In vitro-evaluering af P-gp-medierede lægemiddel-lægemiddelinteraktioner ved hjælp af RPTEC/TERT1 human nyrecellemodel

edmund.chen@wecistanche.com

Introduktion In vitro-evaluering af P-glycoprotein (P-gp)-hæmningspotentialet er et vigtigt spørgsmål under lægemiddeludviklingsprocessen, da det tillader forudsigelse af klinisk relevante lægemiddel-lægemiddelinteraktioner (DDI'er) [1-3]. P-gp tilhører den ATP-bindende kassette (ABC) transporter-superfamilie og er kodet af multilægemiddelresistensgenet MDR1 (også kendt som ABCB1). Denne membrantransportør er kendt for at blive overudtrykt i tumorceller og forårsage resistens over for mange kræftlægemidler [4]. Placeret inden for alle fysiologiske barrierer, inklusive tarm, lever ognyrer, P-gp beskytter mod xenobiotika ved at begrænse absorptionen af ​​disse substrater fra fordøjelseskanalen og lette deres efux ind i galden og urinen. Således spiller P-gp en bemærkelsesværdig rolle i farmakokinetikken af ​​forskellige terapeutiske klasser [5-7]. Et væld af lægemidler såsom anticancermidler, svampedræbende midler og kardiovaskulære lægemidler er kendt for at være P-gp-substrater og/eller hæmmere, og mange af dem er involveret i klinisk relevante interaktioner [8-10]. Derfor giver US Food and Drug Administration (FDA) mandat, at P-gp-hæmmende potentiale skal evalueres i de tidlige stadier af lægemiddeludvikling. In vitro-assays udført til dette formål er almindeligvis baseret på lægemiddeltransportundersøgelser under anvendelse af P-gp-udtrykkende cellelinjer. Mere præcist anbefaler FDA-retningslinjerne bestemmelse af in vitro-værdierne for halvmaksimal inhiberende koncentration (IC50) for at vurdere risikoen for kliniske DDI'er som følge af P-gp-hæmning. Til dette formål er der blevet udført mange eksperimentelle assays, og de fleste af dem har fokuseret på lægemiddelinteraktioner relateret til intestinal absorption ved hjælp af Caco-2- eller MDCK-MDR1-modellerne [11-13]

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYRESYGDOMME

Sidennyreelimination er også en almindelig eliminationsvej for forskellige klasser af lægemidler, aktiv tubulær sekretion via ABC-transportører kan også spille en nøglerolle i disse interaktioner [14]. Dog in vitro data vedrnyreDDI'er medieret af P-gp er begrænsede. Dette skyldes til dels manglende udvikling og karakterisering af in vitro-modeller til forudsigelse afnyrenarkotikatransport. Blandt forskellige humane cellelinjer ser RPTEC/TERT1-modellen ud til at vise lovende for evalueringen afnyrelægemiddelinteraktioner. Denne cellelinje er afledt af en sund human donor og er blevet genereret fra udødeliggjorte proksimale tubuliceller. Desuden er udtrykket og funktionaliteten af ​​P-gp blevet demonstreret ved hjælp af denne model, hvilket bekræfter dens evne til at forudsigenyreudstrømning af lægemidler [15, 16]. I denne sammenhæng blev denne undersøgelse designet til at undersøge P-gp-hæmmende potentiale ved hjælp af RPTEC/TERT1-modellen. Først blev et rhodamin 123 (R123) akkumuleringsscreeningsassay udført for at opnå en inhiberingsprofil for hvert testet lægemiddel. Baseret på denne screening blev fire lægemidler derefter udvalgt til vurdering af deres koncentrationsafhængige effekter på den intracellulære akkumulering af to P-gp-substratlægemidler: apixaban og rivaroxaban

Nøgleord:nyrecelle, nyremodel, nyrelægemiddel, renal elimination, nyrer.

Materialer og metoder

ReagenserApixaban, [2H71 3C] - api xa ban, ri va r oxa ban,[13C6]-rivaroxaban, nilotinib, crizotinib, erlotinib, axitinib, idelalisib, warfarin og dabigatran etexilat blev købt fra Alsachim (Illkirch, Illkirch) Frankrig). Verapamil, ketoconazol, simvastatin, amiodaron, rhodamin 123, Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) og HEPES-opløsning blev købt fra Sigma-Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, Frankrig).

