Indflydelse af in vitro menneskelig fordøjelsessimulering på phenolindholdet og biologiske aktiviteter af de vandige ekstrakter fra tyrkiske cistusarter, del 2

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

3. Diskussion

Frie radikaler kan angribe proteiner, lipider eller DNA for at fremskaffe en elektron, hvilket resulterer i forskellige sundhedsproblemer. Af denne grund er det vigtigt at balancere kroppens antioxidantsystem og de frie radikaler, der dannes ved oxidation. I tilfælde af forringelse af denne balance opstår oxidativ stress [29]. Oxidativt stress er en af ​​hovedfaktorerne, der resulterer i forskellige kroniske lidelser såsom kræft, diabetes, hjerte-kar-sygdomme, Alzheimers sygdom osv. Mens der er selv-antioxidant-systemer i den menneskelige krop til at bekæmpe den oxidative skade på væv og organer, forsvarer disse systemer kan miste deres effektivitet på grund af forskellige tilstande såsom overforbrug af alkohol, rygning, stress, kronisk stofbrug og stråling osv. [30]. Forskellige videnskabelige rapporter har indikeret, at sekundære plantemetabolitter spiller en væsentlig rolle i forebyggelsen af ​​oxidativ stress og dets skadelige virkninger [13,14,31]Selvom biotilgængelighed er en vigtig parameter, der påvirker bioaktiviteten af ​​disse forbindelser, er den ikke blevet taget i betragtning i de fleste undersøgelser. Det er dog velkendt, at de sekundære metabolitter udsættes for strukturelle transformationer på grund af forskellige pH-forhold, enzymatisk aktivitet og kropstemperatur i mave-tarmsystemet. Derudover er de kemiske egenskaber af de sekundære metabolitter såsom molekylvægt, polaritet og bindingsgrad til makromolekyler i plantematrixen også væsentlige faktorer, der påvirker deres biotilgængelighed [13]. Følgelig er absorption af forbindelserne eller deres metabolitter i blodbanen, når de først er indtaget, essentiel for at udøve deres systemiske fysiologiske virkninger. In vitro-fordøjelsessimuleringsmodeller kan give dokumentation for vurderingen af ​​stoffers mulige biotilgængelighedskarakteristika. Mens bekræftelse i forsøg på mennesker er nødvendig for at hævde enhver funktionel egenskab, bruges in vitro simulationsmodeller bredt som alternativer til in vivo undersøgelser eller forsøg på mennesker, som ofte er etisk diskutable, ressourcekrævende, dyre og tidskrævende [32].

Klik venligst her for at vide mere

Adskillige forskere har også undersøgt antioxidantpotentialet i ekstrakter fremstillet af forskellige organer fra Cistus-arter. Ifølge litteraturundersøgelsen er dette den første undersøgelse af Cistus-arter vedrørende biotilgængeligheden af ​​phenoliske stoffer og deres indvirkning på antioxidantaktivitet ved at anvende en in vitro-fordøjelsessimuleringsmodel. Karas et al. [33] foreslog, at 10 procent af de polyphenoliske komponenter forbliver ufordøjede i plantematrixen, og 90 procent af dem udsættes for fordøjelse i mave- eller tarmfasen (henholdsvis ca. 48 procent og 52 procent). Som tidligere nævnt blev alle phenoliske mængder i vandige ekstrakter negativt påvirket af in vitro human fordøjelsessimuleringsprocedure. Der blev således påvist betydelige tab i phenolindholdet i de biotilgængelige prøver af alle ekstrakter. Desuden var de totale proanthocyanidinkoncentrationer af IN-prøver under detektionsgrænsen i alle vandige ekstrakter. Forskellige undersøgelser foranledigede også den negative indflydelse af fordøjelsesproceduren på phenolforbindelser i planteekstrakterne og dermed relaterede bioaktiviteter. For eksempel rapporterede vi det samlede phenolindhold i Salvia virgata Jacq. blev også negativt påvirket af fordøjelsesproceduren i vores tidligere undersøgelse. Derudover havde mængderne af hovedmetabolitter af ekstraktet, dvs. rutin og rosmarinsyre, en tendens til at falde [13]. I modsætning hertil har flere undersøgelser rapporteret modstridende resultater. I undersøgelsen af ​​Celeb et al. [34] observerede de stigningen i den totale mængde phenolsyre, flavonoid og phenol i de biotilgængelige prøver af methanolekstrakt fra Hypericum perfoliatum L. Faktisk havde hovedmetabolitterne, quercitrin, chlorogensyre og gallussyre, biotilgængelighedsforhold over 100 procent. Disse undersøgelser viste, at virkningerne af fordøjelsesproceduren kan variere alt efter plantemateriale. For at afklare disse forskelle er det vigtigt at overveje virkningsmekanismen for fordøjelsessystemet på phenoliske stoffer. (fordele ved bioflavonoider) Serra et al.[35] foreslået, at phenoliske forbindelser hovedsageligt findes i glycosider, polymerer og esterformer i plantematrixen og hydrolyseres i fordøjelsessystemet før absorption. Forskellige faktorer kan påvirke de strukturelle transformationer af phenolforbindelserne i mave-tarmkanalen. For eksempel skal forbindelser med højere molekylvægte, såsom proanthocyanidiner eller procyanidiner, hydrolyseres før absorption i tarmen. Strukturen af ​​plantematrixen er også en fremtrædende faktor i biotilgængeligheden af ​​phenoler; (køb cistanche)phenoliske forbindelser kan binde til makromolekyler i plantematrixen, såsom fibre, proteiner og lipidmolekyler. Således kan kun de frigjorte phenoliske komponenter fra matrixen blive absorberbare fra mave-tarmkanalen. Desuden er forskellige pH-værdier og enzymatiske virkninger af tarmmikrobiotaen blandt de andre afgørende faktorer, der påvirker transformationen i den kemiske struktur af phenoliske forbindelser [36]. I lyset af disse data kan vi antage, at forskellige resultater opnået fra lignende typer eksperimentelle undersøgelser kan skyldes kompleksiteten af ​​fordøjelsessystemet og sammensætningen af ​​plantematricen. Som vist i tabel 3 udviste de biotilgængelige prøver af Cistus-ekstrakter en svagere antioxidantaktivitet end de ikke-fordøjede og post-gastriske modstykker på grund af deres lavere phenolindhold.

