TLR9-aktivering inducerer afvigende IgA-glykosylering via APRIL- og IL-6-medierede veje i IgA-nefropati
Mar 11, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Yuko Makita1, Hitoshi Suzuki1, Toshiki Kano1, Akiko Takahata1, Bruce A. Julian2,3, Jan Novak3 og Yusuke Suzuki1
SØGEORD: APRIL; galactose-deficient IgA1; IgA nefropati; IL-6; immunkompleks
Galactose-deficient IgA1 (Gd-IgA1) spiller en afgørende rolle i udviklingen afIgA nefropati(IgAN). Imidlertid er de patogene mekanismer, der driver Gd-IgA1-produktion, ikke blevet fuldstændig belyst. Medfødt immunaktivering via Toll-like receptor 9 (TLR9) er kendt for at være involveret i Gd-IgA1-produktion. En proliferationsinducerende ligand (APRIL) og IL-6 er også kendt for at forbedre Gd-IgA1-syntese i IgAN. Med dette som baggrund undersøgte vi, hvordan TLR9-aktivering i IgA-udskillende celler resulterer i overproduktion af nefritogent IgA i den IgAN-tilbøjelige ddY-mus og i humane IgA-1-udskillende celler. Injektion af TLR9-liganden CpG-oligonukleotider øgede produktionen af afvigende glykosylerede IgA- og IgG-IgA-immunkomplekser i ddY-mus, hvilket igen forværredenyreskade. CpG-oligonukleotid-stimulerede mus havde forhøjede serumniveauer af APRIL, som korrelerede med dem af afvigende glycosylerede IgA- og IgG-IgA-immunkomplekser. In vitro,TLR9 aktiveringøget produktionen af det nefritogene IgA samt APRIL og IL-6 i splenocytter fra ddY-mus og i humane IgA1-udskillende celler. Imidlertid undertrykte siRNA-nedbrydningen af APRIL fuldstændig overproduktionen af Gd-IgA1 induceret af IL-6. Neutralisering af IL-6 reducerede CpG-oligonukleotid-induceret overproduktion af Gd-IgA1. Ydermere inducerede APRIL- og IL--6-veje hver uafhængigt medieret TLR9- overproduktion af Gd-IgA1. Således forbedrede TLR9-aktivering syntesen af afvigende glycosyleret IgA, der i en musemodel af IgAN yderligere forbedrede nyreskade. Derfor forbedrer APRIL og IL-6 synergistisk såvel som uafhængigt syntesen af Gd-IgA1.
Oversættelseserklæring
Sygdomsspecifik behandling rettet mod galactose-deficient IgA1 kan udgøre en fremtidig behandling afIgA nefropati. Resultater fra denne undersøgelse, som viste involveringen af en proliferation-inducerende ligand (APRIL) og interleukin-6 (IL-6) i overproduktionen af afvigende glycosyleret IgA, understøtter begrundelsen for at målrette APRIL og IL{ {3}} i IgA nefropati (IgAN). Faktisk påviste et nyligt studie positive effekter af det monoklonale anti-APRIL-antistof i murint IgAN,1, og et klinisk studie med neutraliserende APRIL-antistof er i øjeblikket i gang hos patienter med IgAN.
IgA nefropati (IgAN), den mest almindelige primære glomerulonefritis,2 forårsager nyresygdom i slutstadiet hos 20 procent til 40 procent af patienterne inden for 20 år efter opståen af denne sygdom.3 Selvom patogenesen af IgAN stadig mangler at blive fuldt belyst, er episodisk makroskopisk hæmaturi samtidig med en infektion i de øvre luftveje tyder på, at slimhindeimmunsystemet spiller en vigtig rolle i de kliniske manifestationer af IgAN.4
Cistanchetubulosaforhindrernyresygdom, klik her for at få prøven
Afvigende glykosylering af IgAer central i patogenesen af IgAN. Glomerulært IgA hos patienter med IgAN er begrænset til IgA1-underklassen og er beriget for molekyler, der har nogle O-glycaner i hængselregionen, der mangler galactose (galactose-deficient IgA1 [Gd-IgA1]).5,6 Desuden serumniveauer af Gd -IgA1 og IgA1-indeholdendeimmunkomplekser(IC'er) med Gd-IgA1-specifikke autoantistoffer er forhøjet hos patienter med IgAN.7-9. Mekanismerne for produktionen af Gd-IgA1 er dog stadig ikke fuldt ud forstået.
Vi brugte den IgAN-tilbøjelige ddY-musemodel i denne undersøgelse. ddY-mus udvikler glomerulære skader, der efterligner dem hos mennesker med IgAN.10 Selvom mus ikke har IgA-molekyler med O-glycaner, der er typiske for humant IgA1, deler humant IgAN og denne IgAN-tilbøjelige ddY-musemodel nogle sygdomsspecifikke træk, såsom serumforhøjelse af afvigende glykosyleret IgA og IgG-IgA IC.6,11 Faktisk inducerer afvigende IgA-glykosylering på grund af mangel på b1,4-galactosylering af N-glycaner murint IgAN på grund af forhøjede serumniveauer af højmolekylær vægt IgA- og IgA-holdig IC med deres efterfølgende nyreaflejring og glomerulære skade.12 ddY-mus viser proteinuri og mesangial proliferativ glomerulonefritis med samtidig aflejring af IgA og C3 i glomeruli. En genomomfattende associationsundersøgelse identificerede kandidat-loci forbundet med progressionen af IgAN i ddY-mus.13 Locierne inkluderer gener, der funktionelt ligner dem, der er forbundet med humant IgAN.14,15 Disse fund tyder på, at IgAN i ddY-mus og hos mennesker kan blive påvirket i det mindste delvist af de samme modtagelighedsgener. Selvom de molekylære egenskaber af murint IgA og humant IgA1 er forskellige, har afvigende glycosyleret IgA tendens til at danne polymere IgA og IgG-IgA IC'er, der efterfølgende driver udviklingen af nyreskade i den ddY murine model af IgAN såvel som i human IgAN. Således har ddY musemodellen nogle fælles træk med humant IgAN og kan være et nyttigt værktøj til analyse af forskellige patogenetiske træk ved IgAN.
Toll-lignende receptorer (TLR'er) er nøglemolekyler i det medfødte immunsystem og er blevet impliceret i patogenesen af IgAN.16-20 Eksogene antigener afledt af patogener aktiverer TLR9-MyD88-signalvejen.21 Denne proces fører til signifikant øget syntese af inflammatoriske cytokiner, såsom type 1-interferon og interleukin-6 (IL-6).22 For nylig påviste vi, at TLR9-aktivering forværredesnyreskadei IgAN-tilbøjelige ddY-mus, med en stigning i serumniveauer af IgA og IgG-IgA ICs.16 Desuden er specifikke TLR9-polymorfier forbundet med sygdomsprogression hos patienter med IgAN.16 Serumniveauer af tumornekrosefaktor-a og IL{{ 6}} er forhøjet hos patienter med IgAN.23 Desuden øger IL-6 og IL-4 produktionen af IgA1 og accentuerer graden af galactosemangel, hvilket øger Gd-IgA1-syntesen af IgA{{13} }udskillelse af cellelinjer fra patienter med IgAN.24 Disse resultater tyder på, at IL-6 kan være en nøglemediator for denne proces.24,25.
