Undersøgelse af ifosfamid-toksicitet inducerer almindelig opstrømsregulator i lever og nyre

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Hyoung-Yun Han, et al

Abstrakt:

Ifosfamid er et alkyleringsmiddel, en syntetisk analog af cyclophosphamid, der bruges til at behandle forskellige faste kræftformer. I denne undersøgelse blev toksiciteten af ​​ifosfamid evalueret ved hjælp af enkelt- og multiple-dosis intraperitoneal administration til rotter under retningslinjer for god laboratoriepraksis, og et yderligere mikroarray-eksperiment blev fulgt for at understøtte toksikologiske resultater. En enkelt dosis ifosfamid (50 mg/kg) inducerede ingen patologiske ændringer. I mellemtiden blev der observeret alvorlig nyretoksicitet i de 7 og 28 dage efter hinanden administrerede grupper med signifikante stigninger i blodets urinstofnitrogen- og kreatininniveauer. I tokslisteanalysen blev kolesterolsyntese-relaterede gener for det meste påvirket i leveren, og nyresvigt-relaterede gener blev påvirket inyreefter administration af ifosfamid. Desuden blev interferon regulatorisk faktor 7 valgt som den vigtigste opstrømsregulator, der ændrede sig i bådeleverognyre, og blev fundet at interagere med andre målgener, såsom ubiquitin-specifik peptidase 18, radikal S-adenosylmethionin-domæne indeholdende 2 og interferon-stimuleret gen 15, hvilket yderligere blev bekræftet ved real-time RT-PCR-analyse. Som konklusion bekræftede genbekræftet nyre-biased ifosfamid organtoksicitet og identificerede identisk ændrede gener i bådeleverognyre. Yderligere omfattende toksikogenomiske undersøgelser er nødvendige for at afsløre det nøjagtige forhold mellem ifosfamid-inducerede gener og organtoksicitet.

Nøgleord:ifosfamid; hepatotoksicitet; nefrotoksicitet; intraperitoneal toksicitet

Cistanche er godt for lever og nyrer

1. Introduktion

Ifosfamid er et alkyleringsmiddel, en syntetisk analog af cyclophosphamid, der bruges til at behandle forskellige faste kræftformer, herunder sarkomer og lymfomer. Ifosfamid er et cellecyklus uspecifikt anticancerlægemiddel, der interfererer med DNA-replikation og RNA-produktion [1]. Selvom ifosfamid tolereres relativt godt sammenlignet med andre toksiske alkyleringsmidler, er det kendt for at være forbundet med adskillige livstruende bivirkninger, der begrænser dets kliniske anvendelse [2]. De største bivirkninger af ifosfamid omfatter alvorlig nyreskade som følge af reaktive toksiske arter fra ifosfamid, herunder akuttenyre skade, interstitiel nefritis, hæmoragisk blærebetændelse og Fanconi syndrom [3]. I klinikker blev alvorlig multipel organtoksicitet rapporteret hos patienter, som oplevede tidlig nyretoksicitet og gentagen højdosis ifosfamid-induceret ét organsvigt, som førte til efterfølgende organsvigt [4,5].

Den toksiske metabolit af ifosfamid, acrolein og chloracetaldehyd er en hovedansvarlig faktor for ifosfamid-organtoksicitet. Tidligere undersøgelser har hovedsageligt fokuseret på de faktorer, der påvirker omdannelsen af ​​ifosfamid til toksiske metabolitter, især cytochrom P450 (CYP) [6]. Relativt rigelige CYP3A4 og CYP3A5 i nyrerne fører til toksiske ændringer i ifosfamid og inducerer nefrotoksicitet [7]. Acrolein er et meget reaktivt aldehyd, der kan aktivere intracellulære reaktive oxidative gener og beskadige celleorganellen. Chloroacetaldehyd rapporterede undertrykkelsen af ​​kompleks I-aktiveringen i den mitokondrielle respiratoriske kæde, der kunne føre til intracellulær glutathion (GSH) udtømning og celledød [8].

En toksikologisk undersøgelse med flere organer er mere nyttig til at forstå de systemiske virkninger af lægemidler end at målrette specifikke organer til toksicitetsundersøgelser. Leveren og nyrerne er hovedorganer, der deltager i stofskifte og udskillelse af lægemidler, og disse større organer er disponerede for uønskede lægemiddelreaktioner; organtoksicitet følger ofte. Desuden kan integrativ toksikologisk evaluering præsentere forskellige patologiske fifund, der kan hjælpe med at forstå og forudsige lægemiddelinduceret toksicitet i systemet.