Cistanchekanforbedre immuniteten

Desuden udviste begge ekstrakter af C.saluifolius bedre antioxidantaktivitet i DPPH-, CUPRAC-, FRAP- og TOAC-assays sammenlignet med andre arter. Desuden viste begge ekstrakter af C. paroifforus højere DMPD-radikalopfangende aktivitet end ekstrakterne af andre arter. Som angivet i tabel 1 var det totale indhold af phenoler, flavonoider og phenolsyre i C. salviifolius højere end i de andre prøver. Således kan det højere antioxidantpotentiale i C. salviifolius-ekstrakterne være relateret til dets phenolindhold.

Desuden kan reduktionen i antioxidantpotentialer, hæmmende aktiviteter på kulhydratrelaterede enzymer og AGE'er af de biotilgængelige prøver være relateret til faldet i markørflavonoidglykosider. Cistus-ekstrakter indeholdt dog også andre phenoliske stoffer, som angivet i figur 1. Derfor kræves en detaljeret kromatografisk analyse af ekstrakterne for at overvåge fordøjelsens indflydelse på biologisk aktivitet.

Det hæmmende potentiale af planteekstrakter på fordøjelsesenzymer har for nylig tiltrukket sig mere opmærksomhed på grund af sikkerhedsbekymringerne ved syntetiske inhibitorer. Derfor blev den hæmmende effekt af planteekstrakter bestemt i flere undersøgelser, og denne effekt var generelt forbundet med phenoliske stoffer såsom flavonoider, phenolsyrer, proanthocyanidiner osv. Sun et al. [37] foreslog, at polyphenoliske forbindelser udviser deres hæmmende virkninger ved at binde sig til enzymerne nævnt ovenfor ved hjælp af hydrofobe kræfter og ikke-kovalente bindinger. Derfor er inhibering af o-amylase og a-glucosidase enzymaktivitet af polyphenoler relateret til deres molekylære strukturer. Mens denne interaktionsmekanisme er blevet undersøgt ved hjælp af forskellige teknikker såsom hæmningskinetik, molekylær docking, fluorescensdæmpning osv., er der endnu ikke opnået nogen sikker konklusion [38]. Imidlertid har talrige undersøgelser rapporteret, at fordøjelsesenzyminhiberinger af planteekstrakterne er direkte relateret til deres phenolindhold. Lignende undersøgelser af Cistus-arters enzymhæmmende aktiviteter er også tidligere blevet rapporteret. Sayah et al. [39] undersøgte de -amylase- og -glucosidase-hæmmende aktiviteter af de 8{{10}} procent methanoliske og vandige ekstrakter fra C. monspeliensis og C. saluifolius. Deres resultater var i overensstemmelse med nærværende undersøgelse, der afslørede, at C. salvifolius vandig ekstrakt viste højere o-glucosidase (ICso ug/mL:0.95±0.14) og -amylase(IC5{ {55}} ug/mL:217,1±0,15) hæmmende aktivitet end det vandige C. monspeliensis-ekstrakt (IC50 ug/mL∶ 14,58±1,26) og henholdsvis (IC50 4g/mL:886,10±0,10), De hæmmende hastigheder af begge vandige ekstrakter på disse enzymer var højere end referenceforbindelsen acarbose (ICso ug/mL:18,01±2.00) Ligesom vores undersøgelse fandt de en korrelation med de enzymhæmmende hastigheder og den samlede mængde phenol- og flavonoidmængder. Både det totale phenoliske og det totale flavonoidindhold i det vandige C. saloijfolius-ekstrakt (henholdsvis 408,43±1,09mg GAE og 140.00±1,15 RE) var højere end det vandige C.monspeliensis-ekstrakt (261,76±1,9mg GAE og 78.00±1,15 RE henholdsvis). Orhan et al. [40] undersøgte også fordøjelsesenzymets hæmmende potentialer af 80 procent vandige og ethanoliske ekstrakter fra bladene af C.laurifolius. Ifølge deres resultater udviste 80 procent ethanolekstrakt (71,7 procent ±0,6) en stærk-amylasehæmmende aktivitet sammenlignet med