Genet af tumor necrosis factor ligand superfamiliemedlem 13 (TNFSF13) koder for en proliferation-inducerende ligand (APRIL), der er et centralt cytokin for modning og overlevelse af B-celler.26 APRIL deler nogle signalreceptorer, der er vigtige for B-celleudvikling, med en anden TNF-superfamilieligand, B-celleaktiverende faktor (BAFF). BAFF er også involveret i affinitetsmodningen af B-celler. En genomomfattende associationsundersøgelse identificerede TNFSF13 som et af kandidatgener forbundet med IgAN.27 Faktisk er serumniveauer af APRIL hos patienter med IgAN forhøjede28, og niveauerne er forbundet med nyreprognose.28
For at få en bedre forståelse af de underliggende mekanismer involveret i overproduktionen af afvigende glycosyleret IgA via TLR9-aktivering af liganden CpG oligodeoxynucleotider (ODN'er), brugte vi IgAN-tilbøjelige ddY-mus og humane IgA1--udskillende celler.
RESULTATER
Aktivering af TLR9 forværrede nyreskaden hos ddY-mus via øget produktion af nefritogent IgA
TLR9 kan aktiveres af de tilsvarende ligander, såsom CpG-ODN. For at teste effekten af TLR9-aktivering i en murin model af IgAN brugte vi en injektion af liganden i IgAN-tilbøjelige ddY-mus. Mus injiceret med CpG-ODN udviklede mesangial proliferation og ekstracellulær matrixudvidelse (figur 1a). Renale histologiske score baseret på mesangial proliferation og mesangial matrixudvidelse i mus injiceret med CpG-ODN var signifikant højere end i kontrolmus (P < 0.01;="" figur="" 1a).="" albuminniveauer="" i="" urinen="" i="" musene="" injiceret="" med="" cpg-odn="" var="" signifikant="" forhøjede="" sammenlignet="" med="" kontrolmusene="" (p="">< 0.{{20}}1;="" figur="" 1a).="" kun="" musene="" injiceret="" med="" cpg-odn="" udviklede="" mesangiale="" aflejringer="" af="" iga,="" igg="" og="" komplement="" c3="" (figur="" 1b).="" mus="" injiceret="" med="" cpg-odn="" viste="" signifikant="" højere="" serumniveauer="" af="" iga="" (p="">< 0,01)="" og="" igg="" (p="">< 0,01)="" end="" kontrolmus="" (figur="" 1c).="" serum="" iga="" fra="" mus="" injiceret="" med="" cpg-odn="" mus="" havde="" lavere="" reaktivitet="" med="" ricinus="" communis="" agglutinin-i="" (rca-i)="" og="" sambucus="" nigra="" agglutinin="" lectiner="" end="" fra="" kontrolmus="" (figur="" 1c),="" hvilket="" indikerer="" et="" lavere="" indhold="" af="" galactose="" og="" sialinsyre="" på="" n="" -glycaner="" af="" murint="" iga.="" endvidere="" var="" serumniveauet="" af="" igg-iga="" ic="" i="" mus="" injiceret="" med="" cpg-odn="" signifikant="" højere="" end="" i="" kontrolmus="" (p="">< 0,05;="" figur="" 1c).="" disse="" resultater="" tydede="" på="">TLR9 aktiveringaf CpG-ODN resulterede i overproduktion af afvigende glycosyleret IgA og IgG-IgA IC, hvilket førte tilimmunkompleksaflejring og nyreskade.
B-celler og dendritiske celler var involveret i CpG-ODN-responserne
Vi undersøgte, hvilke celletyper der er involveret i induktionen af overproduktion af afvigende glycosyleret IgA som respons på CpG-ODN. B-celler og dendritiske celler (DC'er) blev isoleret fra miltene fra ddY-mus under anvendelse af anti-muse CD19- og CD11c-antistoffer ved henholdsvis FL-fluorescensaktiveret cellesortering. CpG-ODN-stimulering af isolerede B-celler inducerede overproduktion af IgA. Derudover øgede CpG-ODN signifikant IgA-produktion, når B-celler blev dyrket sammen med DC'er (Supplerende figur S1). Disse resultater antydede, at CpG-ODN direkte aktiverede B-celler, og at DCS yderligere forbedrede IgA-produktion ved TLR9-aktivering.
Overproduktion af APRIL forbedret syntese af afvigende glykosylerede IgA- og IgG-IgA-IC'er
Vi vurderede, om APRIL og/eller BAFF var involveret i syntesen af nefritogent IgA induceret af TLR9-aktivering. Injektion af CpG-ODN i ddY-mus forhøjede signifikant serumniveauer af APRIL og BAFF (figur 2a). Ekspressionsniveauer af APRIL i splenocytter korrelerede med produktion af afvigende glykosyleret IgA og dannelse af IgG-IgA IC (figur 2b). Ekspressionsniveauer af BAFF i splenocytter korrelerede med produktionen af afvigende glycosyleret IgA, men ikke med dannelsen af IgG-IgA IC (figur 2b). Desuden korrelerede serumniveauer af APRIL, men ikke BAFF signifikant med forhøjede serumniveauer af afvigende glykosyleret IgA og IgG-IgA IC i de CpG-ODN-injicerede mus (figur 2c). Disse resultater tyder på, at både APRIL og BAFF kan være involveret i produktionen af afvigende glycosyleret IgA, selvom APRIL kan være mere involveret i produktionen af IgG-IgA IC.
