsaget af forekomsten af ​​fibrotiske markører, blev tilstedeværelsen af ​​SMA analyseret ved hjælp af Western blot (figur 4(b)). Diabetisk tilstand udløste SMA-ekspression, der blev påvist fra den fjerde uge efter diabetes debut og fremefter. ALA-behandling af diabetiske rotter reducerede SMA til kontrolniveauet efter 4 uger, men var ineffektivt efter 8 uger. ALA-behandling påvirkede ikke SMA i ikke-diabetiske rotter efter 4 uger, mens det efter 8 uger førte til øget SMA-ekspression i forhold til kontrol, men denne stigning var ikke statistisk signifikant (figur 4(b)).

Behandling af ikke-diabetiske rotter med ALA resulterede i lignende aftryk med hensyn til profibrotiske træk sammenlignet med diabetiske rotter, hvilket indikerer behovet for at afsløre de mekanismer, der ligger til grund for de observerede fibrotisk-lignende ændringer i nyrerne hos ikke-diabetiske rotter behandlet med ALA. For at undersøge muligheden for, at epigenetiske modifikationer repræsenterer yderligere mekanismer involveret i det observerede ALA-inducerede profibrotiske landskab hos ikke-diabetiske rotter, i en særlig stigning i Col4a1-ekspression, blev nyrer fra kontrol- og ALA-behandlede ikke-diabetiske rotter yderligere underkastet DNA-methyleringsstatusanalyse .

3.5. Indvirkningen af ​​ALA på DNA-methyleringsstatus.Det globale niveau af DNA-methylering og genekspression af de vigtigste aktører involveret i DNA-methylering (Dnmt1, Dnmt3a og Dnmt3b) og demethylering (Tet1) blev vurderet i nyrer af ikke-diabetisk kontrol og ALA-behandlede rotter i 4 og 8 uger (figur 5) ). Kun Tet1 mRNA-niveau udviste en statistisk signifikant stigning efter 8 ugers ALA-behandling, hvorimod ekspressionen af ​​Dnmts og globalt niveau af DNA-methylering ikke viste en signifikant forskel efter 4 eller 8 ugers ALA-behandling sammenlignet med kontroller.

Det næste eksperiment var rettet mod undersøgelse af det lokale niveau af DNA-methylering af Col4a1-genet. Hovedformen af ​​kollagen IV indeholder to 1(IV)-kæder og en 2(IV)-kæde, kodet af Col4a1- og Col4a2-gener, som er arrangeret i hoved-til-hoved-orientering, der danner en unik transskriptionel enhed og transskriberet i forskellige retninger fra den gensidige promotor [17]. Col4a1 transskriberes fra den 130 bp lange intergene region, der indeholder to Sp1-steder, CAAT- og CTC-bokse [17] (Figur 6(a)). DNA-methyleringsstatus for Col4a1/Col4a2-promotoren blev vurderet ved anvendelse af MSP-analyse, og primernes position er vist i figur 6(a). Begge primerpar, specifik for methyleret og umethyleret DNA, dækkede 2 CpG'er pr. primer. Resultater af MSP afslørede, at ALA ikke påvirkede methyleringsstatus for Col4a1/Col4a2-promotoren efter 4-ugelang behandling (figur 6(b)). Imidlertid blev et statistisk signifikant fald i DNA-methyleringsindekset observeret efter 8 ugers ALA-behandling (figur 6(b)), hvilket tyder på potentialet af ALA til at modulere Col4a1-ekspression gennem hele ændringen af ​​DNA-methyleringsmønsteret af dets promotor.

4. Diskussion

På grund af den epidemiske andel af diabetes bliver DKD den hyppigste årsag til nyresygdom i slutstadiet på verdensplan og den mest vejledende faktor for for tidlig dødelighed hos patienter med diabetes [28, 29]. Forekomsten af ​​DKD hos diabetespatienter er ikke blevet reduceret i de seneste årtier på trods af intens behandling rettet mod blodsukkerkontrol [28, 30]. Blandt potentielle behandlingsstrategier, der har vist fordele mod DKD, er målretning mod oxidativ stress, og i den term blev det fastslået, at ALA kan forbedre nyrefunktionen ved diabetes [29, 31, 32]. Resultaterne opnået i denne undersøgelse bekræftede hypoglykæmiske effekter af ALA, men indikerede ineffektivitet af ALA mod forstyrrede urinstofniveauer ved langvarig diabetes.