Mange undersøgelser har brugt genekspressionsprofiler til at forudsige de potentielle negative virkninger af kemikalier. De fleste tidligere undersøgelser fokuserede dog på at evaluere enkeltmålorgantoksicitet med kun begrænsede patologiske symptomer [9]. Derudover vil det kombineret med mikroarray-baseret genprofilering producere en omfattende system-niveau forståelse af toksicitet, der kan forhindre potentiel lægemiddel-relateret toksicitet [10]. I denne henseende er integrative multi-organ toksikologiske tilgange med genekspressionsprofilering blevet brugt i toksicitetsforudsigelsesmodelstudier for at overvinde toksicitetsdata afledt af enkeltorgantoksicitetsevaluering, hvilket er utilstrækkeligt til at forstå de toksiske mekanismer af lægemidler i systemet [11].

I denne undersøgelse beskriver vi toksiciteten af ​​ifosfamid inyreogleverefter akut og gentagen eksponering hos Sprague-Dawley (SD) rotter. Understøttende genekspressionsprofileringsassays blev udført for at afsløre det fælles målgen, der blev ændret af ifosfamid i både leveren ognyre, hvilket tyder på et indblik i integrativ ifosfamid-toksicitet.

2. Resultater

2.1. Enkeltdosis toksicitetsundersøgelse

Der blev ikke observeret toksicitet i 12,5, 25 og 50 mg/kg ifosfamid-grupperne – ikke død, toksiske symptomer, ændringer i kropsvægt eller histopatologiske fund.

I den hæmatologiske undersøgelse faldt det relative antal retikulocytter (RET) og det absolutte antal neutrofiler (NEUA) og lymfocytter (LYMA) i mellemtiden på en dosisafhængig måde.

2.2. En-uges Toksicitetsundersøgelse med gentagen dosis

Den samlede kropsvægt faldt efter 1 uges administration af ifosfamid, og middelværdierne for kropsvægttab i 100 mg/kg-gruppen var højere end dem i 75 mg/kg-gruppen (tabel 1). I mellemtiden blev den relative organvægt gradvist øget i ifosfamid-behandlede grupper (tabel 2).

En uges på hinanden følgende ifosfamid IP-administration undertrykte hæmatologiindekset, inklusive RBC, HGB, HCT, MCV og PLT, på en dosisafhængig måde (tabel 3). Desuden steg BUN og CREA 1,2 gange i kontrolgruppen sammenlignet med ifosfamidgruppen (tabel 4).Nyreskadeblev yderligere understøttet af en histopatologisk undersøgelse.

Der blev ikke observeret histopatologiske tegn i leveren hos mus i 75 og 100 mg/kg ifosfamid-grupperne (figur 1A). I mellemtidennyrerfra 75 og 100 mg/kg ifosfamid-grupperne blev fundet at have en minimal til let grad af patologisk ændring, inklusive tubulær degeneration/dilatation (1 moderat i 100 mg/kg-gruppen), enkeltcellet nekrose, urotheliumhyperplasi og fokal blødning /overbelastning (tabel 5). Derudover blev der observeret en tydelig stigning i KIM-1-ekspression i nyretubuliområdet inyreaf 100 mg/kg-gruppen (figur 1B).

2.3. Fire ugers toksicitetsundersøgelse med gentagne doser

Mortalitet blev observeret i de 50 (5/10) og 70 (10/10) mg/kg-behandlede grupper efter henholdsvis 21 og 10 dages på hinanden følgende administration. Desuden er den faldende kropsvægt med øget relativ organvægt,lever, ognyre, i alle ifosfamid-behandlede grupper, understøtter 4-ugers toksicitet ved gentagen dosis.

Hæmatologiske og serum biokemiske analyser blev udført på de overlevende forsøgspersoner. Adskillige blodparametre, herunder RET, RBC, MONA, EOSA og LUCA, blev signifikant reduceret efter 4 ugers administration af ifosfamid.

Sammenlignet med kontrolgruppen viste biokemiske analyser statistiske forskelle efter 4 ugers administration af ifosfamid. For eksempel var niveauerne af AST og CK signifikant øget, og A/G-forholdet, GLU og GGT blev reduceret (p < 0.01)="" i="" den="" 50="" mg/kg="" behandlede="" gruppe="" sammenlignet="" med="" kontrollen="">

2.4. Ifosfamid-induceret genekspressionsanalyse

De ifosfamid-inducerede DEG'er blev identificeret i leveren ognyrevæv (tabel 6). For leveren omfattede de differentielt udtrykte gener 2672 gener ved 100 mg/kg lgv/dag, 1283 gener blev opreguleret, og 1389 gener blev nedreguleret. I nyrerne blev 401 gener differentielt udtrykt ved 100 mg/kg lgv/dag - 149 gener blev opreguleret, og 252 gener blev nedreguleret. I både leveren og nyren var antallet af nedregulerede gener større end antallet af opregulerede gener. Dette kan tyde på, at ifosfamidbehandling ser ud til at hæmme genekspression.

Resultaterne af den biologiske funktionsanalyse er anført i tabel 7. Den 1-uge af ifosfamid-administration viste sig at ændre gener relateret til organudvikling, for det meste i leveren. I dennyre, blev det bekræftet, at generne relateret til immuncellelokalisering for det meste var påvirket.