Figur 1|CpG-oligodeoxynukleotid (ODN) stimuleringsinduceret produktion af nefritogent IgA. Injektion med CpG-ODN øgede blodniveauer af afvigende glykosyleret IgA og IgG-IgA immunkompleks (IC) og forværrede nyreskade hos ddY mus. (a) ddY mus før udviklingen afIgA nefropati(IgAN) blev ip injiceret med CpG-ODN tre gange ugentligt i 12 uger. I en histologisk analyse af glomerulære læsioner viste mus injiceret med CpG-ODN mesangial celleproliferation og ekstracellulær matrixudvidelse. Det højre panel viser evalueringen af nyreskader ved semikvantitativ scoring. Renale histologiske scores, evalueret ved procenter af glomeruli med de førnævnte læsioner, viste, at nyreskade hos mus injiceret med CpG-ODN blev forværret. Urinalbuminniveauer i mus injiceret med CpG-ODN var signifikant forhøjede sammenlignet med kontrolmus. Søjler i bundpanelerne ¼ betyder ± SEM. (b) Immunhistokemisk analyse af glomerulær IgA, IgG og C3 aflejringer. Kun mus injiceret med CpG-ODN udviklede mesangiale aflejringer af IgA, IgG og C3. (c) Serumniveauer af IgA, IgG og IgG-IgA IC'er var signifikant øget efter CpG-ODN-behandling i 12 uger. Serum IgA i mus injiceret med CpG-ODN viste signifikant lavere reaktivitet med Ricinus communis agglutinin-I (RCA-I) og Sambucus nigra agglutinin (SNA) lectiner end IgA i kontrolmus. Disse resultater indikerer, at injektionen af CpG-ODN øgede serumniveauer af afvigende glycosyleret IgA. Individuelle point vises. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01.="" od,="" optisk="" tæthed.="" for="" at="" optimere="" visningen="" af="" dette="" billede,="" se="" venligst="" onlineversionen="" af="" denne="" artikel="" på="">
Figur 2|Korrelationen mellem overproduktionen af en proliferationsinducerende ligand (APRIL) og afvigende glykosyleret IgA i mus injiceret med CpG-oligodeoxynukleotid (ODN). (a) Injektion af ddY-mus med CpG-ODN øgede serumniveauer af B-celleaktiverende faktor (BAFF) og APRIL. (b) Ekspressionsniveauerne af BAFF i hele splenocytter korrelerede med reduceret reaktivitet med Ricinus communis agglutinin-I (RCA-I) lectin, men korrelerede ikke med dannelsen af IgG-IgA immunkomplekset (IC). I mellemtiden var ekspressionsniveauer af APRIL forbundet med produktionen af afvigende glycosyleret IgA og dannelsen af IgG-IgA IC. (c) Hos mus injiceret med CpG-ODN var serumniveauer af APRIL forbundet med reduceret reaktivitet af IgA med RCA-I lectin og forhøjede niveauer af IgG-IgA IC. Serumniveauer af BAFF korrelerede ikke med produktionen af glycosyleret IgA og dannelsen af IgG-IgA IC. Søjler ¼ gennemsnit - SEM. *P < 0.05.="" od,="" optisk="">
IL-6 inducerede produktion af afvigende glycosyleret IgA
Serumniveauer af IL {{0}} i mus injiceret med CpG-ODN var signifikant højere sammenlignet med kontrolmus (P < 0,05;="" figur="" 3a).="" ved="" hjælp="" af="" splenocytter="" af="" igan-tilbøjelige="" ddy-mus="" undersøgte="" vi,="" om="" tlr9-inducerede="" cellulær="" aktivering="" og="" overproduktion="" af="" afvigende="" glykosyleret="" iga="" blev="" medieret="" af="" il-6.="" cpg-odn-stimulering="" øgede="" produktionen="" af="" il-6="" af="" splenocytter="" in="" vitro.="" tilsætningen="" af="" il-6="" til="" kulturmediet="" af="" splenocytter="" øgede="" iga-produktionen.="" desuden="" forbedrede="" il-6="" syntesen="" af="" afvigende="" glycosyleret="" iga="" og="" dannelsen="" af="" igg-iga="" ic="" og="" øgede="" april-produktionen="" (figur="" 3a).="" il-6-neutraliserende="" antistof="" reduceret="" cpg-odn-induceret="" total="" iga,="" afvigende="" glycosyleret="" iga-produktion="" og="" igg-iga="" ic-dannelse="" (figur="" 3b).="" disse="" resultater="" indikerer,="" at="" tlr9-aktivering="" blev="" medieret,="" i="" det="" mindste="" delvist,="" af="" il-="" 6.="" ydermere="" kan="" en="" anden="" tlr9-medieret="" vej(e)="" være="" involveret="" i="" produktionen="" af="" afvigende="" glycosyleret="">
cistanchekan forbedrenyrefungere
APRIL og IL-6 forbedrede syntese af Gd-IgA1 i humane IgA1--udskillende celler
Vi testede yderligere, om APRIL og IL-6 er fælles for store mediatorer, der øger produktionen af nefritogent IgA i humane IgA1-udskillende celler. CpG-ODN-tilskud øgede stigningen af IL-6, ekspression af APRIL, produktion af APRIL-protein og produktion af IgA og Gd-IgA1 (figur 4a). Stimulering med IL-6 og med APRIL øgede produktionen af IgA og Gd-IgA1 (figur 4b, c). Virkningerne af CpG-ODN-stimulering på produktionen af IgA og Gd-IgA1 blev delvist reduceret af IL-6-neutraliserende antistoffer (figur 4d). Desuden reducerede lille interfererende (si)RNA-knockdown i APRIL også produktionen af IgA og Gd-IgA1 induceret af IL-6-stimulering (figur 4b), hvilket indikerer, at APRIL og IL-6 synergistisk fremmer dannelsen af Gd -IgA1.
DISKUSSION
Mesangialt IgA i humant IgAN er eksklusivt IgA1-underklassen, der viser unormal O-glykosylering. 29,30 Human IgA1 har en hængselregion med O-glycaner, der er fraværende fra murine IgA.6,31,32 Afvigende glykosylering af N-glycaner er imidlertid involveret i patogenesen af en murin model af IgAN i ddY-mus, med en forhøjelse af afvigende glycosyleret IgA og IgA-holdig IC.11,12 Afvigende modifikationer af IgA-kulhydrater i enten O- eller N-glycaner er karakteristiske egenskaber ved nefritogen IgA-holdig IC.
Adskillige undersøgelser har vist TLR9-aktivering i progressionen af IgAN.17-19. I denne undersøgelse har vi vist, at aktivering af TLR9 ved ip-injektion af CpG-ODN i ddY-mus forværrede nyreskader ledsaget af glomerulære IgA- og IgG-aflejringer, sandsynligvis pga. af øgede serumniveauer af afvigende glykosyleret IgA og IgG-IgA IC. Desuden viste vi, at TLR9-aktivering var involveret i syntesen af Gd-IgA1 i humane IgA1--udskillende cellelinjer.