En stigning i glykæmi alene eller kombineret med oxidativt stress er en af ​​de mekanismer, der er involveret i dannelsen af ​​AGE'er, hvis akkumulering i glomerulære og tubulointerstitielle kompartmenter var korreleret med graden af ​​nyreskade i et eksperimentelt modelsystem for diabetisk nefropati [33, 34] . CML er en af ​​de vigtigste AGE'er in vivo [35], hvis niveau stiger i cirkulation og organer, herunder nyrer hos diabetiske patienter [36], og spiller en vigtig rolle i patogenesen af ​​diabetisk nefropati [37]. Vores resultater viste, at CML-aflejring hovedsageligt akkumuleres i tubulointerstitialet og i mindre grad i det glomerulære kompartment af diabetisk rottenyre, som faldt markant efter ALA-behandling. Ifølge offentliggjorte data kan tubuli beriget med CML være det mest alvorligt skadede nyrekammer [38-40]. I modstrid med vores resultat er begrænsede effekter af ALA på CML-indholdet i diabetiske rotter, påvist både ved immunfarvning og kemisk analyse, blevet beskrevet [40], og denne inkonsistens kan opstå fra det eksperimentelle design af undersøgelsen.

Histologisk analyse af en nyrestruktur ved PAS-farvning bekræftede beskyttende effekter af ALA ved diabetes. De gavnlige antioxidanteffekter af ALA mod diabetes-induceret oxidativ skade i nyrerne var veletablerede [22, 31, 32]. Behandling med ALA viste sig at forhindre nyreinsufficiens og lindre nyrestrukturelle patologiske ændringer, herunder glomerulær mesangial matrixudvidelse og glomerulosklerose på grund af dets kombinerede antioxidant- og hypoglykæmiske potentiale [21, 22]. I betragtning af, at høj glukose, oxidativt stress og dannelse af AGE'er er anerkendt som vigtige faktorer for induktion af profibrotiske ændringer i nyren [41], taler veletablerede antioxidant- og hypoglykæmiske effekter og ALAs evne til at reducere CML-indhold kraftigt for potentiale af ALA til at lindre fibrotisk proces i diabetiske nyrer. Vores resultater afslørede imidlertid, at graden af ​​kollagenfiberaflejring i Massons-farvede sektioner af nyrevæv ikke ændrede sig signifikant efter ALA-behandling af diabetiske rotter. Desuden viste ALA-behandling en tendens til at øge kollagensyntesen/-indholdet hos ikke-diabetiske rotter. I overensstemmelse med vores fund er de skadelige virkninger af ALA på kontrol/sunde nyrer blevet rapporteret [42]. Ved at studere de renobeskyttende mekanismer af ALA i diabetisk nefropati, opdagede forfatterne uventet, at behandling med ALA var forbundet med udviklingen af ​​glomerulosklerose, tubulointerstitiel fibrose og fald i nyrefunktionen i de ikke-diabetiske nyrer. Uafhængige undersøgelser afslørede, at højere doser af ALA fremkalder oxidativ proteinskade hos ældre rotter [43] og endda nedsat nyrefunktion ved diabetes [40]. I overensstemmelse med dette blev den prooxidante virkning af ALA påvist ikke kun i dyreforsøg, men også hos patienter, der lider af nyresygdomme i slutstadiet, som fik intravenøst ​​jern [44].

I sammenhæng med de observerede effekter af ALA på kollagenaflejring viste vores resultater desuden, at ALA ikke reducerede niveauet af to fibrotiske markører, TGF- 1 og -SMA, hos diabetiske rotter efter 8 uger og endda inducerede TGF. - 1-ekspression i ikke-diabetiske rotter efter 8 ugers behandling. I overensstemmelse hermed var genekspressionen af ​​kollagen type IV signifikant højere hos diabetikere såvel som hos de ALA-behandlede diabetiske og ikke-diabetiske rotter sammenlignet med kontroller. Tidligere er det blevet vist, at oxidativ stress inducerer TGF- 1 og dets nedstrøms målgener såsom kollagen type I, III og IV, samt fibronectin [9, 45], og at antioxidanter undertrykker TGF{{ 10}} udtryk [46]. I modsætning til den generelle idé om antioxidanters beskyttende og antifibrotiske rolle tyder vores resultater på, at ALA kan have flere effekter på faktorer involveret i den fibrotiske proces i diabetiske nyrer. Det ser ud til, at ALA specifikt inducerer ekspression af nogle fibrose-relaterede gener såsom TGFB1 og især Col4a1, hvis øgede ekspression blev påvist allerede efter 4 ugers ALA-behandling i diabetiske og ikke-diabetiske nyrer. Forbedret ekspression og aflejring af kollagen type I er blevet observeret efter ALA-behandling i humane dermale fibroblaster [24]. Undersøgelsen afslørede, at opregulering af kollagen type I skyldes TGF-receptor I nedstrøms signalering, hvilket tyder på en ny farmakologisk effekt af ALA involveret i hudens aldring. I betragtning af resultaterne præsenteret heri kan opregulering af kollagener være en almindelig cellerespons på ALA snarere end en specifik mekanisme, der er karakteristisk for dermale fibroblaster.