I den kanoniske pathway-analyse af DEG'er var ændringer i kolesterolsyntese og antigenpræsentationsvej-relaterede gener tydelige ileverognyrehenholdsvis væv (figur 2). Desuden var LXE/RXR og akut faseresponssignalering den almindelige topregulerede kanoniske vej ileverognyre, som var impliceret i henholdsvis lipidhomeostase og inflammatorisk cytokinsignalering.

I levertokslisteanalysen blev kolesterolsyntese-relaterede gener for det meste påvirket, efterfulgt af de positive akutfase-responsproteiner og panelet for akut nyresvigt (tabel 8). Ydermere afslørede nyrelistens resultater, at de nyresvigt-relaterede gener generelt var påvirket af ifosfamid, herunder reversible glomerulonefritis biomarkører og akut nyresvigt panel.

Baseret på IPA-videnbasen regulerer en fælles opstrømsregulator genekspression i leveren og nyrerne efter ifosfamidbehandling (figur 3). IRF7 var den vigtigste regulator, der ændrede sig i både lever og nyre og viste sig at interagere med andre målgener såsom USP18, RSAD2 og ISG15. Desuden bekræftede real-time RT-PCR-analyse ekspressionen af ​​IRF7, USP18, RSAD2 og ISG15. Selvom omfanget af ændringerne i hvert gen var forskelligt mellem lever og nyre, blev ekspression undertrykt i både lever- og nyrevæv efter 1 uges administration af ifosfamid. RSAD2 og USP18 har for det meste ændret gener ved ifosfamidbehandling i henholdsvis lever og nyre.

3. Diskussion

I denne undersøgelse blev omfattende ifosfamid-toksicitet i flere organer undersøgt med forskellige doser og eksponeringsbetingelser gennem IP-vejen hos rotter under GLP-standarden. I klinikker kan ifosfamid udøve en bimodal antitumorvirkning med cytotoksiske og immunmodulerende virkninger kombineret med adoptiv immunterapi [12]. Ifosfamid vides hovedsageligt at blive elimineret via nyrerne, og omkring 80 procent af dosis er i uændret form, nefrotoksicitet er en almindeligt kendt bivirkning af ifosfamid, og metabolitter såsom chloracetaldehyd og acrolein er ansvarlige for dets kliniske anvendelse [13, 14].

I denne undersøgelse var en 1-uges gentagen toksicitetsundersøgelse velegnet til at udforske ifosfamid-afledt organtoksicitet. En uges ifosfamid-administration undertrykte blodindekset på en dosisafhængig måde, hvilket kunne afspejle typisk ifosfamid-afledt myelosuppression. Sammen med nefrotoksicitet har flere rapporter indikeret, at myelosuppression er en af ​​de største dosisbegrænsende ifosfamidtoksiciteter, og leukopeni er generelt mere alvorlig end trombocytopeni [15,16]. Ifosfamid nefrotoksicitet kan føre til Fanconi syndrom, hvor der er en svækkelse af den proksimale tubulifunktion, hvilket resulterer i irreversibel skade, og den toksiske metabolit acrolein fremkalder urotoksicitet med hæmoragisk blærebetændelse [17]. Dette er i overensstemmelse med resultaterne af nærværende undersøgelse. I den histopatologiske undersøgelse blev nyrerne og leveren undersøgt for at udforske ifosfamid-afledte patologiske ændringer. I både 75 og 100 mg/kg ifosfamid-administrerede grupper blev store områder med tubulær degeneration og udvidelse påvist med urotheliumhyperplasi i nyrebækkenområdet. Ydermere understøttede ekspressionen af ​​KIM-1, et proksimalt tubulusskademolekyle, tilstedeværelsen af ​​ifosfamid-relateret nefrotoksicitet. I mellemtiden blev der kun observeret minimal periportal vakuolation i leveren. Desuden, selvom AST- og ALAT-værdierne faldt på en dosisafhængig måde, var ændringerne inden for referenceområdet [18]. Dybere årsager til nedsatte leverenzymniveauer skal undersøges yderligere. Det er generelt accepteret, at ifosfamid er et alkyleringsmiddel, der sjældent er forbundet med hepatotoksicitet, og kun få tilfælde er blevet rapporteret at inducere leverskade, især når det kombineres med andre kemoterapeutiske lægemidler såsom doxorubicin [19].

For nylig har bemærkelsesværdige fremskridt inden for genekspressionsdata i toksikologi med high-throughput-teknologier ført til generering af tilstrækkeligt store datasæt i toksicitetsundersøgelser, og der er gjort mange forsøg på at anvende genprofilen til forudsigelse af kemisk toksicitet [10,20]. I denne undersøgelse blev mikroarray-analyse udført for at analysere transkriptom-responset induceret af ifosfamid-administration, og DEG'er med en foldændring større end eller lig med 1,5 blev valgt som målgenet og den biologiske funktion, kanoniske vej og tokslisteanalyse blev brugt at forstå funktionen af ​​ifosfamid-inducerede gener. En yderligere opstrøms regulatoranalyse blev udført for at evaluere muligheden for multiorgantoksicitet i leveren og nyrerne.

