Karnovskys fikseringsmiddel forhindrer, at artefakter optræder som vakuolering afledt af vævsbehandling i nyrer behandlet med antisense-oligonukleotid Ⅱ

Makroskopisk blev der ikke observeret nogen unormale ændringer. Derudover viste nyreparametre (dvs. BUN og CRE) i blodkemi ingen signifikante ændringer i nogen gruppe (tabel 1).

Cistanche Supplement Nyrefunktion Support Supplement PhGs75% Ech 30% Act 12%

En oversigt over de histopatologiske fund i nyrer fikseret med 10 % NBF er vist i tabel 2. Mikroskopisk blev basofile granula og vakuoler i de proksimale tubuli, især i S1- og S2-segmenterne, observeret i både ASO-1W og ASO-2W-grupper for nyrer fikseret med 10 % NBF (fig. 1A). Disse ændringer var mere alvorlige i ASO-2W-gruppen end i ASO-1W-gruppen. Akkumuleringen af ​​basofile granula blev overvejende observeret på børstekanten af ​​de proksimale tubuli som aggregater og/eller punktformede strukturer. Da basofile granula rapporteres at være til stede både i endosomerne eller lysosomerne og frit i cytoplasmaet af det proksimale tubulære epitel14, kan disse forskellige former afspejle deres akkumulerede areal; det vil sige, at aggregaterne og punktuerede strukturer kan akkumuleres i henholdsvis lysosomer og cytoplasma. Vakuolerne i de proksimale tubuli var runde og ru i form, og de fleste var smeltet sammen med tilstødende vakuoler. Desuden indeholdt nogle af vakuolerne svage basofile granula (fig. 1E), hvilket tyder på, at vakuolerne var relevante for akkumulering af ASO'er. Immunhistokemisk var LAMP-2 positiv på membranoverfladen af ​​vakuolerne (fig. 1G og 1H). Resultaterne indikerede, at vakuoleringen var dilatationen af ​​lysosomer. Forskellen i sværhedsgraden af ​​vakuolation mellem ASO-1W- og ASO-2W-grupperne kan indikere forskellen i antallet af ASO'er akkumuleret i lysosomer. Vi spekulerer i, at mængden af ​​ASO'er akkumuleret i lysosomer stiger med stigende eksponeringstid for ASO'er. Følgelig optrådte lysosomal ekspansion som vakuolation på grund af vævsbehandling.

Tabel 1. Blodkemidata

Tabel 2. Histopatologiske fund i nyrerne fikseret med 10 % N

Selvom der blev observeret moderat vakuolation, var proksimal tubulær degeneration ikke tydelig, og størstedelen af ​​de vakuolerede epitel var negative for KIM-1 i immunhistokemisk farvning (fig. 1D). I modsætning hertil, for prøver fikseret i Karnovskys fiksativ, var vakuoler i de proksimale tubuli fraværende hos alle individer, hvorimod basofile granuler ofte blev observeret (fig. 1B). De basofile granula var mere fremtrædende end dem i prøver, der blev udsat for 10 % NBF-fiksering, fordi cellestrukturen var velbevaret (fig. 1F). I prøver udsat for 4% PFA fiksering blev vakuoler og basofile granula observeret; dog var sværhedsgraden af ​​vakuolation lidt lavere end i prøver, der blev udsat for 10 % NBF-fiksering (fig. 1C).

Oligonukleotider er meget vandopløselige molekyler og ekstraheres fra væv under forarbejdning på grund af manglende fuldstændig tværbinding af de cellulære komponenter.

Baseret på disse resultater konkluderede vi, at vakuoler i proksimale tubuli blev påvirket af fikseringsmetoden, og at de morfologiske ændringer observeret i væv udsat for 10% NBF- og 4% PFA-fiksering kan være artefakter i området for ASO-akkumulering under vævsbehandling. Med andre ord kan vakuolation være toksikologisk ubetydelig, fordi der ikke blev observeret tubulær degeneration, øget ekspression af KIM-1 eller unormale ændringer i nyreparametre. Derfor foreslår vi at bruge Karnovskys fikseringsmiddel som den valgfri fikseringsmetode til nøjagtig patologisk undersøgelse af nyren hos ASO-behandlede dyr.

Som konklusion afslørede vores nuværende resultater den mulige overvurdering af vakuolering ved brug af den konventionelle NBF-fikseringsmetode. Karnovskys fiksativ kan være et nyttigt værktøj til at skelne kunstige vakuoler fra ægte nefrotoksicitet.