Kollagen type IV-syntese er reguleret på veletablerede transkriptionelle, posttranskriptionelle og posttranslationelle niveauer, men flere data vedrørende rollen af ​​DNA-methylering i Col4a1-ekspression dukker op. En undersøgelse udført for 40 år siden afslørede, at behandling af F9-teratocarcinomceller med DNA-demethyleringsmiddel 5-Azacytidin resulterer i øget Col4a1-ekspression, hvilket for første gang tyder på, at DNA-methylering kan spille en vigtig rolle i dets ekspression [47]. Humane methylom- og transkriptomundersøgelser afslørede en korrelation af Col4a1-promotormethylering med dets ekspression i raske og leverceller aktiveret til at producere ECM-proteiner [20, 48]. Det samme blev fundet i mesangiale celler, hvor efter 5-Azacytidin-behandling steg Col4a1-mRNA-niveauer signifikant [49]. Hos patienter med kronisk nyresygdom blev DNA-methyleringsniveauet af Col4a1- og Col4a2-gener desuden fundet at være signifikant lavere sammenlignet med raske forsøgspersoner og i korrelation med øget mRNA- og proteinekspression [50]. Vores resultater bekræftede stærke beviser for regulering af Col4a1-ekspression gennem DNA-methylering, da vi fandt, at Col4a1-ekspression korrelerer med methyleringsstatus for dens promotor i nyren. Det skal bemærkes, at de observerede ændringer i methyleringsstatus for Col4a1-promotoren højst sandsynligt også påvirker ekspressionen af ​​Col4a2, da to gener reguleres via gensidig tovejs-promotorregion. MSP-primere brugt i vores eksperimenter blev designet til at overlappe delvist med to Sp1-bindingssteder, og et fald i DNA-methylering, som vi observerede efter ALA-behandling, kunne afspejle den forbedrede binding af Sp1 og opregulering af Col4a1-ekspression.

Vores resultater af, at Col4a1-ekspression og dets methyleringsstatus er tilbøjelige til ALA-virkning i ikke-diabetiske dyr efter 8 ugers ALA-behandling, tyder desuden på potentialet for ALA til også at fungere som en epigenetisk regulator. Ifølge vores resultater påvirkede ALA Tet1-enzymet efter 8 ugers behandling mod dets øgede ekspression, hvilket indikerer muligheden for, at genspecifik demethylering kunne forekomme uden påviselig nettoeffekt på genom-dækkende DNA-methylering. Selvom der er en sammenhæng mellem øget ekspression af Col4a1 og nedsat methylering af dets promotor efter 8 ugers ALA-behandling, er det stadig vanskeligt at overveje utvetydigt, at DNA-demethylering er den eneste årsagssammenhæng mellem ALA-behandling og øget kollagen-genekspression. efter 4 uger var øget ekspression af Col4a1 ikke forbundet med ændring i dets methyleringsstatus. ALAs evne til at regulere visse gener epigenetisk er blevet foreslået for IL-1- og IL-6-gener, hvis nedregulerede mRNA- og proteinniveauer var forbundet med hypermethylering af deres promotorregioner [51, 52]. Selvom hypermethylering blev foreslået som en af ​​mekanismerne for ALA-virkning, er detaljerede veje for epigenetisk regulering drevet af ALA ikke blevet belyst endnu og venter også på at blive bekræftet for de andre gener. Derfor kræver forbindelsen mellem øget kollagensyntese/aflejring, der kan resultere i patologisk fænotype og Tet-medieret DNA-demethylering af Col4a1-promotor fremkaldt af ALA-behandlingen, yderligere bevis og bør udgøre platformen for fremtidige undersøgelser.