I denne undersøgelse blev DEG'er ændret 1.5- gang udvalgt, og de nedregulerede gener var lidt mere dominerende end de opregulerede gener i både leveren (52 procent) og nyrerne (62 procent). Resultaterne af den biologiske funktionsanalyse indikerede, at ifosfamid ændrer generne med biologiske funktioner relateret til vævsudvikling, som almindeligvis observeres i både lever og nyre.

En tidligere undersøgelse af Snouber et al. [21] rapporteret ifosfamidbehandling viste sig at nedregulere Nrf-2-medierede stressoxidative reaktionsveje i den mikrofluidiske kultur [21]. I overensstemmelse med de tidligere undersøgelser blev den NRF2-medierede oxidative stress-respons-vej signifikant moduleret af topnetværk, hvilket blev bekræftet af både den nuværende kanoniske pathway og toks-liste-analyse. De nuværende ændrede Nrf-2-medierede stressoxidative reaktionsveje kan være tæt relateret til den ifosfamid-toksiske metabolit. Flere toksiske ifosfamid-metabolitter kan reagere med GSH, en potent antioxidant, for at danne konjugater på forskellige steder langs vejen, og et fald i GSH-niveauet resulterer i øget toksicitet, hvilket indikerer implikationen af ​​oxidativt stress i ifosfamid-organtoksicitet [8,22 ]. I denne henseende blev mesna og N-acetylcystein brugt til at lindre ifosfamid-organtoksicitet. Mesna fungerer som et regionalt afgiftningsmiddel ved at binde sig til ifosfamid toksisk metabolit, hovedsageligt mod acrolein, gennem en Michael-tilsætning for at danne et mindre skadeligt stof [23]. Derudover rapporteres N-acetylcystein at have antioxidantaktivitet og forbedre GSH-udtømning under oxidative stressforhold [24]. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at belyse det nøjagtige forhold mellem ifosfamid-modgift og vej reguleret under nefrotoksiske forhold. Vi kan spekulere i, at forbedringen af ​​ifosfamid-toksicitet af mesna eller N-acetylcystein kan blive efterfulgt af forbedrede Nrf-2-medierede stressoxidative reaktionsveje.

I denne undersøgelse blev de inflammationsrelaterede signaler almindeligvis opreguleret i både lever og nyrer, hvilket kan genkendes ved akut fasesignalering i kanonisk pathway-analyse. Dette resultat indikerede implikationen af ​​inflammatorisk reaktion i patofysiologien af ​​ifosfamid-organtoksicitet i begge væv, hvilket yderligere blev understøttet af opstrømsregulatoranalysen. I opstrømsregulatoranalysen blev IRF7 og interferon (IFN) signalrelaterede gener, inklusive USP18, RSAD2 og ISG15, udvalgt som almindelige opstrømsregulatorer i leveren og nyrerne. IRF7 er en lymfoid-specifik faktor, som er konstitutivt udtrykt i immuncellens cytoplasma og kan også induceres af type I interferon, virusinfektion og eksterne stimuli i forskellige celler [25]. En tidligere undersøgelse rapporterede kontroversielle pro- eller anti-onkogene egenskaber af IRF7 i forskellige tumorceller, og ændringerne i IRF7-ekspression var forbundet med DNA-skade [26-28].

Ud over sin vigtige regulerende rolle i type I IFN for antivirale funktioner, blev IRF7 rapporteret at undertrykke inflammatoriske responser gennem TLR4-signalvejen [29]. Desuden har Stout-Delgado et al. [30] rapporterede, at ældningsinduceret oxidativ stigning hæmmer IRF7-aktivitet, hvorimod reduktion af stress med antioxidantmidler forbedrede IRF7-aktivitet. I denne undersøgelse undertrykte ifosfamid-administration ekspressionen af ​​opstrømsregulatorer, og ekspressionsmønstrene var identiske i både lever og nyre. De nuværende ændringer i IRF7-ekspression kan relateres til ifosfamids inflammatoriske reaktion og cytotoksiske alkyleringsmiddelegenskaber, hvilket kan antyde IRF7 som et lovende mål for ifosfamid-organtoksicitet.

I denne undersøgelse fandt vi et gen, der var identisk hæmmet i både lever og nyre efter ifosfamid administration, men fortolkningen af ​​dets toksikologiske betydning var kun fokuseret på nyren, hvilket begrænser den nuværende opdagelse. Yderligere bekræftende undersøgelser relateret til virkningen af ​​den kommercielt tilgængelige ifosfamid-modgift på det aktuelt ændrede gen kan understøtte de nuværende resultater.