Cellekultur  RPTEC/TERT1-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Molsheim, Frankrig) og dyrket i hormonbeskyttet, serumfrit medium bestående af Dulbecco's Modifed Eagle's Medium F12 (ATCC) suppleret med et vækstfaktorkit (ATCC) og en 1 procent antibiotika/antimykotisk blanding (penicillin-streptomycin, amphotericin B) ved 37 grader og 5 procent CO 2. For alle eksperimenterne blev celler podet i 96-brøndsplader med en tæthed på 50,000 celler pr. brønd og blev brugt til at vokse efter 14 dages dyrkning. Mediet blev fornyet hver anden dag, og celler blev brugt fra passage 27 til passage 34. Caco-2-celler blev også købt fra ATCC. Cellerne blev holdt i et dyrkningsmedium bestående af Eagle's Minimal Essential Medium (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) suppleret med 10 procent FBS, 1 procent ikke-essentielle aminosyrer og en 1 procent antibiotika/antimykotisk blanding (penicillin-streptomycin, amphotericin B) ) ved 37 grader og 5 procent CO2. Caco-2-celler blev podet i 96-brøndsplader med en tæthed på 5 × 10 3 celler pr. brønd og blev brugt til at vokse efter 14 dages dyrkning. Humane proksimale tubulære epitelceller (HPTEC'er) blev opnået fra BIOPREDIC (Rennes, Frankrig) og dyrket i DMEM/F12 suppleret med hydrocortison, EGF, insulin, transferrin og natriumselenit. Celler blev podet i 96-brønd collagencoatede kulturplader med en tæthed på 6600 celler pr. brønd og blev brugt til at vokse efter 11 dages dyrkning.

Rhodamine 123 akkumulationsscreeningsassay  P-gp-inhiberingspotentialet blev bestemt ved at måle den intracellulære akkumulering af rhodamin 123 i RPTEC/TERT1-celler i nærvær og fravær af forskellige klasser af lægemidler. Blandt de 14 testede lægemidler blev cyclosporin A (10 µM), ketoconazol (50 µM), verapamil (100 µM) og amiodaron (50 µM) anvendt som P-gp-hæmmere. Apixaban, rivaroxaban og dabigatran etexilat - tre direkte orale antikoagulantia (DOAC'er) - blev brugt som P-gp-substrater (10 µM). Warfarin (50 µM) blev brugt som en ikke-hæmmer, og fem anticancerlægemidler inklusive nilotinib, crizotinib, erlotinib og idelalisib blev brugt uden at kende deres inhiberingsprofiler i en koncentration på 10 µM. Adskillige tilstande blev reproduceret med Caco-2-cellerne, som er godkendt af FDA til lægemiddeltransportundersøgelser. På denne måde blev den intracellulære retention af rhodamin 123 bestemt i Caco-2-celler i nærvær og fravær af verapamil (100 µM), cyclosporin A (10 µM), nilotinib (10 µM) og DOAC'er (10 µM) ). Kort fortalt, efter 14 dages dyrkning i 96-brøndplader, blev cellerne præinkuberet i 10 minutter ved 37 grader med hvert lægemiddel opløst i HBSS med 10 mM HEPES (v/v). Derefter blev cellerne inkuberet med 10 µM rhodamin 123 i 45 minutter ved 37 grader. Til sidst, efter tre vaske i kold HBSS/HEPES-opløsning, blev cellerne lyseret ved stuetemperatur i 45 minutter i en opløsning af natriumdodecylsulfat (SDS) indeholdende 1 procent natriumborat. Mængden af ​​intracellulær rhodamin 123 blev kvantificeret ved anvendelse af et Infnite M nanospektrofuorometer (Life Sciences, TECAN, Schweiz), der indstillede bølgelængderne til 485/535 nm. Data blev udtrykt som procenter af rhodamin 123-akkumuleringen i kontrolceller, der ikke var udsat for nogen potentielle P-gp-inhibitorer og vilkårligt sat til 100 procent akkumulering.