Fig. 1. Repræsentative mikrofotografier af nyrerne behandlet med antisense oligonukleotid (ASO). Histopatologiske ændringer i den 2-uge låste nukleinsyre indeholdende antisense oligonukleotid (LNA-ASO)-behandlet gruppe (ASO-2W) for nyrer fikseret med (A) 10 % neutralpufret formaldehydopløsning (NBF), ( B) Karnovskys fikseringsmiddel eller (C) 4% paraformaldehydphosphatbuffer (PFA). (D) Immunhistokemisk farvning for nyreskademolekyle-1 (KIM-1) ​​af ASO-2W for nyrer fikseret med 10 % NBF.Histopatologiske ændringer i den 1-uges LNA-ASO-behandlede gruppe (ASO-1W) for nyrer fikseret med (E) 10 % NBF og (F) Karnovskys fiksativ. Immunhistokemisk farvning for lysosomal-associeret membranprotein 2 (LAMP-2) af (G) ASO-1W og (H) ASO-2W for nyrer fikseret med 10 % NBF. (A) Basofile granula (sorte pile) og vakuoler (sorte pilespidser) observeres i de proksimale tubuli. Hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning. Bar=20 μm. (B) Vakuoler observeres ikke, men basofile granula (sorte pile) observeres. H&E farvning. Bar=20 μm. (C) Basofile granula (sorte pile) og vakuoler (sorte pilespidser) observeres. Imidlertid var sværhedsgraden af ​​vakuolation lavere end i prøver, der blev udsat for 10 % NBF-fiksering. H&E farvning. Bar=20 μm. (D) Størstedelen af ​​de vakuolerede proksimale tubuli er negative for KIM-1. Bar=20 μm. (E, F) Nogle af vakuolerne observeret i proksimale tubuli indeholdt basofile granula svagt (grønne pile). De basofile granulat ses tydeligt, og cellestrukturen bevares (grønne pilespidser). H&E farvning. Søjler=20 μm. (G, H) Vakuolernes membranoverflade er positiv for LAMP-2 (blå pile). Søjler=20 mm.

Offentliggørelse af potentielle interessekonflikter: Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Anerkendelse: Forfatterne er Keisuke Yoshikawa og Tetsuya Ohta taknemmelige for deres venlige råd.

Referencer

1. Rinaldi C og Wood MJA. Antisense oligonukleotider: den næste grænse for behandling af neurologiske lidelser. Nat Rev Neurol. 14: 9–21. 2018. [Medline] [CrossRef]

2. Uemura Y og Kobayashi K. Målretning af murine alveolære makrofager ved intratracheal administration af låst nukleinsyre indeholdende antisense-oligonukleotider. Drug Deliv. 26: 803-811. 2019. [Medline] [CrossRef]

3. Bennett CF. Terapeutiske antisense-oligonukleotider er ved at blive myndige. Annu Rev Med. 70: 307-321. 2019. [Medline] [CrossRef]

4. Frazier KS. Antisense oligonukleotidterapier: løftet og udfordringerne fra en toksikologisk patologs perspektiv. Toxicol Pathol. 43: 78-89. 2015. [Medline] [CrossRef]

5. Engelhardt JA. Sammenlignende nyretoksikopatologi af antisense-oligonukleotider. Nukleinsyre Ther. 26: 199-209. 2016. [Medline] [CrossRef]

6. Frazier KS, Sobry C, Derr V, Adams MJ, Besten CD, De Kimpe S, Francis I, Gales TL, Haworth R, Maguire SR, Mirabile RC, Mullins D, Palate B, Doorten YPS, Ridings JE, Scicchitano MS , Silvano J og Woodfine J. Artsspecifikke inflammatoriske responser som en primær komponent til udvikling af glomerulære læsioner hos mus og aber efter kronisk administration af et andengenerations antisense-oligonukleotid. Toxicol Pathol. 42: 923-935. 2014. [Medline] [CrossRef]

7. Syning S, Gubler M, Gérard R, Avignon B, Mueller Y, Braendli-Baiocco A, Odin M og Moisan A. GalNAc-konjugation dæmper cytotoksiciteten af ​​antisense-oligonukleotidlægemidler i renale tubulære celler. Mol Ther Nukleinsyrer. 14:67-79. 2019. [Medline] [CrossRef]

8. Kakiuchi-Kiyota S, Koza-Taylor PH, Mantena SR, Nelms LF, Enayetallah AE, Hollingshead BD, Burdick AD, Reed LA, Warneke JA, Whiteley LO, Ryan AM og Mathialagan N. Sammenligning af hepatiske transkriptionsprofiler af låst ribonukleinsyre-antisense-oligonukleotider: bevis på forskellige veje, der bidrager til ikke-mål-medieret toksicitet hos mus. Toxicol Sci. 138: 234-248. 2014. [Medline] [CrossRef]

9. Hagedorn PH, Yakimov V, Ottosen S, Kammler S, Nielsen NF, Høg AM, Hedtjärn M, Meldgaard M, Møller MR, Ørum H, Koch T og Lindow M. Hepatotoksisk potentiale af terapeutiske oligonukleotider kan forudsiges ud fra deres sekvens og modifikationsmønster. Nukleinsyre Ther. 23: 302-310. 2013. [Medline] [CrossRef]