Som konklusion viste en gentagen toksicitetsundersøgelse (1 uge) med ifosfamid administration at have biased nefrotoksicitet snarere end hepatotoksicitet. Derudover giver de nuværende resultater bevis for ifosfamid-induceret hepatotoksicitet og nefrotoksicitetsmekanisme, der involverer IRF-7-hæmning. Yderligere toksikogenomiske undersøgelser af immunrelaterede organer er nødvendige for at belyse den systemiske toksikologiske mekanisme af ifosfamid og for at understøtte forholdet mellem gen- og organtoksicitet.

4. Materialer og metoder

4.1. Dyrestudie

Otte uger gamle han-specifikke patogenfri Sprague-Dawley (SD) rotter (n=140) blev opnået fra Orient Bio Inc. (Seongnam, Korea). Dyrene blev undersøgt og akklimatiseret til laboratoriemiljøforhold i en uge før forsøget. Alle dyr blev anbragt i plastikbure under kontrollerede laboratorieforhold (temperatur, 23 ± 3 ◦C; fugtighed, 55 ± 10 procent; og 12/12-t lys/mørke cyklus) med laboratoriefoder og vand ad libitum. Dyreundersøgelsen blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee fra Korea Institute of Toxicology (Daejeon, Korea), og alle procedurer blev udført i overensstemmelse med testretningslinjerne for sikkerhedsvurdering af lægemidler fra Korea Food and Drug Administration. Dyreundersøgelsen blev opdelt i tre sektioner: enkeltdosis (akut) og gentagen dosis (1 uge og 4 uger) på hinanden følgende indgiftstoksicitetsundersøgelse. Fyrre rotter blev tilfældigt tildelt fire grupper (kontrol, t1, t2 og t3) under anvendelse af Path/Tox-systemet (version. 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA) i hver toksicitetsundersøgelse.

4.2. Toksicitetseksperiment

Toksicitetsundersøgelsen blev opdelt i tre sektioner: enkeltdosis (akut) og to gentagne doser (konsekutiv dosis på 1 uge eller 4 uger) toksicitetsundersøgelser. For hver toksicitetsundersøgelse blev rotter tilfældigt tildelt passende grupper (kontrol, dosis 1, dosis 2 og dosis 3 for enkelt- og 4-ugers toksicitetsundersøgelser; kontrol, dosis 1 og dosis 2 for 1- uges toksicitetsundersøgelse) ved at bruge Path/Tox-systemet (version. 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, USA). I toksicitetsundersøgelsen blev ifosfamid administreret via den intraperitoneale (IP) vej, og kontrolgruppen modtog destilleret vand (DW). Ifosfamid-dosis, der blev brugt i toksicitetsundersøgelsen, var som følger: akut toksicitetsundersøgelse (12,5, 25 og 50 mg/kg), 1-ugers toksicitetsundersøgelse (75 og 100 mg/kg lgv/dag) og {{19 }}uges toksicitetsundersøgelse (25, 50 og 70 mg/kg lgv/dag). Dyrenes generelle kliniske symptomer, kropsvægt og dødelighed blev registreret dagligt under administration, og alle dyr blev aflivet 24 timer efter den sidste ifosfamid-administration. Blodprøver blev opsamlet og anbragt i mikrocentrifugerør og EDTA-K2-rør til henholdsvis serumbiokemi og hæmatologisk analyse. Lever- og nyrevæv blev fikseret i formaldehyd og underkastet histopatologisk analyse. Yderligere immunhistokemi, mikroarray-analyse og real-time RT-PCR blev udført på lever- og nyrevæv fra det subakutte toksicitetsstudie (100 mg/kg lgv/dag).

4.3. Hæmatologisk og serum biokemisk analyse

Standard hæmatologiske test blev udført under anvendelse af et ADVIA 120 hæmatologisystem (Bayer, Fernwald, Tyskland). Følgende indikatorer blev brugt: antal hvide blodlegemer (WBC), antal røde blodlegemer (RBC), hæmatokrit (HCT), hæmoglobinkoncentration, gennemsnitlig korpuskulær volumen (MCV), gennemsnitlig korpuskulær hæmoglobin (MCH), blodpladetal (PLT), antal lymfocytter (LYM), monocytter (MON), neutrofiler (NEU), basofile (BAS), eosinofiler (EOS) og store ufarvede celler (LUC) og retikulocyttal (RET).

Det biokemiske assay blev udført under anvendelse af en automatisk analysator (TBA 120FRNEO; Toshiba Corp., Tokyo, Japan) med centrifugeret serum. De vigtigste biokemiske indikatorer var alaninaminotransferase (ALT), aspartataminotransferase (AST), alkalisk fosfatase (ALP), blodurin nitrogen (BUN), kreatinin (CREA), glucose (GLU), total kolesterol (TCHO), albumin/globulin-forhold (A/G), triglycerider (TG), total bilirubin (TB), gamma-glutamyl transferase (GGT), phospholipider (PL), calcium, chlorid, uorganisk natrium, fosfor og kalium.