vandig ekstrakt (39,3 procent ±2,2) ved en koncentration på 1 mg/ml. De foreslog, at phenoliske forbindelser, især flavonoider, direkte påvirker insulinsekretion ved at forhindre beta-celle-apoptose og understøtte anti-diabetisk aktivitet. Denne hypotese, korreleret med vores resultater, markerer, at ND-prøve af vandige ekstrakter af C. salviifolius udøvede det højeste totale flavonoid- og phenolindhold og de største -amylase- og o-glucosidase-hæmmende aktiviteter. Som angivet i tabel 4 udviste det vandige ekstrakt af C. salviifolius bedre inhiberende aktiviteter på fordøjelsesenzymer end de andre ekstrakter. Derudover indeholdt IN-prøver af de vandige ekstrakter lavere phenol- og flavonoidmængder end ND-prøver og afslørede således lavere enzyminhiberende aktiviteter i det foreliggende arbejde. Mens phenolindholdet i ekstrakterne blev negativt påvirket af fordøjelsesproceduren, udviste de stadig betydelig fordøjelsesenzyminhiberende aktivitet. I flere undersøgelser blev flavonoidglycosider rapporteret som de vigtigste metabolitter af planteekstrakter med stærke -amylase- og -glucosidase-hæmmende potentialer[41-43]Mens den hæmmende mekanisme af phenoliske forbindelser på fordøjelsesenzymer endnu ikke er blevet afsløret, struktur- aktivitetsforholdsundersøgelser er blevet udført på nogle phenoliske komponenter såsom flavonoider, phenolsyrer, proanthocyanidiner og tanniner. Undersøgelser af struktur-aktivitetsforhold om flavonoider viste, at C2=C3-dobbeltbindingen i C-ringen øger fordøjelsesenzyminhiberingspotentialet af sådanne forbindelser. Da denne binding hæver elektrontætheden, øges styrken af ​​interaktionen mellem flavonoidet og enzymet [44]. Derudover letter hydroxylgrupper på C-5 og C-7 det -amylasehæmmende potentiale af flavonoider. Det blev også foreslået, at hydroxylering af flavonoiders skelet positivt påvirker deres a-amylase- og -glucosidase-enzymhæmmende potentialer[45]. Som angivet tidligere var alle markørflavonoider i den foreliggende undersøgelse flavonolglycosider, der bærer disse strukturelle krav beskrevet ovenfor. Efter in vitro-fordøjelsesproceduren faldt deres relaterede aktiviteter imidlertid signifikant i biotilgængelige prøver af de vandige ekstrakter.

Generelt er det hæmmende potentiale af planteekstrakterne på AGE'er relateret til flere faktorer, dvs. deres phenolindhold, antioxidantpotentialer, metalchelaterende evner, proteininteraktioner og AGE-receptorblokerende aktiviteter [13]. Som vist i tabel 4 udviste biotilgængelige prøver af de vandige ekstrakter lavere AGE-inhiberende aktiviteter sammenlignet med ND-prøver, eftersom in vitro-fordøjelsesproceduren påvirkede phenolindholdet i ekstrakterne negativt. Ifølge de aktuelle undersøgelsesresultater er ND-prøven af ​​vandigt ekstrakt af C. (cistanche og tongkat ali reddit) saluifolius havde den højeste AGE-hæmmende aktivitet såvel som det totale indhold af phenol- og flavonoider. Til sammenligning viste IN-prøve af vandigt ekstrakt af C. monspeliensis det svageste AGE-hæmningspotentiale, hvilket kan tilskrives dets laveste totale flavonoid- og phenolindhold. Da flavonoider har en udbredt udbredelse i planteekstrakter, frugter, grøntsager og drikkevarer, er flere undersøgelser blevet intensiveret af flavonoiders hæmningspotentiale på AGE-formationer. De samme flavonoider, der er tildelt som markør-phenolerne i denne undersøgelse, blev også rapporteret som markørforbindelser i andre undersøgelser[46-48].