Figur 3|Virkningen af CpG-oligodeoxynukleotid (ODN) og interleukin (IL)-6 på dyrkede splenocytter fra ddY-mus. (a) Serumniveauer af IL-6 i mus injiceret med CpG-ODN var signifikant højere sammenlignet med kontrolmus. CpG-ODN-stimulering øgede produktionen af IL-6 af splenocytter fra ddY-mus i kultur. Inkubationen af splenocytter fra ddY-mus med rekombinant IL-6 øgede produktionen af totalt IgA og afvigende glykosyleret IgA, hvilket resulterede i dannelsen af IgG-IgA-immunkomplekset (IC). Rekombinant IL-6 øgede overproduktionen af en proliferation-inducerende ligand (APRIL). (b) Splenocytter i kultur blev stimuleret med CpG-ODN i nærvær eller fravær af IL-6-neutraliserende antistof. Anti-IL-6 antistof reducerede produktionen af totalt IgA og afvigende glycosyleret IgA og reducerede følgelig dannelsen af IgG-IgA IC induceret af CpG-ODN. Søjler ¼ middel ± SEM. * P < 0.05,="" **p="">< 0,01.="" od,="" optisk="" tæthed;="" pbs,="" fosfatpufret="" saltopløsning;="" rca-i,="" ricinus="" communis="" agglutinin-i;="" sna,="" sambucus="" nigra="">
Figur 4|Effekten af CpG-oligodeoxynukleotid (ODN) eller en proliferation-inducerende ligand (APRIL) tilskud på humane IgA1-udskillende cellelinjer på IgA1, galactose-deficient IgA1 (Gd-IgA1) og interleukin (IL){{ 9}} produktion. (a) CpG-ODN-tilskud øgede produktionen af IL-6. CpG-ODN øgede genekspressionen af APRIL. Western blot-analyse viste, at CpG-ODN øgede proteinniveauer af APRIL. Resultaterne blev evalueret densitometrisk. Stimulering med CpG-ODN inducerede produktionen af IgA og Gd-IgA1. (b) APRIL lille, interfererende RNA (siRNA) knockdown reducerede IL-6-induceret overproduktion af IgA og Gd-IgA1. (c) IgA{{2{{30}}}}producerende celler stimuleret med rekombinant APRIL producerede mere IgA og Gd-IgA1. (d) IgA1--udskillende celler blev inkuberet med anti-IL-6-antistof efter CpG-ODN-stimulering. Den øgede produktion af IgA og Gd-IgA1 induceret af CpG-ODN blev reduceret af anti-IL-6 antistof og ved siRNA knockdown af APRIL. Søjler ¼ middel ± SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01.="" gadph,="" glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase;="" pbs,="" fosfatpufret="">
Vi vurderede mekanismen, hvormed TLR9-aktivering medierede øget produktion af afvigende glycosyleret IgA. BAFF og APRIL er kendt for deres roller i B-celle overlevelse og differentiering. McCarthy et al.33 påviste, at BAFF-overudtrykkende transgene mus udvikler mesangiale IgA-aflejringer med nyreskade og urinabnormiteter.33 For nylig påviste vi, at genekspression af APRIL er forhøjet i tonsillære germinale centre hos patienter med IgAN. Ydermere korrelerede overekspression af APRIL i kimcentre i tonsillaren med serumniveauer af Gd-IgA1 og sygdommens sværhedsgrad hos patienter med IgAN.34 Disse fund tyder på, at både BAFF og APRIL kan være involveret i patogenesen af IgAN. Sammenhængen mellem BAFF/APRIL og TLR9-aktivering er imidlertid uklar. I denne undersøgelse øgede TLR9-aktivering genekspression og serumniveauer af APRIL. Serumniveauer af afvigende glykosyleret IgA korrelerede med ekspressionsniveauer af BAFF og APRIL i splenocytter. Serumniveauer af IgG-IgA IC korrelerede imidlertid med ekspressionsniveauer for APRIL, men ikke BAFF. Desuden var serumniveauer af APRIL forbundet med overproduktion af afvigende glykosyleret IgA og IgG-IgA IC i de TLR9-aktiverede mus. I IgA1-udskillende celler inducerede TLR9-aktivering også overproduktion af Gd-IgA1 via APRIL. Disse resultater antydede, at APRIL spiller en vigtig rolle i TLR9-induceret overproduktion af nefritogent IgA og dannelsen af IgG-IgA IC.
Responsen efter celletype for at bestemme rollen for B- og T-celler og DC'er bør afklares. I denne undersøgelse vurderede vi rollen af B-celler og plasmacytoide DC'er. TLR9 udtrykkes af DC'er, B-celler og makrofager, men ikke af T-celler.35-37 Bidraget fra BAFF/APRIL til T-celle-uafhængig antistofrespons er kendt.38,39 Her testede vi, om TLR9-aktivering kan øge syntesen af aberrant glykosyleret IgA og dannelse af IgG-IgA IC via APRIL på en T-celle-uafhængig måde. Vi brugte også klonede humane IgA1--udskillende cellelinjer og viste, at TLR9-aktivering øgede produktionen af Gd-IgA1 via APRIL og IL-6, hvilket tyder på, at processen er T-celle-uafhængig. Desuden evaluerede vi rollerne for B-celler og DC'er. Vi viste, at CpG-ODN specifikt for B-celler og DC'er øgede produktionen af afvigende glycosyleret IgA i hele splenocytter. Desuden undersøgte vi, om CpG-ODN-stimulering in vitro kan øge IgA-produktionen. CpG-ODN-stimulering af isolerede B-celler inducerede overproduktion af IgA. Derudover øgede CpG-ODN signifikant IgA-produktion, når B-celler blev dyrket sammen med DC'er (Supplerende figur S1). Disse resultater tyder på, at CpG-ODN-aktivering resulterer i størreIgA-produktion og afvigende glykosyleringmedieres af TLR9 på en T-celle-uafhængig måde.
IL-6 er kendt for at accentuere proliferationen af immunglobulin-producerende celler og den terminale differentiering af plasmaceller.40-42 Ydermere kan IL-6 også være et primært kandidat-cytokin til differentiering af T-follikulær hjælper .43,44 T-follikulære hjælpeceller er essentielle for B-celle affinitetsmodning, klasseskiftrekombination og hukommelses B-celle- og plasmacellegenerering i kimcenteret.43,44 I en lupus-musemodel, IL-6 mangel forhindrede T-follikulær hjælpercelle-differentiering og germinal-center B-celleudvidelse, hvilket resulterede i reduceret autoantistofproduktion.45 Den foreliggende undersøgelse præciserede, at TLR9-aktivering af CpG-ODN øgede IL-6-produktion i splenocytter af murint IgAN. IL-6 inducerede overproduktion af afvigende glycosyleret IgA og IgG-IgA IC i en murin model af IgAN. I humane IgA1-udskillende celler bekræftede vi, at IL-6 øgede produktionen af Gd-IgA1.24 Vores resultater tyder på, at IL-6 kan være et af de vigtigste molekyler, der inducerer overproduktion af nefritogent IgA medieret af TLR9-aktivering.