4.4. Histopatologisk og immunhistokemi undersøgelse

Paraffin-indlejrede væv blev skåret i snit i 5- µm tykkelse, farvet med hæmatoxylin og eosin (H&E) og undersøgt mikroskopisk.

Nyrevævet blev underkastet immunhistokemi. De afparaffiniserede og vaskede sektioner blev præinkuberet med 10 procent gedeserum for at blokere uspecifik farvning. Objektglassene blev derefter inkuberet natten over med det primære anti-KIM1-antistof (1:750; Santa Cruz, CA, USA). Efter fjernelse af primære antistoffer blev snittene behandlet med VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Vector Laboratories, Peterborough, UK), og KIM1-ekspression blev undersøgt under et lysmikroskop.

4.5. Mikroarray-analyse og protein-protein-interaktionsanalyse (PPI).

Leveren og nyrerne fra 1-uge-gruppen (100 mg/kg) blev homogeniseret, og det samlede RNA blev ekstraheret med et RNase-minikit (Qiagen). cDNA-syntese blev opnået ved hjælp af et cDNA-syntesesæt (Affymetrix, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) og underkastet mikroarray- og PPI-analyser.

Mikroarray-analyse blev udført ved hjælp af Affymetrix GeneChip Rat {{0}}.0 med GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix Santa Clara, CA, USA) og resultaterne blev behandlet ved hjælp af GeneSpring GX v13.0 analysesoftware (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). De differentielt udtrykte gener (DEG'er), som ændrede sig mere end 1.5- gang efter ifosfamid-administration, blev udvalgt ved hjælp af en envejs-variansanalyse (ANOVA) med Tukeys post hoc-test. De biologiske funktioner og kanoniske veje for de udvalgte DEG'er blev analyseret ved hjælp af Ingenuity Pathway Analysis-softwaren (IPA, ver. 9.0; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA), og en opstrømsregulatoranalyse blev udført for at identificere de opstrømsregulatorer, der evt. være ansvarlig for DEG'erne afledt af ifosfamid-toksicitet. Yderligere protein-protein interaktion (PPI) netværksanalyse af DEG'erne blev udført ved hjælp af STRING software (version 10), og interaktionen blev bekræftet, når den medium konfidensscore var over 0,4. Proteininteraktion er den omtrentlige sandsynlighed for, at der eksisterer en forudsagt forbindelse mellem to proteiner i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway.

4.6. Kvantitativ realtids RT-PCR-undersøgelse

Ekspressionen af ​​fælles regulatorgener i mikroarray-undersøgelsen blev bekræftet ved hjælp af kvantitativ real-time RT-PCR. Genspecifikke primere blev opnået fra Bioneer (Daejeon, Korea). Primersekvenserne var som følger: interferon regulatorisk faktor 7 (IRF7): fremad, 5-TGCTTGTCTAGCACCAATAG-3 og omvendt, 5-CACAAGGTCCACTAGAGATG-3; ubiquitin-specifik peptidase 18 (USP18): fremad, 5-CTGTAGTTTGTCTCCCAACA-3 og omvendt 5-GAACTGATTACCTCCCACTG-3; radikalt S-adenosylmethionin-domæne indeholdende 2(RSAD2): fremad, 5-ACCAATCATCAGAGGTTGAC-3 og omvendt, 5-CTGCATGATTGTTCTTGGAC-3; interferon-stimuleret gen 15 (ISG15): fremad, 5-AAGTCTCCCAAGACCAATTC-3og omvendt, 5-CTACATTGGCTCTGGATAGG-30.

Total RNA blev revers-transskriberet til cDNA ved anvendelse af SuperScript II (Invitrogen, Carls bad, CA, USA) og oligo-dT-primere i henhold til producentens instruktioner. mRNA-ekspressionsniveauer af opstrøms reguleringsrelaterede gener blev analyseret ved hjælp af theStepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) med anSYBR Green master mix (Applied Biosystems) i henhold til producentens protokol. 18S ribosomale RNA-primeren blev brugt som en intern kontrol, og resultaterne blev udtrykt som foldændring i forhold til den normale kontrolgruppe.