I lighed med hæmning af fordøjelsesenzymer blev AGE-hæmmende aktiviteter af flavonoider stimuleret af C2=C3-dobbeltbindingen og hydroxylering af A- og C-ringe. Sukkerbinding til flavonoidskelettet fører imidlertid til nedsat hæmmende aktivitet [49]. På den anden side, Cervantes-Lauren et al.[50] antydede, at flavon-3-af glykosider havde et større AGE-hæmningspotentiale end de andre flavonoidglykosider. Denne hypotese kan være en forklaring på den nedsatte AGE-hæmning i biotilgængelige prøver. For eksempel blev quercitrin og hyperosid ikke påvist i biotilgængelige prøver af det vandige ekstrakt af C. monspeliensis, hvilket er årsagen til den lavere aktivitet af IN-prøver af C. monspeliensis sammenlignet med ekstrakterne fra andre arter. Selvom quercitrin ikke blev påvist i det vandige ekstrakt af C. saloifolius, kan signifikant højere mængder af hyperosid og salidrosid være årsagen til dets høje AGE-hæmmende aktivitet. Generelt blev der observeret en positiv korrelation mellem markørflavonoidindholdet i prøverne og deres inhiberende potentialer på AGE'er.

4. Materiale og metoder

4.1.Kemikalier

Alle referencer, enzymer og kemikalier anvendt i eksperimenterne blev købt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Materialer af analytisk kvalitet blev brugt i eksperimenterne.

4.2.Planteprøver

Luftdele af C.creticus og C.saloifolius blev samlet fra campus ved Yeditepe University (Kayisdagi, Istanbul) i løbet af den sidste uge af april 2018. Luftdele af C.mon-speliensis og C. paroiflorus blev samlet fra nær Alacant Kutlu Aktas Balaji, Cesme, Izmir i den anden uge af maj 2018. Luftdele af C. laurifolius blev indsamlet fra Kemer-Doganhisar-vejen, Konya, i den første uge af juni 2018. Prof. Dr. Erdem Yesilada godkendte plantematerialer. Kuponprøver for C. creticus (YEF18013), C. Lauri folium(YEF18017), C.monspeliensis(YEF18015), C.paroiflorus(YEF18016) og C.salvifolius (YEF18014) blev opbevaret på Herbariet på Farmakognosisk Institut of Pharmacy, Yeditepe University, Istanbul, Tyrkiet. 4.3.Udtrækningsprocedure

Vandig ekstraktion blev valgt, da det er almindeligt anvendt som en forberedelsesteknik i traditionel medicin. De groft lufttørrede og pulveriserede luftdele af Cistus-arter (100 g) blev ekstraheret med varmt destilleret vand (80 grader ,1,5 L) ved at bruge en rysteanordning i 15 min. Derefter blev vandige ekstrakter filtreret gennem et filterpapir og inddampet til tørhed under reduceret tryk. Efter at lyofiliseringsproceduren var afsluttet, blev ekstrakter opløst i destilleret vand til yderligere behandling (ikke-fordøjet prøve: ND) (udbyttet af ekstrakter: 13,04 procent for C.creticus, 15,7 procent for C.laurifolus, 12,8 procent for C.monspeliensis ,14,94 procent for C.parviflorus, 14,74 procent for C.salvifolius). 4.4. In vitro human fordøjelsessimuleringsmetode