APRIL spiller en vigtig rolle i IgA-klasseskift og plasmacytoiddifferentiering.46,47 IL-6 fremmer den terminale differentiering af B-celler til IgA-udskillende plasmaceller.41,42 Den nuværende undersøgelse viste, at IL{{7} } stimulering inducerede produktionen af APRIL. Derefter antog vi, at der var en sammenhæng mellem APRIL og IL-6 medieret af TLR9-aktivering, der inducerede produktion af afvigende glycosyleret IgA. Vi fandt ud af, at IL-6-neutraliserende antistof ikke fuldstændig blokerede CpG-ODN-induceret overproduktion af Gd-IgA1, og at siRNA-knockdown af APRIL reducerede overproduktion af Gd-IgA1 induceret af IL-6. Disse data antydede, at APRIL og IL-6 synergistisk fremmede produktionen af Gd-IgA1 medieret af TLR9-aktivering. Desuden reducerede både IL-6-neutraliserende antistof og siRNA-knockdown af APRIL produktionen af IgA og Gd-IgA1 mere end IL-6-neutraliserende antistof alene gjorde. TLR9-aktiveringsvejen involverer således IL-6- og APRIL-synergistiske virkninger på antistofproduktion og glycosylering (figur 5). Nylige undersøgelser har også vist, at IL-6 i kombination med APRIL inducerede generering og overlevelse af plasmaceller.48,49 Imidlertid er fremtidige undersøgelser nødvendige for at klarlægge intercellulære signalveje mellem APRIL og IL-6 i produktionen af nefritogent IgA.
cistanchetilnyreinfektion
Afslutningsvis,TLR9 aktiveringforværret nyreskade i en murin model af IgAN ved at øge produktionen af afvigende glykosyleret IgA og dannelsen af IgG-IgA IC. I denne proces øgede overproduktionen af APRIL og IL-6 induceret af TLR9-aktivering produktionen af nefritogent IgA. Derudover præciserede denne undersøgelse, at APRIL og IL-6 fungerer synergistisk såvel som uafhængigt, for at producere afvigende glycosyleret IgA. Disse resultater kan informere den fremtidige udvikling af nye terapeutiske tilgange til IgAN.
Figur 5|Den synergistiske rolle mellem Toll-lignende receptor 9 (TLR9), en proliferation-inducerende ligand (APRIL) og interleukin (IL)-6 i IgA-producerende celler i IgA nefropati (IgAN). TLR9-aktivering inducerede produktionen af APRIL og IL-6, hvilket resulterede i
overproduktion af afvigende glykosyleret IgA. APRIL og IL-6 fungerer synergistisk for at fremme dannelsen af afvigende glycosyleret IgA. Ud over at APRIL inducerer produktionen af IL-6, som tidligere rapporteret, kan IL-6 også forbedre syntesen af APRIL. Desuden fremmer APRIL og IL-6 uafhængigt produktionen af afvigende glycosyleret IgA. NF-kB, nuklear faktor-kB.
METODER
Dyr og forsøgsprotokoller
Den IgAN-tilbøjelige ddY-mus er en kendt model af spontan IgAN med variabel forekomst og omfang af glomerulær skade, der efterligner humane IgAN.10 ddY-mus er opdelt i 3 grupper baseret på manifestationen afnyreskade: mus med tidligt eller sent opstået og hvilende mus. Tidlig opstået sygdom hos ddY-mus viser proteinuri og glomerulære IgA-aflejringer efter 20 ugers alderen.13 Derfor brugte vi ddY-mus inden for 18 ugers alderen til at evaluere, om TLR9-aktivering forværrede IgAN i denne model. I alt 30 ddY hunmus (SLC Japan, Shizuoka, Japan) blev holdt på dyrefaciliteten ved Juntendo University, Tokyo, Japan. Mus blev fodret med almindelig foder (Oriental Yeast Co., Tokyo, Japan) og vand ad libitum og blev anbragt i et specifikt patogenfrit rum. Forsøgsprotokollen blev godkendt af Ethics Review Committee for Animal Experimentation ved Juntendo University Faculty of Medicine. Ved 6 ugers alderen blev musene tilfældigt opdelt i 2 grupper. En gruppe modtog CpG-ODN injiceret ip 3 gange om ugen i 12 uger; den anden gruppe (kontrol) blev injiceret med non-CpG-ODN. CpG-ODN og ikke-CpG-ODN blev kemisk syntetiseret (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Kanagawa, Japan). Sekvenser af ODN er TCGTCGTT TTCGGCGCGCGCCG eller TGCTGCTTTTGGGGGGCCCCCC (50/30) for henholdsvis CpG eller ikke-CpG ODN'er.
Bestemmelse af IgA, IgG, IgG-IgA IC og afvigende glykosyleret IgA i murint serum
Blodprøver blev opsamlet fra den bukkale vene. Serum IgA, IgG og IgG-IgA IC blev målt ved sandwich enzym-linked immunosorbent assay (ELISA; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) ved hjælp af den modificerede metode baseret på vores tidligere rapport.50 Lectin-binding assays blev bruges til at få adgang til glykoformen af IgA. Biotinyleret RCA-I (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og Sambucus nigra bark lectin (Vector Laboratories), der genkendte galactose og sialinsyre bundet til galactose (overvejende i a2,6-binding), blev anvendt i denne analyse.51 Fortyndede sera blev tilsat ved 100 ng IgA pr. brønd. Mikrotiterplader coatet med 1 mg/ml gede-anti-mus IgA (100 ml/brønd) til kvantificering af serum IgA blev inkuberet med disse prøver, og biotinyleret Sambucus nigra agglutinin eller RCA-I blev derefter tilsat. Avidin-peberrodsperoxidasekonjugat (ExtrAvidin; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) blev påført. Serumniveauer af afvigende glycosyleret bundet IgA blev udtrykt i enheder (1 enhed som optisk densitet 1,0 målt ved 490 nm). Serumniveauer af APRIL og BAFF blev målt ved hjælp af et muse APRIL ELISA kit (MyBioSource, San Diego, CA) og et muse BAFF ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN) i henhold til producentens protokoller.