4.7. Statistisk analyse

Dataene blev statistisk analyseret ved hjælp af flere sammenligningsmetoder. Når Bartletts test ikke viste nogen signifikante afvigelser fra varianshomogenitet, blev variansanalyse (ANOVA) brugt til at bestemme, om nogen af ​​gruppemiddelværdierne afveg ved signifikansniveauet p < {0}}.05.="" derudover="" blev="" dunnetts="" test="" brugt="" til="" at="" bestemme="" forskelle="" i="" data="" mellem="" kontrol-="" og="" behandlingsgrupperne,="" når="" dataene="" viste="" sig="" at="" være="" signifikante="" fra="" anova-testen.="" ydermere,="" når="" signifikante="" afvigelser="" fra="" varianshomogenitet="" blev="" observeret="" fra="" bartletts="" test,="" blev="" en="" ikke-parametrisk="" sammenligningstest,="" kruskal-wallis="" (h)="" test,="" udført="" for="" at="" bestemme,="" om="" nogen="" af="" ​​gruppemiddelværdierne="" afveg="" ved="" p="">< 0,05.="" når="" en="" signifikant="" forskel="" blev="" observeret="" i="" kruskal-wallis="" (h)="" testen,="" blev="" dunn's="" rank="" subtest="" udført="" for="" at="" kvantificere="" de="" specifikke="" par="" af="" gruppedata,="" der="" var="" signifikant="" forskellige="" fra="" gennemsnittet.="" fishers="" eksakte="" test="" blev="" udført="" for="" at="" sammenligne="" datapar="" (inklusive="" prævalens="" og="" procent).="" sandsynlighedsniveauet="" blev="" sat="" til="" 1="" eller="" 5="" procent.="" statistiske="" analyser="" blev="" udført="" ved="" at="" sammenligne="" data="" fra="" de="" forskellige="" behandlingsgrupper="" med="" data="" fra="" kontrolgruppen="" ved="" brug="" af="" path/tox="" (version.="" 4.2.2,="" xybion="" medical="" systems="" corporation,="" lawrenceville,="" nj,="">

Erklæring om datatilgængelighed:

Data er indeholdt i artiklen eller det supplerende materiale.

Interessekonflikt:

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

Referencer

1. Palmerini, E.; Setola, E.; Grignani, G.; D'Ambrosio, L.; Comandone, A.; Righi, A.; Longhi, A.; Cesari, M.; Paioli, A.; Hakim, R.; et al. Højdosis ifosfamid hos recidiverende og ikke-operable højgradigt osteosarkompatienter: En retrospektiv serie. Cells 2020, 9, 2389. [CrossRef]
2. Klastersky, J. Bivirkninger af ifosfamid. Onkologi 2003, 65, 7-10. [CrossRef]
3. Sprangers, B.; Lapman, S. Voksesmerterne ved ifosfamid. Clin. Nyre J. 2020, 13, 500-503. [CrossRef]
4. Elias, AD; Ayash, LJ; Wheeler, C.; Schwartz, G.; Tepler, I.; McCauley, M.; Mazanet, R.; Schnipper, L.; Frei, E., 3.; Antman, KH Højdosis ifosfamid/carboplatin/etoposid med autolog hæmatopoietisk stamcellestøtte: Sikkerhed og fremtidige retninger. Semin. Oncol. 1994, 21, 83-85. [PubMed]
5. Mollenkopf, A.; Du Bois, A.; Meerpohl, HG Sekventielt kursus og prospektiv håndtering af ifosfamid-induceret multi-organ toksicitet. Geburtshilfe Frauenheilkd. 1996, 56, 525-528. [CrossRef]
6. Aleksa, K.; Matsell, D.; Krausz, K.; Gelboin, H.; Ito, S.; Koren, G. Cytochrome P450 3A og 2B6 i den udviklende nyre: Implikationer for ifosfamid nefrotoksicitet. Pediatr. Nephrol. 2005, 20, 872-885. [CrossRef] [PubMed]
7. Lowenberg, D.; Thorn, CF; Desta, Z.; Flockhart, DA; Altman, RB; Klein, TE PharmGKB resumé: Ifosfamid-veje, farmakokinetik og farmakodynamik. Pharmacogenet. Genom. 2014, 24, 133. [CrossRef] [PubMed]
8. MacAllister, SL; Martin-Brisac, N.; Lau, V.; Yang, K.; O'Brien, PJ Acrolein og chloracetaldehyd: En undersøgelse af celle- og cellefri biomarkører for toksicitet. Chem. Biol. Interagere. 2013, 202, 259-266. [CrossRef]
9. Kim, J.; Shin, M. En integrerende model af multi-organ lægemiddel-induceret toksicitet forudsigelse ved hjælp af gen-ekspression data. BMC Bioinform. 2014, 15, S2. [CrossRef]
10. Alexander-Dann, B.; Pruteanu, LL; Oerton, E.; Sharma, N.; Berindan-Neagoe, I.; Módos, D.; Bender, A. Udviklingen i toksikogenomik: Forståelse og forudsigelse af forbindelsesinduceret toksicitet fra genekspressionsdata. Mol. Omics 2018, 14, 218-236. [CrossRef]
11. An, YR; Kim, JY; Kim, YS Konstruktion af en prædiktiv model til evaluering af multipel organtoksicitet. Mol. Celletoxicol. 2016, 12, 1-6. [CrossRef]
12. Binotto, G.; Trentin, L.; Semenzato, G. Ifosfamid og cyclophosphamid: Virkninger på immunovervågning. Onkologi 2003, 65, 17-20. [CrossRef]
13. Schwerdt, G.; Gordjani, N.; Benesic, A.; Freudinger, R.; Wollny, B.; Kirchhoff, A.; Gekle, M. Chloroacetaldehyd- og acroleininduceret død af humane proksimale tubuliceller. Pediatr. Nephrol. 2006, 21, 60-67. [CrossRef]
14. Ensergueix, G.; Pallet, N.; Joly, D.; Levi, C.; Chauvet, S.; Trivin, C.; Augusto, JF; Boudet, R.; Aboudagga, H.; Touchard, G.; et al. Ifosfamid nefrotoksicitet hos voksne patienter. Clin. Nyre J. 2020, 13, 660-665. [CrossRef]
15. Dechant, KL; Brogden, RN; Pilkington, T.; Faulds, D. Ifosfamide/mesna. En gennemgang af dets antineoplastiske aktivitet, farmakokinetiske egenskaber og terapeutisk effekt ved cancer. Drugs 1991, 42, 428-467. [CrossRef]
16. Pronk, LC; Schrijvers, D.; Schellens, JHM; De Bruijn, EA; Plantning, A.; Locci-Tonelli, D.; Groult, V.; Verweij, J.; Van Oosterom, AT Fase I undersøgelse af docetaxel og ifosfamid hos patienter med fremskredne solide tumorer. Br. J. Cancer. 1998, 77, 153-158. [CrossRef] [PubMed]
17. Skinner, R. Kronisk ifosfamid nefrotoksicitet hos børn. Med. Pediatr Oncol. 2003, 41, 190-197. [CrossRef]
18. Sharp, P.; Vilano, JS Laboratorierotten; CRC Press: Boca Raton, FL, USA, 2012.
19. Cheung, MC; Jones, RL; Judson, I. Akut levertoksicitet med ifosfamid til behandling af sarkom: En sagsrapport. J. Med. Sagsrev. 2011, 5, 180. [Krydsref.]
20. Cui, Y.; Paules, RS Brug af transkriptomik til at forstå mekanismer for lægemiddelinduceret toksicitet. Pharmacogenomics 2010, 11, 573-585. [CrossRef]
21. Snouber, LC; Jacques, S.; Monge, M.; Legallais, C.; Leclerc, E. Transkriptomisk analyse af effekten af ​​ifosfamid på MDCK-celler dyrket i mikrofluidiske biochips. Genomics 2012, 100, 27-34. [CrossRef] [PubMed]
22. Dirven, HA; Megens, L.; Oudshoorn, MJ; Dingemanse, MA; van Ommen, B.; Van Bladeren, PJ Glutathionkonjugation af det cytostatiske lægemiddel ifosfamid og rollen af ​​human glutathion S-transferaser. Chem. Res. Toxicol. 1995, 8, 979-986. [CrossRef]
23. Jeelani, R.; Jahanbakhsh, S.; Kohan-Ghadr, HR; Thakur, M.; Khan, S.; Aldhaheri, SR; Yang, Z.; Andreana, P.; Morris, R.; Abu-Soud, HM Mesna (2-mercaptoetan natriumsulfonat) fungerer som en regulator af myeloperoxidase. Fri Radik. Biol. Med. 2017, 110, 54-62. [CrossRef]