Den menneskelige fordøjelsessimuleringsmodel blev anvendt på Cistus-prøver in vitro efter metoden beskrevet tidligere af Celeb et al.[34]. Først blev 1 g NaCl og 1,6 g pepsin opløst i 500 ml destilleret vand for at opnå en simuleret mavevæskeopløsning (SGF) Senere blev pH-værdien af ​​SGF-opløsningen arrangeret til 2 med HCl (5 M); 17,5 ml af denne opløsning blev blandet med 2,5 ml planteprøver, og denne blanding blev placeret i det rystende vandbad ved 37 grader i 2 timer for at efterligne de peristaltiske bevægelser af fordøjelsessystemet. Efter 2 timer blev prøverne sat i et isbad for at inaktivere de enzymatiske reaktioner; 2 ml af prøverne blev sat til side som en "post-gastrisk" (PG) prøve til yderligere eksperimenter. En cellulosedialysemembran fyldt med en passende mængde NaHC03 (1 M, pH7) var placeret i de kolde prøveopløsninger; således blev gastrointestinal absorption efterlignet. Derefter blev 4,5 ml galdesyre/pancreatin-opløsning kombineret med opløsningerne, og blandingen blev inkuberet i yderligere 2 timer ved 37 grader. Til sidst blev væsken inde i dialysemembranen erhvervet som den "biotilgængelige" prøve (IN). Efter proceduren var overstået, blev alle prøver bevaret ved -20 grad til yderligere eksperimenter. 4.5. In vitro estimering af phenolprofil 4.5.1. Assay for totalt phenolindhold Spektrofotometrisk bestemmelse af det totale phenolindhold i prøverne blev udført i en 96-brøndpladeskabelon ifølge metoden beskrevet tidligere af Barak et al.【32】;75 uL NagCO3 (20 procent i H2O) ） blev tilsat til 20 μL frisklavet prøve- og referenceopløsning. Derefter blev 100 μL Folin-Ciocalteu-reagens kombineret med blandingen. Efter en 30 minutters inkubationsperiode ved stuetemperatur i mørke blev absorbansen målt ved 690 nm. Gallussyre blev brugt som referenceopløsning i forskellige koncentrationer for at etablere en kalibreringskurve, og det totale phenolindhold blev udtrykt som gallussyreækvivalenter (GAE). 4.5.2. Total flavonoidindholdsanalyse Spektrofotometrisk bestemmelse af det samlede flavonoidindhold i prøverne blev styret i en 96-brøndpladeskabelon i overensstemmelse med den tidligere forklarede metode af Bardakci et al. 【51】; 150 μL 75 procent ethanol, 10 μL aluminiumchlorid og 10 μL 1 M natriumacetattrihydrat blev kombineret med 50 μL prøve- og referenceopløsninger separat. Derefter blev disse blandinger inkuberet ved mørkerumstemperatur i 30 minutter. Efter inkubationsperioden blev absorbansen beregnet ved 405 nm. Quercetin blev anvendt som referenceopløsning i forskellige koncentrationer for at etablere en kalibreringskurve, og det samlede flavonoidindhold blev repræsenteret som quercetin-ækvivalenter (QE).

4.5.3. Assay for totalt phenolsyreindhold

Det totale phenolsyreindhold i prøverne blev målt spektrofotometrisk ved at følge proceduren rapporteret tidligere af Barak et al. [52]. For det første blev passende mængder natriumnitrit og natriummolybdat opløst i destilleret vand for at opnå Arnow-reagenset. Derefter blev 1 ml af prøverne kombineret med 1 ml Arnow-reagens, 1 ml 0.1 M HCl og 1 ml 1 M NaOH separat. Derefter blev volumenet af blandingen justeret til 10 ml med destilleret vand, og absorbansen blev aflæst straks ved 490 nm. Koffeinsyre blev anvendt som referenceopløsning i forskellige koncentrationer for at få en kalibreringskurve, og det samlede phenolsyreindhold blev angivet som koffeinsyreækvivalenter (CAE).

4.5.4. Assay for totalt proanthocyanidinindhold

Spektrofotometrisk bestemmelse af det totale proanthocyanidinindhold i prøverne blev udført i en 96-brøndpladeskabelon ved at følge metoden ifølge Barak et al. [11]. Kort fortalt blev 25 µl af prøveopløsningerne blandet med henholdsvis 150 µl 4 procent vanillin og 75 µl HCl-opløsninger (32 procent). Efter 15 minutters inkubationstid ved mørkerumstemperatur blev absorbansen justeret til 492 nm. Catechinhydrat blev brugt som referenceopløsning i forskellige koncentrationer for at opnå en kalibreringskurve. Methanol blev anvendt som en kontrolopløsning. Det totale indhold af proanthocyanidin i prøverne blev angivet som catechin-ækvivalenter (CE).

4.6.Free Radical Scavenging Activity Assays 4.6.1.DPPH Radical Scavenging Activity Assay

DPPH-radikalopfangende aktivitet af prøverne blev bestemt i en 96-brøndpladeskabelon efter metoden modificeret af Celeb et al.[53]. Først blev 150 uM DPPH-opløsning frisk fremstillet. Derefter blev 200 μL DPPH-opløsning blandet med 25 μL prøveopløsninger. Derefter blev denne blanding inkuberet ved mørkerumstemperatur i 50 minutter. Absorbansen blev beregnet ved 540 nm. Butyleret hydroxytoluen (BHT) blev anvendt som referenceopløsning i forskellige koncentrationer. Methanol blev anvendt som kontrolopløsning. Aktiviteten af ​​prøver blev præsenteret som EC50, svarende til, at koncentrationen viste 50 procent aktivitet.