5. Konklusioner

ALA's beskyttende rolle mod diabetesrelateret funktionsfejl i forskellige organer, inklusive nyrerne, er for det meste blevet tilskrevet dets antioxidant- og hypoglykæmiske effekter. Resultaterne i denne undersøgelse tyder imidlertid på, at nyrebeskyttelse ved diabetes af ALA kan begrænses på grund af stigningen i kollagensyntese/aflejring i nyrerne. Ved at analysere virkningerne af ALA på profibrotiske processer i diabetiske rottenyrer fandt vi, at ALA ikke reducerede hverken kollagensyntese eller profibrotiske markører. Desuden bidrog behandling med ALA til profibrotiske hændelser og kollagensyntese selv i ikke-diabetiske rottenyrer, der delvist er relateret til ændringer i DNA-methyleringsstatus af Col4a1-genet. Hos patienter med nyrefibrose er der derfor behov for forsigtighed med hensyn til brugen af ​​ALA for at undgå forværring af den eksisterende nyrekomplikation. Desuden er forsigtighed nødvendig, når ALA skal bruges til at booste antioxidantpotentialet hos en rask person eller til håndtering af andre diabetiske komplikationer, da gavnlige effekter for en komplikation kan være skadelige for den anden.

1 Institut for Molekylær Biologi, Institut for Biologisk Forskning "Siniša Stanković, " National Institute of Republic of Serbia, University of Beograd, Bulevar Despota Stefana 142, 11060 Beograd, Serbien

2 Institut for Cytologi, Institut for Biologisk Forskning "Siniša Stanković," National Institute of Republic of Serbia,

Universitetet i Beograd, Bulevar Despota Stefana 142, 11060 Beograd, Serbien

Korrespondance skal rettes til Aleksandra Uskoković; auskokovic@ibiss.bg.ac.rs

Modtaget 4. november 2020; Revideret 19. februar 2021; Godkendt 27. februar 2021; Udgivet 12. marts 2021

Akademisk redaktør: Alin Ciobica

Copyright © 2021 Nevena Grdović et al. Dette er en artikel med åben adgang distribueret under Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat at det originale værk er korrekt citeret.

Datatilgængelighed

Alle relevante data, der bruges til at understøtte resultaterne af denne undersøgelse, er inkluderet i artiklen.

Interessekonflikt

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt med hensyn til udgivelsen af ​​dette papir.

Forfatteres bidrag

Koncept og design af eksperimenterne: MM, NG, AU; Håndtering og behandling af dyr: MĐ, JAJ, AU, SD; Udført histologisk analyse, immunfarvning og kvantificering af resultater: JAJ, MĐ, ST. Udført Western blot-analyse: AU, SD, NG; Udførte RTqPCR eksperimenterne: JR, MĐ; Udførte DNA-methyleringseksperimenterne: JR, AT, MV; Statistisk analyse: NG; Fortolkning af data og udarbejdelse af figurer: NG, MM; Skrev papiret: NG, AU; Kritisk revision af manuskriptet: MV, SD. Alle forfattere godkendte den endelige version til offentliggørelse.

Anerkendelser

Dette arbejde blev støttet af ministeriet for uddannelse, videnskab og teknologisk udvikling i Republikken Serbien (tilskud nr. 451-03-9/2021-14/200007).

Supplerende materialer

Supplerende tabel S1: Sekvenser af primere brugt til kvantitativ PCR-analyse i realtid af Col4a1 (Collagen type IV alfa 1 kæde), Dnmt1 (DNA methyltransferase 1), Dnmt3a (DNA methyltransferase 3 alpha), Dnmt3b (DNA methyltransferase 1 beta), T (Tet methylcytosin dioxygenase 1) og Actb (Actin, beta) genekspression. Supplerende tabel S2: Sekvenser af primere til MSP-analyse af DNA-methylering af promotorregionen af ​​Col4a1-genet. Supplerende figur S1: Repræsentative billeder af immunblotting. Proteinniveauer af TGF- 1 (A) og SMA (B), to fibrose-relaterede proteiner, i nyrer af ALA-behandlede eller ikke-behandlede, kontrol- og diabetiske rotter, 4 og 8 uger efter diabetesinduktion, bestemt af Western blot analyse. (Supplerende materialer)

Referencer

[1]RC Atkins, "The epidemiology of chronic kidney disease," Kidney International. Tillæg, bd. 67, s. S14–S18, 2005.

[2]AB Oyenihi, AO Ayeleso, E. Mukwevho og B. Masala, "Antioxidantstrategier i håndteringen af ​​diabetisk neuropati," BioMed Research International, vol. 2015, artikel-id 515042, 15 sider, 2015.

[3]M. Lv, Z. Chen, GY Hu og QB Li, "Terapeutiske strategier for diabetisk nefropati: nylige fremskridt og fremtidsperspektiver," Drug Discovery Today, vol. 20, nr. 3, s. 332-346, 2015.