24. Alnahdi, A.; John, A.; Raza, H. N-acetylcystein dæmper oxidativt stress og glutathionafhængig redoxubalance forårsaget af behandling med højt glukose/høj palmitinsyre i pancreas Rin-5F-celler. PLoS ONE 2019, 14, e0226696. [CrossRef]

25. Zhang, L.; Pagano, JS IRF-7, en ny interferon regulatorisk faktor forbundet med Epstein-Barr virus latens. Mol. Cell Biol. 1997, 17, 5748-5757. [CrossRef]
26. Pagano, JS Vira og lymfomer. N. Engl. J. Med. 2002, 347, 78-79. [CrossRef]
27. Romieu-Mourez, R.; Solis, M.; Nardin, A.; Goubau, D.; Baron-Bodo, V.; Lin, R.; Massie, B.; Salcedo, M.; Hiscott, J. Distinkte roller for IFN regulatorisk faktor (IRF)-3 og IRF-7 i aktiveringen af ​​antitumoregenskaber af humane makrofager. Cancer Res. 2006, 66, 10576-10585. [CrossRef]
28. Ning, S.; Pagano, JS; Barber, GN IRF7: Aktivering, regulering, modifikation og funktion. Genes Immun. 2011, 12, 399-414. [CrossRef]
29. Chen, PG; Guan, YJ; Zha, GM; Jiao, XQ; Zhu, HS; Zhang, CY; Wang, YY; Li, HP Swine IRF3/IRF7 dæmper inflammatoriske responser gennem en TLR4-signalvej. Oncotarget 2017, 8, 61958. [CrossRef]
30. Stout-Delgado, HW; Yang, X.; Walker, WE; Tesar, BM; Goldstein, DR Aldring svækker IFN-regulatorisk faktor 7-opregulering i plasmacytoide dendritiske celler under TLR9-aktivering. J. Immunol. Res. 2008, 181, 6747-6756. [CrossRef]