4.6.2.DMPD Radical Scavenging Activity Assay

DMPD* (N,N-dimethyl-p-phenylendiamin) radikalopfangende aktivitet af prøverne blev udført i en 96-brøndpladeskabelon ifølge metoden beskrevet tidligere af Inan et al. [13]. For det første 10{{10}} mM DMPD plus opløsning, 0,05 M FeCl; 6H2O-opløsning og 0,01 M acetatbuffer blev frisk fremstillet. Derefter blev 1 mL DMPD-opløsning, 100 mL acetatbuffer og 0,2 mL FeCl3-6 H2O-opløsning blandet, og senere blev 15 uLof prøveopløsninger kombineret med 210 μL af denne blanding. Efter inkubationsperioden ved mørk stuetemperatur i 50 minutter blev absorbansen målt ved 492 nm. Trolox blev brugt som referenceopløsning i forskellige koncentrationer for at opnå en kalibreringskurve. Koncentrationer af prøveopløsningerne var 1 mg/ml. DMPD-radikalopfangende aktiviteter for prøverne blev angivet som Trolox-ækvivalenter (TE). 4.7. Metalreducerende aktivitetsassays

4.7.1. Ferric Reducing Antioxidant Power Assay (FRAP)

Bestemmelse af FRAP-aktivitet af prøverne blev udført i en 96-brønds-skabelon efter proceduren rapporteret tidligere af Bardakci et al.[54]. I begyndelsen af ​​eksperimentet blev FRAP-reagenset dannet ved at blande acetatbuffer, ferri-tripyridyltriazin og FeCl;6H2O-opløsninger. Derefter blev FRAP-reagenset anbragt i ovnen på 37 grader i 30 min. Derefter blev 10 µl af prøveopløsningerne kombineret med henholdsvis 30 µl destilleret vand og 260 µl FRAP-reagens. Efter inkubationstid ved 37 grader i 30 minutter blev absorbansen justeret til 593 nm. En standardkurve blev bygget ved at anvende forskellige molariteter af jern(II)sulfat (0,25-2 mM) opløsning til at evaluere resultaterne. BHT blev brugt som referenceopløsning i forskellige koncentrationer. FRAP-aktiviteter af prøverne blev præsenteret som mM FeSO4 i 1 g tørekstrakt.

4.7.2.Cupric Reducing Antioxidant Capacity Assay (CUPRAC)

CUPRAC-aktiviteten af ​​prøverne blev bestemt i en 96-brøndpladeskabelon efter metoden modificeret af Celeb et al. 【31】; 85 μL CuSO4 （10 mM）, neocuprain- og ammoniumacetatopløsninger og 51 µl destilleret vand blev tilsat til 43 µl prøveopløsninger separat. Efter en inkubationsperiode (20 min) ved 50 grader i et vandbad blev absorbansen målt ved 450 nm. Ascorbinsyre blev brugt som referenceopløsning i forskellige koncentrationer for at opnå en kalibreringskurve. Prøvernes CUPRAC-aktiviteter blev præsenteret som ascorbinsyreækvivalenter (AAE). 4.8. Total Antioxidant Activity Assay (TOAC)

Bestemmelse af total antioxidantaktivitet af prøverne blev udført i en 96-brøndpladeskabelon efter proceduren af ​​Celeb et al. [55]. Først blev en vis mængde monobasisk natriumphosphat, ammoniummolybdattetrahydrat og svovlsyre blandet for at opnå TOAC-opløsningen. Derefter blev 300 μL TOAC-opløsning tilsat til 30 μL prøveopløsninger. Efter inkubationsperioden ved 95 grader i et vandbad i 90 minutter blev absorbansen bestemt ved 690 nm. Ascorbinsyre blev brugt som referenceopløsning i forskellige koncentrationer for at opnå en kalibreringskurve. TOAC-aktiviteter af prøverne blev repræsenteret som ascorbinsyreækvivalenter (AAE). 4.9. Estimation af biotilgængelighedsindeks

Biotilgængelighedsindekset (BAvI) blev beregnet i henhold til den teoretiske ligning beskrevet af Inan et al.[13]:

BAVI=CIN/CND "Biotilgængelighedsindekset"(BAvI) blev beskrevet som forholdet mellem antallet af phenoler i den biotilgængelige prøve (IN) og antallet af phenoler i den ikke-fordøjede prøve (ND). 4.10. Kvantificering af markørflavonoider ved HPTLC