DOAC Intracellulær akkumulationsanalyse og IC50-bestemmelse Fra det tidligere rhodamine 123-screeningsassay blev fire lægemidler valgt til at undersøge deres koncentrationsafhængige effekter på den intracellulære akkumulering af apixaban og rivaroxaban (10 µM) i RPTEC/TERT1-celler. Ketoconazol, crizotinib og nilotinib blev udvalgt som P-gp-hæmmere, og warfarin blev valgt som ikke-hæmmer. Cyclosporin A (10 µM) blev brugt som en bredspektret inhibitor af transportører. Undersøgelser af interaktionerne mellem DOAC'er og nilotinib til bestemmelse af IC50-værdier blev reproduceret i Caco-2-celler for at sammenligne de to cellulære modeller. Alle forbindelser blev fortyndet enten alene eller med den associerede inhibitor i HBSS transportbuffer suppleret med 1 procent HEPES (v/v) og 1 procent DMSO (v/v). Før inkubation blev alle opløsninger forvarmet til 37 grader, og pH blev justeret til 7,4. For anticancerlægemidlerne crizotinib og nilotinib varierede koncentrationerne på grund af deres ringe opløselighed og cytotoksiske potentiale fra 0,1 til 25 µM. For ketoconazol og warfarin varierede koncentrationerne fra 0,1 til 100 µM. Kort sagt, efter 14 dages dyrkning blev alle lægemidler opløst i HBSS med 1 procent HEPES (v/v) præ-inkuberet i 10 minutter ved 37 grader. Derefter blev celler inkuberet med 10 µM apixaban eller rivaroxaban i 60 minutter ved 37 grader. Til sidst, efter tre vaske i kold HBSS/HEPES-opløsning, blev celler lyseret ved stuetemperatur i 45 minutter i en 0,2 procent opløsning af Triton X-100. Mængden af ​​intracellulær DOAC blev derefter kvantificeret ved væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS). Data blev udtrykt som procentvise stigninger i DOAC-akkumulering, og DOAC intracellulære akkumulering blev vilkårligt sat til 100 procent i kontrolceller. IC50-værdierne for inhibering af P-gp-aktivitet, som svarer til halvmaksimal effektiv koncentration (EC50)-værdier for at øge DOAC-akkumulering, blev bestemt ud fra uvægtet ikke-lineær mindste kvadraters regressionsmodellering af øget akkumulering med 'nls()'-funktionen i R software i henhold til følgende ligning (ligning 1):

Væskekromatografi-massespektrometrianalyseKvantificering af apixaban (m/z 460.19793) og rivaroxaban (m/z 436.07285) blev udført ved hjælp af en Ultimate U300{{18 }} væskekromatografisystem (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) koblet med et Q-Exactive Plus massespektrometer (ThermoFisher, Bremen, Tyskland). LC-separationer blev opnået ved hjælp af en Hypersil Gold C18 (3 µm, 50 × 2,1 mm) analytisk kolonne (ThermoFisher Scientifc, Waltham, MA, USA) og en strømningshastighed på 0,6 ml/min. . Mobil fase A var vand med 0,1 procent myresyre (FA), og mobil fase B var acetonitril med 0,1 procent FA. For rivaroxaban var gradienten: 0–0.3 min, 10 procent B; 0,3-1 min, lineær fra 10 procent til 70 procent B; 1-1,5 min, 70 procent B; 1,51 min., tilbage til startbetingelser indtil 3 min. For apixaban var gradienten: 0-0,3 min, 10 procent B; 0,3-0,7 min., lineær fra 10 til 90 procent B; 0,7-1,5, 90 procent B; 1,51 min., tilbage til startbetingelser indtil 3 min. Detektion blev udført i elektrospray-positiv parallel reaktionsovervågning (PRM)-tilstand ved en opløsning på 35,000 (ved m/z 200). De interne standarder (IS'er) var [13C,2H7]-apixaban (m/z 468,2452) for apixaban og [13C6]-rivaroxaban (m/z 442,09297) for rivaroxaban. For hvert lægemiddel og dets respektive IS blev en målion (til kvantificering) og en bekræftende ion overvåget. For rivaroxaban og dets IS var målionen m/z 144,95125, og de bekræftende ioner var henholdsvis m/z 231,11280 og m/z 237,13298. For apixaban og dets IS var målionen m/z 199,08656, og de bekræftende ioner var henholdsvis m/z 282,12387 og m/z 241,06062.