Assay for Gd-IgA1 produceret af humane IgA1-udskillende celler
En sandwich-ELISA for Gd-IgA1 blev konstrueret under anvendelse af Gd-IgA1-specifikt antistof (IBL, Japan).52 Gd-IgA1-specifikt antistof (7,5 mg/ml) fortyndet i phosphat-bufret saltvandsopløsning blev coatet på en ELISA-plade i 18 timer ved stuetemperatur. Prøver blev påført og inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur. Plader blev vasket og inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur med et 1:1000- fortyndet peberrodsperoxidase-konjugeret muse-anti-humant IgA1-1-kædespecifikt monoklonalt antistof (Southern Biotech, Birmingham, AL). Efter vask blev pladerne fremkaldt med SIG-MAFAST o-phenylendiaminopløsning (Sigma-Aldrich), og reaktionen blev standset ved tilsætning af 1 M svovlsyre (Wako, Osaka, Japan). Niveauerne af Gd-IgA1 blev ekstrapoleret ved at henvise til en standardkurve (4-parameter logistisk kurvetilpasning) med optisk tæthed ved 490 nm og udtrykt i enheder. Enzymatisk genereret Gd-IgA1 fra humant plasma IgA152 blev seriefortyndet (1,37-1000 ng/ml) for at generere en standardkurve. I denne undersøgelse blev 1 enhed defineret som 1 ng/ml af standard Gd-IgA1.52
Evaluering af nyreskade hos ddY-mus
Nyrerwere removed after perfusion with normal saline solution. Renal tissue specimens for microscopic examination were fixed in 20% formaldehyde, embedded in paraffin, cut into 3-mm-thick sections, and then stained with periodic acid–Schiff. Specimens were quantitatively analyzed to determine the percentage of glomeruli with segmental and global sclerosis and/or mesangial cell proliferation and/or increase in the mesangial matrix. Each section was scored semiquantitatively for percentages of glomeruli with aforementioned lesions (0, 0%; 1, 1% to 24%; 2, 25% to 49%; and 3, >50 procent af 20 glomeruli).13,53,54 Den samlede maksimale score for hver sektion var 9. Nyreprøver til immunfluorescens blev nedsænket i optimal skæretemperaturforbindelse (Sakura Finetek Japan Co., Tokyo, Japan) og opbevaret ved -80 grader Prøverne blev skåret i 3- mm tykke sektioner, fikseret med acetone ved -20 grader i 5 minutter, vasket med fosfatbufret saltvandsopløsning, blokeret med et blokeringsmiddel (DS Pharma Biomedical Co., Osaka, Japan) ved stuetemperatur i 30 minutter og derefter inkuberet ved stuetemperatur i 2 timer med følgende primære antistoffer: gede-anti-murine IgA, Alexa-konjugeret gede-anti-murine IgG og rotte-anti-C3 (Bethyl Laboratories). Efter yderligere 3 vaske med phosphatbufret saltvandsopløsning blev objektglassene monteret med monteringsmedium (Dako, Tokyo, Japan). Prøver blev analyseret og afbildet ved hjælp af konfokal lasermikroskopi (Olympus Corporation, Tokyo, Japan).
Kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid
RNA fra miltceller blev ekstraheret under anvendelse af Torizol-opløsning (Invitrogen, Tokyo, Japan) og oprenset med RNeasy Mini Kit (74106; Qiagen, Valencia, CA). Den kvantitative realtidspolymerasekædereaktion blev udført under anvendelse af Applied Biosystems 7500 Real-Time polymerasekædereaktionssystemet under anvendelse af SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) og specifikke primere: muse TLR9 fremadgående primer TCTCCCAACATGGTTCTCCGTCGCATGA, omvendt primer TGCAGTCCAGGCCATGA; mus MyD88 fremadgående primer GCACCTGTGTCTGGTCCATT, omvendt primer CTGTTGGA CACCTGGAGACA; og husholdningsgenet glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase fremad primer CATTGTGGAAG GGCTCATGA, omvendt primer TCTTCTGGGTGGCAGTGATG. Amplifikationsbetingelserne var som følger: forvarmning ved 95 grader i 20 sekunder og derefter 40 cyklusser af denaturering ved 95 grader i 3 sekunder og annealing og forlængelse ved 60 grader i 30 sekunder. Homo sapiens-specifikke TaqMan-genekspressionsassays (Life Technologies, Carlsbad, CA) blev købt til primeren af APRIL, Hs00601664_g1, Mm03809849-s1 og BAFF, Mm01168134-m1 . TaqMan-polymerasekædereaktionens cyklusbetingelser var som følger: forvarmning ved 95 grader i 20 sekunder og derefter 40 denatureringscyklusser ved 95 grader i 3 sekunder og annealing og forlængelse ved 60 grader i 30 sekunder
In vitro undersøgelser med splenocytter fra ddY mus
Splenocytter blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute-1640-medium suppleret med 20 procent føtalt kalveserum, 100 mg/ml streptomycin og 100 U/ml penicillin. Røde blodlegemer blev lyseret i Red Blood Cell Lysing Buffer (R7757; Sigma-Aldrich) ved stuetemperatur i 1 minut, efterfulgt af vask i Roswell Park Memorial Institute-1640 medium.50 Cellekulturer blev holdt i en fugtet inkubator ved 37 grader med 5 procent CO2. Klasse C CpG-ODN (TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG) blev anvendt som TLR9-liganden. Rekombinant IL-6, anti-IL-6 antistof og rotte IgG1 isotypekontrol blev opnået fra R&D Systems. Celler blev dyrket med enten medium eller anbefalede koncentrationer af CpG-ODN, 10 ng/ml rekombinant IL-6 og 100 ng/ml anti-IL6-antistof. IgA, afvigende glycosyleret IgA, IgG-IgA IC og APRIL produceret af splenocytter blev målt ved ELISA efter 72-timers inkubation in vitro.
In vitro undersøgelser med humane IgA1-udskillende cellelinjer
B-celler fra en rask persons blod blev udødeliggjort med Epstein-Barr-virus, subklonet for at give IgA1--udskillende cellelinjer og dyrket som beskrevet.9 Desuden bekræftede vi ekspressionen af receptorer for APRIL/BAFF og IL -6. Celler blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute-1640 medium suppleret med 20 procent føtalt kalveserum, streptomycin og penicillin i en fugtig inkubator ved 37 grader med 5 procent CO2. Klasse B CpG-ODN (TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT) blev anvendt som TLR9-liganden. Rekombinant IL-6, rekombinant APRIL, anti-IL-6-antistof og gede-IgG-kontrolantistof blev opnået fra R&D Systems. Celler blev dyrket med enten medium eller anbefalede koncentrationer af CpG-ODN, 50 ng/ml rekombinant IL-6, 40 ng/ml rekombinant APRIL og 100 ng/ml anti-IL-6 antistof i 72 timer
Western blotting
Supernatanter fra IgA1-udskillende celler blev adskilt ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese under reducerende betingelser ved anvendelse af 5 procent til 15 procent gradientpladegeler. Gelerne blev overført til polyvinylidendifluoridmembraner og inkuberet med antistoffer, der er specifikke for APRIL (Abcam Inc., Cambridge, MA) og glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (Abcam Inc.). Blots blev visualiseret ved kemiluminescens under anvendelse af forbedret kemiluminescens (GE Healthcare, Tokyo, Japan) og luminescensdetektor (Konica Minolta Healthcare, Tokyo, Japan). Resultaterne blev evalueret densitometrisk.
APRIL siRNA knockdown
Humane IgA1-secernerende celler blev dyrket i 24-brøndkulturplader og transficeret med APRIL-specifik siRNA (GS8741, Qiagen) eller siRNA nontargeting-kontrol (GS10673, Qiagen) under anvendelse af transfektionsprotokollen i henhold til producentens instruktioner . Efter inkubation i 24 timer blev cellerne inkuberet med 50 ng/ml rekombinant IL-6 (R&D Systems) i 72 timer. Efter inkubation blev celler og supernatanter høstet til måling af IgA og Gd-IgA1.