Den kvantitative bestemmelse af salidrosid-, hyperosid- og quercitrinkoncentrationer i alle simuleringsprøver (ND, PG, IN) af de vandige ekstrakter fra Cistus-arter blev udført ved højtydende tyndtlagskromatografi (HPILC) (CAMAG, Muttenz, Schweiz) efter metoden valideret af Guzelmeric et al. [16]. Hyperosid, salidrosid og quercitrin blev fremstillet i koncentrationer på 25,50 og 10{{30}} ug/mL, og koncentrationerne af frisklavede prøveopløsninger blev justeret til 10 mg/ml. Disse opløsninger blev påført på normalfase silicagelplader med glasbagside (20 cm × 10 cm, Merck, Darmstadt, Tyskland) med visse volumener (1-5 μL standardopløsninger og 5 μL prøveopløsninger) ved at bruge 100 μL sprøjter （ Hamilton, Bonaduz, Schweiz）. Påføringsproceduren blev udført med Linomat 5 prøveapplikator. Udviklingsprocessen blev udført i Automated Development Chamber (ADC 2) og ethylacetat: dichlormethan. eddikesyre. myresyre: vand (10:25:10) :10:10:10me) blev valgt som en mobil fase. Derefter blev pladerne derivatiseret med Natural Product Reagent (NPR) (1g diphenylboric acid 2-aminoethylester i 200mL ethylacetat) i nedsænkningsanordningen (CAMAG) Mens hyperosid og quercitrin blev analyseret spektrofotometrisk ved 260 nm, blev mængden af ​​salidrosid målt ved 330 nm ved hjælp af en UV-scanner. Rf-værdier af standarderne blev bestemt som hyperosid (≈0.35), quercitrin≈iro5（c）, til45（c）. 0,65). Korrelationskoefficienterne (r²) viste sig at være ×0,98 for kvantificeringen af ​​markørflavonoiderne.

4.11. Inhiberende aktivitet på diabetes-relaterede enzymer 4.11.1. -Glucosidasehæmmende aktivitet

-glucosidase-inhiberende aktiviteter af de ikke-fordøjede og biotilgængelige prøver opnået fra de vandige ekstrakter af Cistus-arter blev undersøgt ved at følge metoden forklaret tidligere af Balan et al. [56]. For det første blev passende mængder af mononatriumphosphat og dinatriumphosphat blandet med fremskaffelse af 100 mM fosfatbuffer (pH7). ac glucosidase-enzym blev opløst i fosfatbuffer for at opnå -glucosidase-opløsningen (0.2U/mL). Derefter blev 17 0 µL phosphatbuffer, 20 µL af -glucosidase-opløsningen og 20 µl prøveopløsninger kombineret og inkuberet i en 37 graders ovn i 15 min. Derefter blev 20 µl 2,5 mM p-nitrophenyl- -D-glucopyranosidopløsning i 100 mM kaliumphosphatbuffer (pH 7,0) tilsat til blandingen, og en anden inkubationsperiode blev udført ved 37 grader i 15 minutter. Derefter blev 80 μL 0,2 M natriumcarbonatopløsning tilsat blandingen for at afslutte reaktionen. Absorbans blev målt ved 405 nm. Quercetinopløsning i forskellige koncentrationer blev brugt som reference. Resultaterne blev estimeret som procentdelen af ​​inhiberende aktivitet i 1 mg/ml og 0,5 mg/ml koncentrationer af ND- og IN-prøver af de vandige ekstrakter af Cistus-arter.

4.11.2. - Amylasehæmmende aktivitet

-amylase-hæmmende aktivitet af ikke-fordøjede og biotilgængelige prøver opnået fra de vandige ekstrakter af Cistus-arter blev bestemt ved at følge proceduren beskrevet tidligere af Balan et al.[56]. Spektrofotometrisk bestemmelse af a-amylaseinhiberende aktiviteter af prøverne blev udført ved at anvende DNS (3,5-dinitrosalicylsyre)-reagens. Som det fremgår af metoden, dannes maltose ved omdannelsen af ​​stivelsen, og den gule farve af alkalisk DNS omdannes til den orange-røde farve på grund af maltose fremstillet af stivelse. Således blev 96 mM DNS-opløsning fremstillet ud fra blandingen af ​​natriumkaliumtartratopløsning (opløst i 2 M NaOH) og en vis mængde DNS (opløst i destilleret vand). Derefter blev 20mM natriumphosphatbuffer med 6,7 mM NaCl (co-faktor af a-amylaseenzym) fremstillet ved 20 grader (pH:6,9). a-amylase-enzymet (1U/mL) og stivelse (10 mg/ml) blev opløst i denne buffer. Derefter blev 50 μL natriumphosphatbuffer og 10 μL a-amylase-enzymopløsning blandet med 20 μL af prøveopløsningerne. Denne blanding blev inkuberet ved 37 grader i 45 minutter. Efter inkubationsperioden blev 20 μL af stivelsesopløsningen tilsat til blandingen. En anden inkubationsperiode blev startet ved 37 grader i 45 min. Den samme procedure blev anvendt på prøverne uden tilsætning af en o-amylase-enzymopløsning kaldet "prøvebaggrund". Kontrolgruppen blev undersøgt med samme procedure i fravær af prøveopløsninger. Absorbans blev målt ved 540 nm. Acarbose blev brugt som referenceopløsning ved forskellige koncentrationer. Resultaterne blev præsenteret som en procentdel af hæmmende aktivitet i 1 mg/ml og 0,5 mg/ml koncentrationer af ND- og IN-prøver fra vandige ekstrakter af Cistus-arter. 4.11.3.AGE-hæmmende aktivitet