Resultater

Rhodamine 123 akkumulationsscreeningsassayRhodamin 123-akkumuleringsscreeningsassayet blev udført i RPTEC/TERT1-celler med 14 lægemidler med forskellige inhiberingsprofiler (fig. 1). Som forventet var den intracellulære akkumulering af rhodamin 123 i nærværelse af cyclosporin A, en bredspektret hæmmer, blandt de højeste med en stigning i akkumulering på 75 procent sammenlignet med kontrolcellerne. Tilstedeværelsen af ​​verapamil, en specifik P-gp-hæmmer, førte til en stigning i akkumulering af rhodamin 123 på 57 procent, hvilket viser involveringen af ​​P-gp. På samme måde førte ketoconazol, beskrevet som en stærk P-gp-hæmmer, til en større stigning (66 procent) i den intracellulære akkumulering af rhodamin 123 sammenlignet med verapamil, hvilket bekræfter dets hæmningsprofil. Omvendt forårsagede tilføjelsen af ​​amiodaron, karakteriseret som en moderat P-gp-hæmmer, en stigning i akkumulering på 59 procent, hvilket svarer til den, der forårsages af verapamil. Forskellige hæmningsprofiler blev observeret for anticancermidlerne nilotinib, axitinib, crizotinib, erlotinib og idelalisib. Tilsætningen af ​​nilotinib forårsagede en kraftig stigning i akkumuleringen af ​​rhodamin 123 (71 procent), hvilket tyder på et betydeligt hæmmende potentiale, efterfulgt af axitinib, som forårsagede en stigning i retention på 57 procent. På den anden side udviste crizotinib og erlotinib moderate til lave hæmningspotentialer med stigninger i rhodamin 123-akkumulering på henholdsvis 23 procent og 16 procent. Idelalisib påvirkede ikke akkumuleringen af ​​rhodamin 123; det samme gjaldt warfarin, hvilket var

valgt som ikke-hæmmer. Blandt de tre DOAC'er forårsagede apixaban og rivaroxaban en lille stigning i retentionen af ​​rhodamin 123: henholdsvis 33 procent og 12 procent. Interessant nok forårsagede dabigatran etexilat, et prodrug af dabigatran og et kendt substrat for P-gp, en stigning i retentionen af ​​rhodamin 123 på omkring 50 procent, selvom det ikke er beskrevet som en potentiel P-gp-hæmmer. Endelig forårsagede tilsætningen af ​​simvastatin kun en lille stigning i akkumuleringen af ​​det fluorescerende substrat (32 procent). Baseret på denne screening blev fire lægemidler udvalgt til at vurdere deres koncentrationsafhængige effekter på den intracellulære akkumulering af apixaban og rivaroxaban inden for RPTEC/TERT1-modellen. Ketoconazol blev valgt som en positiv kontrolbetingelse for P-gp-hæmning, og warfarin blev valgt som en ikke-inhibitor af P-gp for den negative kontroltilstand. Nilotinib og crizotinib blev udvalgt som henholdsvis stærke og moderate P-gp-hæmmere. Adskillige forhold blev gengivet med referencemodellen, Caco-2. Den intracellulære akkumulering af R123 i celler blev bestemt efter kombination (eller ej) med apixaban og rivaroxaban (10 µM), nilotinib (10 µM) og med cyclosporin A (10 µM) og verapamil (100 µM) for kontrolbetingelserne for inhibering (Fig. 2A). Som forventet forårsagede verapamil og cyclosporin A høje stigninger i R123-retention på henholdsvis 297 procent og 275 procent. På samme måde forårsagede nilotinib en høj stigning i den intracellulære akkumulering af R123 (229 procent), hvilket bekræftede dets hæmmende potentiale. Kombination af R123 med DOAC'er resulterede i mindre stigninger i akkumuleringen af ​​R123 (40-44 procent) sammenlignet med de andre lægemidler. Desuden er den intracellulære akkumulering af rhodamin 123 i fravær og tilstedeværelse af cyclosporin A inyreprimære humane celler blev også undersøgt i denne undersøgelse for at kontrollere pålideligheden af ​​resultaterne opnået med RPTEC/TERT1-celler (fig. 2B). Disse analyser viste, at tilstedeværelsen af ​​cyclosporin A øgede R123-retentionen med 71 procent. Denne værdi var tæt på den, der blev opnået under de samme betingelser med RPTEC/TERT1-celler (en stigning på 75 procent med cyclosporin A). Derfor var P-glykoproteinaktiviteten ens i RPTEC/TERT1-modellen og primære humane celler.

DOACs intracellulær akkumulationsanalyse: IC50 og I1/IC50 forholdsbestemmelse Intracellulære akkumuleringsundersøgelser blev udført for at vurdere den P-gp-medierede transport af apixaban og rivaroxaban ved en konstant koncentration på 10 µM i RPTEC/TERT1-celler in vitro og i nærvær af stigende koncentrationer af nilotinib, crizotinib, ketoconazol og warfarin (fig. 2, 3). Modelleringen af ​​øget apixaban- og rivaroxaban-retention blev vurderet for at bestemme IC50-værdier. Kombination af DOAC'er med nilotinib førte til de laveste IC50-værdier: 0,85 µM og 1,37 µM for henholdsvis rivaroxaban og apixaban (fig. 4, 5). Kombination med crizotinib gav IC50-værdier på 10,1 µM og 12,2 µM for henholdsvis rivaroxaban og apixaban. Overraskende nok gav kombination af DOAC'er med ketoconazol ikke de laveste IC50-værdier (16,5 µM og 16,9 µM for henholdsvis rivaroxaban og apixaban). Endelig, som forventet, kombination med warfarin, som var