Statistisk analyse
Korrelationen mellem forskellige parametre blev analyseret ved hjælp af en variansanalyse. Data blev udtrykt som middelværdi ± SD eller medianværdier. P-værdier < {{0}}.05="" blev="" betragtet="" som="" statistisk="" signifikante.="" alle="" statistiske="" analyser="" blev="" udført="" ved="" hjælp="" af="" graphpad="" prism="" version="" 6.0="" til="" windows="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="">
cistanchetilnyresygdomssymptomer
AFSLØRING
Alle forfatterne erklærede ingen konkurrerende interesser.
ANKENDELSER
Denne undersøgelse blev delvist støttet af JSPS KAKENHI bevilling nr. 18K08252 og det praktiske forskningsprojekt for nyresygdomme fra det japanske agentur for medicinsk forskning og udvikling, AMED. JN og BAJ blev delvist støttet af National Institutes of Health-tilskud DK078244 og DK082753. Vi takker Terumi Shibata for hendes fremragende tekniske assistance. Vi takker også Ms. Takako Ikegami og Ms. Tomomi Ikeda (Afdeling for Molekylær og Biokemisk Forskning, Juntendo University Graduate School of Medicine) og Ms. Tamami Sakanishi (Afdeling for Cellebiologi, Juntendo University Graduate School of Medicine) for deres fremragende tekniske assistance .
SUPPLERENDE MATERIALE
Supplerende fil (PDF)
Figur S1. CpG-oligodeoxynukleotid (ODN)-aktiverede B-celler og dendritiske celler (DC'er) øger IgA-produktionen yderligere. B-celler og DC'er blev isoleret fra miltene fra ddY-mus. CpG-ODN-stimulering øgede IgA-produktion i de isolerede B-celler. Denne stigning blev yderligere forstærket ved co-dyrkning af B-celler med DC'er. *P < 0.05.="" de="" detaljerede="" metoder="" er="" angivet="" i="" de="" supplerende="" metoder.="" supplerende="">
REFERENCER
1. Myette JR, Kano T, Suzuki H, et al. Et proliferationsinducerende ligand (APRIL) målrettet antistof er en sikker og effektiv behandling af murin IgA nefropati. Nyre Int. 2019;96:104-116.
2. Levy M, Berger J. Verdensomspændende perspektiv af IgA nefropati. Am J Nyre Dis. 1988;12:340-347.
3. D'Amico G. Den mest almindelige glomerulonephritis i verden: IgA nefropati. QJ Med. 1987;64:709-727.
4. Feehally J, Beattie TJ, Brenchley PE, et al. Sekventiel undersøgelse af IgA-systemet i recidiverende IgA nefropati. Nyre Int. 1986;30:924-931.
5. Wyatt RJ, Julian BA. IgA nefropati. N Engl J Med. 2013;368:2402-2414.
6. Suzuki H, Yasutake J, Makita Y, et al. IgA nefropati og IgA vaskulitis med nefritis har et fælles træk, der involverer galactose-deficient IgA1--orienteret patogenese. Nyre Int. 2018;93:700–705.
7. Glassock RJ. Analyse af antistofaktivitet i IgA nefropati. J Clin Invest. 2009;119:1450-1452.
8. Moldoveanu Z, Wyatt RJ, Lee JY, et al. Patienter med IgA nefropati har øgede serum galactose-mangelfulde IgA1 niveauer. Nyre Int. 2007;71: 1148-1154.
9. Suzuki H, Moldoveanu Z, Hall S, et al. IgA1-udskillende cellelinjer fra patienter med IgA nefropati producerer afvigende glykosyleret IgA1. J Clin Invest. 2008;118:629-639.
10. Imai H, Nakamoto Y, Asakura K, et al. Spontan glomerulær IgA-aflejring i ddY-mus: en dyremodel af IgA-nefritis. Nyre Int. 1985;27:756-761.
11. Okazaki K, Suzuki Y, Otsuji M, et al. Udvikling af en model for tidligt opstået IgA nefropati. J Am Soc Nephrol. 2012;23:1364-1374.
12. Nishie T, Miyaishi O, Azuma H, et al. Udvikling af immunoglobulin A nefropati-lignende en sygdom hos beta-1,4-galactosyltransferase-I-mangelfulde mus. Am J Pathol. 2007;170:447-456.
13. Suzuki H, Suzuki Y, Yamanaka T, et al. Genomomfattende scanning i en ny IgA nefropatimodel identificerer et følsomhedslocus på murint kromosom 10, i en region, der er syntenisk til human IGAN1 på kromosom 6q22-23. J Am Soc Nephrol. 2005;16:1289-1299.
14. Takei T, Iida A, Nitta K, et al. Association mellem enkelt-nukleotid polymorfismer i selectingener og immunglobulin A nefropati. Am J Hum Genet. 2002;70:781-786.
15. Gharavi AG, Yan Y, Scolari F, et al. IgA nefropati, den mest almindelige årsag til glomerulonefritis, er forbundet med 6q22-23. Nat Genet. 2000;26:354-357.
16. Suzuki H, Suzuki Y, Narita I, et al. Toll-lignende receptor 9 påvirker sværhedsgraden af IgA nefropati. J Am Soc Nephrol. 2008;19:2384-2395.
17. Nakata J, Suzuki Y, Suzuki H, et al. Ændringer i nefritogent serum galactose-deficient IgA1 i IgA nefropati efter tonsillektomi og steroidbehandling. PLoS One. 2014;9:e89707.
18. Sato D, Suzuki Y, Kano T, et al. Tonsillar TLR9-ekspression og effektivitet af tonsillektomi med steroidpulsterapi hos IgA nefropatipatienter. Nephrol skivetransplantation. 2012;27:1090-1097.
19. Coppo R, Camilla R, Amore A, et al. Toll-lignende receptor 4-ekspressioner øges i cirkulerende mononukleære celler hos patienter med immunoglobulin A nefropati. Clin Exp Immunol. 2010;159:73–81.
20. Maiguma M, Suzuki Y, Suzuki H, et al. Kostzink er en vigtig miljømodifikator i udviklingen af IgA nefropati. PLoS One. 2014;9: e90558.
21. Kawai T, Akira S. Signalering til NF-kappaB af Toll-lignende receptorer. Trends Mol Med. 2007;13:460-469.
22. Kuwata H, Matsumoto M, Atarashi K, et al. IkappaBNS hæmmer induktion af en undergruppe af Toll-lignende receptorafhængige gener og begrænser inflammation. Immunitet. 2006;24:41-51.
23. Rostoker G, Rymer JC, Barnard G, et al. Ubalancer i serum proinflammatoriske cytokiner og deres opløselige receptorer: en formodet rolle i progressionen af idiopatisk IgA nefropati (IgAN) og Henoch Schönlein purpura nefritis og et potentielt mål for immunoglobulinterapi? Clin Exp Immunol. 1998;114:468-476.