AGE-inhiberende aktivitet af ikke-fordøjede og biotilgængelige prøver fra vandige ekstrakter af Cistus-arter blev bestemt ved at følge metoden beskrevet af Starow-icz et al. [57]. Før enhver proces blev koncentrationer af ND- og IN-prøver frisklavet på 1 mg/ml og 0,5 mg/ml. Derefter blev 1 mL 10 mg/mL koncentration af bovint serumalbumin (BSA)-opløsning tilsat til 1 mL ND- og IN-prøveopløsninger. Kontrolprøver blev fremstillet uden tilsætning af ND- og IN-prøveopløsninger, og blindprøverne blev fremstillet uden tilsætning af 0,5 M glucose. Derefter blev alle forberedte prøver inkuberet i 40 timer i et rystevandbad ved 55 grader. Efter endt inkubationsperiode blev Thermo ScientificTM VarioskanTMLUX multimode mikropladelæser brugt i 370 nm excitations/440 nm emissionsområdet til at beregne fluorescensintensitet. Quercetin blev brugt som referenceopløsning i forskellige koncentrationer.

5. Konklusioner

I denne undersøgelse blev de vandige ekstrakter af alle Cistus-arter registreret i tyrkisk flora undersøgt for deres phenoliske profiler og in vitro antioxidant- og antidiabetiske potentialer. Da afkog eller infusion er den almindelige form i traditionel medicin, er det særligt vigtigt at bruge vandige ekstrakter til aktivitetsvurderingen i eksperimentelle undersøgelser. På den anden side udsættes hydrofile bestanddele i det vandige ekstrakt for en række metaboliske transformationer i mave-tarmsystemet, når de først er indtaget. For korrekt aktivitetsevaluering af traditionelle formuleringer bør aktiviteterne af de biotilgængelige metabolitter derfor også undersøges.

Dette er den første undersøgelse, der undersøger konsekvenserne af in vitro-metoden til menneskelig fordøjelsessimulering på tyrkiske Cistus-arter. Derudover blev hæmningspotentialet af tyrkiske Cistus-arter på AGE'er undersøgt i denne undersøgelse for første gang. Endvidere blev salidrosid, hyperosid og quercitrin tildelt markørflavonoider, og ændringer i deres koncentrationer blev overvåget i in vitro-fordøjelsesproceduren. Mens phenolindholdet og antidiabetiske og antioxidante aktiviteter i ekstrakterne blev negativt påvirket af gastrointestinale fordøjelsesprocedurer, udviste de stadig betydelig bioaktivitet. Ifølge resultaterne blev C. salviifolius-ekstrakt påvist som den mest potente plante med hensyn til phenolindhold og antioxidant- og antidiabetiske aktiviteter. Afslutningsvis har luftdele fra tyrkiske Cistus-arter et rigt phenolindhold og potentielle antioxidant- og antidiabetiske aktiviteter. Mens in vitro-fordøjelsessimuleringsmetoden blev brugt til at evaluere biotilgængelighed, efterligner den muligvis ikke fuldt ud de metaboliske veje, der forekommer i organismen. Derfor kræves yderligere in vivo og kliniske undersøgelser for at vurdere biotilgængeligheden af ​​de phenoliske forbindelser og deres bidrag til de rapporterede farmakologiske virkninger i detaljer.

Forfatterbidrag:Konceptualisering, YI, EC, EY; metodologi, YI, SA, IK, EC formel analyse, YI, IK.-C., SA; undersøgelse, YI, IK.-C, SA; ressourcer, YI, IK.SA, EC og EY; datakuration, YI, IK-C., SA; skrivning - YI, skrivning - gennemgang og redigering, YI, EC, EY; visualisering, YI; supervision, ECog EYAlle forfattere har læst og accepteret den offentliggjorte version af manuskriptet.

Finansiering:Denne forskning modtog ingen ekstern finansiering. Udtalelse fra institutionelle bedømmelsesudvalg: Ikke relevant. Erklæring om informeret samtykke: Ikke relevant.

Erklæring om datatilgængelighed:Dataene præsenteret i denne undersøgelse er tilgængelige på anmodning fra den tilsvarende forfatter.

Interessekonflikt:Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Eksempel tilgængelighed:Prøver af forbindelserne er ikke tilgængelige fra forfatterne.

Denne artikel er uddraget fra Molecules 2021, 26, 5322. https://doi.org/10.3390/molecules26175322 https://www.mdpi.com/journal/molecules