[4]A. Karihaloo, "Anti-fibrose terapi og diabetisk nefropati," Current Diabetes Reports, vol. 12, nr. 4, s. 414-422, 2012.

[5]S. Yamagishi og T. Matsui, "Advanced glycation end products, oxidative stress, and diabetic nephropathy," Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol. 3, nr. 2, s. 414-108, 2010.

[6]F. Genovese, AA Manresa, DJ Leeming, MA Karsdal og P. Boor, "Den ekstracellulære matrix i nyren: en kilde til nye ikke-invasive biomarkører for nyrefibrose?" Fibrogenesis & Tissue Repair, vol. 7, nr. 1, s. 4, 2014.

[7]S. Chen, SW Hong, MC Iglesias-dela Cruz, M. Isono,A. Casaretto og FN Ziyadeh, "Nøglerollen for det transformerende vækstfaktor-beta-system i patogenesen af ​​diabetisk nefropati," Renal Failure, vol. 23, s. 471-481, 2001.

[8]BB Hofman, K. Sharma, Y. Zhu og FN Ziyadeh, "Transskriptionel aktivering af transformerende vækstfaktor- 1 i mesangial cellekultur ved høj glucosekoncentration," Kidney International, vol. 54, nr. 4, s. 1107-1116, 1998.

[9]M. Gonzalez-Ramos, S. de Frutos, M. Griera, et al., "Integrin-linked kinase medierer den hydrogenperoxidafhængige transformerende vækstfaktor- 1 opregulering," Free Radical Biology & Medicine, vol. 61, s. 416-427, 2013.

[10]K. Sharma og TA McGowan, "TGF- i diabetisk nyresygdom: rolle af nye signalveje," Cytokine & Growth Factor Reviews, vol. 11, nr. 1-2, s. 115-123, 2000.

[11] FJ Lopez-Hernandez og JM Lopez-Novoa, "Role of TGF- in kronisk nyresygdom: en integration af tubulære, glomerulære og vaskulære effekter," Cell and Tissue Research, vol. 347, nr. 1, s. 141-154, 2012.

[12] PD Yurchenco og JJ O'Rear, "Basal lamina assembly," Current Opinion in Cell Biology, vol. 6, nr. 5, s. 674-681, 1994.

[13]A. Nerlich og E. Schleicher, "Immunohistokemisk lokalisering af ekstracellulære matrixkomponenter i humane diabetiske glomerulære læsioner," The American Journal of Pathology, vol. 139, nr. 4, s. 889-899, 1991.

[14] RM Mason og NA Wahab, "Extracellular matrix metabolism in diabetic nephropathy," Journal of the American Society of Nephrology, vol. 14, nr. 5, s. 1358-1373, 2003.

[15] RE Gilbert, A. Cox, LL Wu et al., "Ekspression af transformerende vækstfaktor-beta 1 og type IV kollagen i renal tubulointerstitium i eksperimentel diabetes - effekter af ACE-hæmning," Diabetes, vol. 47, nr. 3, s. 414-422, 1998.

[16] MS Razzaque, T. Koji, Y. Horita, et al., "Syntese af type III kollagen og type IV kollagen af ​​tubulære epitelceller i diabetisk nefropati," Pathology, Research and Practice, vol. 191, nr. 11, s. 1099-1104, 1995.

[17] JP Grande, DC Melder, DL Kluge og ED Wieben, "Structure of the rat collagen IV promoter," Biochimica et Bio-Physica Acta, vol. 1309, nr. 1-2, s. 85-88, 1996.

[18]E. Verdura, D. Hervé, F. Bergametti, et al., "Afbrydelse af et miR-29-bindingssted, der fører til COL4A1-opregulering forårsager pontin autosomal dominant mikroangiopati med leukoencefalopati," Annals of Neurology, vol. 80, nej. 5, s. 741-753, 2016.

[19]M. Griffiths, M. Van Sinderen, K. Rainczuk og E. Dimitriadis, "miR-29c overekspression og COL4A1-nedregulering i infertilt humant endometrium reducerer endometrieepitelcellernes adhæsive kapacitet _in vitro_ antyder roller i modtagelighed," Scientific Reports, vol. 9, nr. 1, s. 8644, 2019.

[20]A. El Taghdouini, AL Sørensen, AH Reiner, et al., "Genomdækkende analyse af DNA-methylering og genekspressionsmønstre i oprensede, udyrkede humane leverceller og aktiverede hepatiske stellatceller," Oncotarget, vol. 6, nr. 29, s. 26729-26745, 2015.