24. Suzuki H, Raska M, Yamada K, et al. Cytokiner ændrer IgA1 O-glycosylering ved at dysregulere C1GalT1 og ST6GalNAc-II enzymer. J Biol Chem. 2014;289:5330-5339.
25. Yamada K, Huang ZQ, Raska M, et al. Hæmning af STAT3-signalering reducerer IgA1-autoantigenproduktion i IgA-nefropati. Kidney Int Rep. 2017;2:1194-1207.
26. Schneider P, MacKay F, Steiner V, et al. BAFF, en ny ligand af tumornekrosefaktorfamilien, stimulerer B-cellevækst. J Exp Med. 1999; 189: 1747-1756.
27. Kiryluk K, Li Y, Scolari F, et al. Opdagelse af nye risikosteder for IgA nefropati implicerer gener involveret i immunitet mod tarmpatogener. Nat Genet. 2014;46:1187-1196.
28. Han SS, Yang SH, Choi M, et al. Rollen af TNF-superfamiliemedlem 13 i progressionen af IgA nefropati. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3430-3439.
29. Hiki Y, Odani H, Takahashi M, et al. Massespektrometri beviser under-O glycosylering af glomerulær IgA1 i IgA nefropati. Nyre Int. 2001;59: 1077-1085.
30. Allen AC, Bailey EM, Brenchley PE, et al. Mesangial IgA1 i IgA nefropati udviser afvigende O-glykosylering: observationer hos tre patienter. Nyre Int. 2001;60:969-973.
31. Hiki Y. O-bundne oligosaccharider i IgA1-hængselregionen: roller af dens afvigende struktur i forekomsten og/eller progressionen af IgA nefropati. Clin Exp Nephrol. 2009;13:415-423.
32. Mestecky J, Tomana M, Moldoveanu Z, et al. Rolle af afvigende glycosylering af IgA1-molekyler i patogenesen af IgA nefropati. Nyre Blodtryk Res. 2008;31:29-37.
33. McCarthy DD, Kujawa J, Wilson C, et al. Mus, der overudtrykker BAFF, udvikler en kommensal flflora-afhængig, IgA-associeret nefropati. J Clin Invest. 2011;121:3991-4002.
34. Muto M, Manfroi B, Suzuki H, et al. Toll-lignende receptor 9-stimulering inducerer afvigende ekspression af en proliferation-inducerende ligand af tonsillar germinal center B-celler i IgA nefropati. J Am Soc Nephrol. 2017;28:1227-1238.
35. Latz E, Schoenemeyer A, Visintin A, et al. TLR9-signaler efter translokation fra ER til CpG DNA i lysosomet. Nat Immunol. 2004;5:190-198.
36. Hornung V, Rothenfusser S, Britsch S, et al. Kvantitativ ekspression af toll-lignende receptor 1-10 mRNA i cellulære undergrupper af humane perifere blodmononukleære celler og følsomhed over for CpG-oligodeoxynukleotider. J Immunol. 2002;168:4531-4537.
37. Kadowaki N, Ho S, Antonenko S, et al. Undergrupper af humane dendritiske celleprækursorer udtrykker forskellige tolllignende receptorer og reagerer på forskellige mikrobielle antigener. J Exp Med. 2001;194:863–869.
38. He B, Xu W, Santini PA, et al. Tarmbakterier udløser T-celle-uafhængig immunglobulin A(2) klasseskift ved at inducere epitelcelle-sekretion af cytokinet APRIL. Immunitet. 2007;26:812-826.
39. Mackay F, Schneider P. Knækker BAFF-koden. Nat Rev Immunol. 2009;9: 491-502.
40. Kunimoto DY, Nordan RP, Strober W. IL-6 er en potent cofaktor for IL-1 i IgM-syntese og af IL-5 i IgA-syntese. J Immunol. 1989;143:2230-2235.
41. Beagley KW, Eldridge JH, Lee F, et al. Interleukiner og IgA syntese. Humant og murint interleukin 6 inducerer højhastigheds IgA-sekretion i IgA-forpligtede B-celler. J Exp Med. 1989;169:2133-2148.
42. Ramsay AJ, Husband AJ, Ramshaw IA, et al. Rollen af interleukin-6 i slimhinde-IgA-antistofresponser in vivo. Videnskab. 1994;264:561-563.
43. Nurieva RI, Chung Y, Martinez GJ, et al. Bcl6 medierer udviklingen af T-follikulære hjælperceller. Videnskab. 2009;325:1001-1005.
44. Poholek AC, Hansen K, Hernandez SG, et al. In vivo-regulering af Bcl6- og T-follikulær hjælpercelleudvikling. J Immunol. 2010;185: 313-326.
45. Jain S, Park G, Sproule TJ, et al. Interleukin 6 accelererer dødeligheden ved at fremme progressionen af den systemiske lupus erythematosus-lignende sygdom hos BXSB.Yaa mus. PLoS One. 2016;11:e0153059.
46. Litinskiy MB, Nardelli B, Hilbert DM, et al. DC'er inducerer CD40-uafhængig immunglobulinklasseskift gennem BLyS og APRIL. Nat Immunol. 2002;3:822-829.
47. Castigli E, Wilson SA, Scott S, et al. TACI og BAFF-R medierer isotypeskift i B-celler. J Exp Med. 2005;201:35-39.
48. Jourdan M, Chen M, Robert N, et al. IL-6 understøtter dannelsen af humane langlivede plasmaceller i kombination med enten APRIL eller stromacelleopløselige faktorer. Leukæmi. 2014;28:1647-1656.
49. Chu VT, Fröhlich A, Steinhauser G, et al. Eosinofiler er nødvendige for at opretholde plasmaceller i knoglemarven. Nat Immunol. 2011;12: 151-159.
50. Suzuki H, Suzuki Y, Aizawa M, et al. Th1-polarisering i murin IgA nefropati rettet af knoglemarvs-afledte celler. Nyre Int. 2007;72: 319-327.
51. Chintalacharuvu SR, Emancipator SN. Glykosyleringen af IgA produceret af murine B-celler ændres af Th2-cytokiner. J Immunol. 1997;159:2327-2333.
52. Yasutake J, Suzuki Y, Suzuki H, et al. Ny lektin-uafhængig tilgang til at påvise galactose-deficient IgA1 i IgA nefropati. Nephrol skivetransplantation. 2015;30:1315-1321.
53. Katafuchi R, Kiyoshi Y, Oh Y, et al. Glomerulær score som en prognosticator i IgA nefropati: dens anvendelighed og begrænsning. Clin Nephrol. 1998;49:1-8.
54. Ballardie FW, Roberts IS. Kontrolleret prospektivt forsøg med prednisolon og cytotoksiske midler i progressiv IgA nefropati. J Am Soc Nephrol. 2002;13: 142-148.