valgt som en ikke-inhibitor, påvirkede ikke de intracellulære retentioner af de to DOAC'er. Den intracellulære akkumulering af både apixaban og rivaroxaban i Caco-2-celler i nærværelse af stigende koncentrationer af nilotinib blev derfor undersøgt til sammenligning med de cellulære modeller. Interessant nok, som observeret med RPTEC/TERT1-modellen, var IC50-værdien for rivaroxaban (4,16 µM) lavere end den, der blev opnået for apixaban (9,35 µM). Det er også interessant at bemærke, at IC50-værdierne observeret i Caco-2-celler var højere end dem, der blev opnået i RPTEC/TERT1-celler for den samme inhibitor. Den kliniske relevans af DDI'er kan forudsiges ud fra in vitro-data. Ifølge FDA-retningslinjerne blev [I1]/IC50-forhold beregnet for hver kombination af lægemidler. Dette forhold gør det muligt at sammenligne in vivo-koncentrationer med dem, der vides at producere en relevant effekt in vitro. For apixaban i RPTEC/TERT1-celler var forholdet 3,1, 0,06 og 17,4 med henholdsvis nilotinib, crizotinib og ketoconazol (tabel 1). I Caco-2-celler var [I1]/IC50-forholdet 0,46 for interaktionen mellem apixaban og nilotinib (tabel 1). For rivaroxaban var forholdet lidt højere end dem, der blev opnået for apixaban i RPTEC/TERT1-celler: henholdsvis 5,1, 0,08 og 17,7 for nilotinib, crizotinib og ketoconazol (tabel 2). På samme måde var [I1]/IC50-forholdet observeret for interaktionen mellem rivaroxaban og nilotinib i Caco-2-celler 1,03, hvilket var højere end det opnåede for apixaban (tabel 2).

Diskussion

Talrige undersøgelser udført i de seneste årtier har rapporteret en bemærkelsesværdig rolle af P-gp i lægemiddelfarmakokinetik [17-19]. I lyset af den stigende regulatoriske interesse for lægemiddelinteraktioner medieret af P-gp, er in vitro-assays til undersøgelse af lægemidlers hæmmende potentiale et vigtigt aspekt af lægemiddeludvikling og klinisk praksis. Til dette formål er mange in vitro-assays blevet udført, og de fleste af de tilknyttede data om forudsagt intestinal absorption er blevet genereret fra Caco-2- og MDCK-MDR1-cellelinjerne [20-22]. Der er dog få data tilgængelige om den aktive tubulære sekretion af lægemidler, som også spiller en nøglerolle i lægemiddeldisposition og afhænger af tilstedeværelsen af ​​ABC-transportører. Denne observation er klart forbundet med manglen på karakteriseretnyrecellelinjer til forudsigelse af lægemiddelnyreefux. Dette mål kræver en in vitronyremodel, der tæt efterligner den fysiologiske barriere. Den humane cellelinje RPTEC/TERT1, som udtrykker adskillige ABC-transportører (især P-gp), ser ud til at være et godt alternativ, som vist i en tidligere undersøgelse [16]. I denne sammenhæng undersøgte dette arbejde anvendelsen af ​​RPTEC/TERT1-modellen til at vurdere P-gp-hæmningspotentialet. Så vidt vi ved, er dette arbejde det første til at levere data fra P-gp-hæmningsundersøgelser med menneskernyreceller.

In vitro-assays til bestemmelse af P-gp-hæmningspotentialet er almindeligvis baseret på brugen af ​​et specifikt reference-P-gp-substrat, såsom digoxin eller rhodamin 123 [23-25]. På grund af deres brugervenlighed er fluorescerende prober fordelagtige til high-throughput assays. Desuden er rhodamin 123 blevet anvendt bredt til påvisning af P-gp-aktivitet i en lang række undersøgelser [26-28]. På denne måde blev assays af rhodamin 123-akkumulering i RPTEC/TERT1-celler udført i denne undersøgelse for at identificere inhiberingsprofilerne for 14 lægemidler. Blandt disse lægemidler blev cyclosporin A, ketoconazol og verapamil valgt som stærke P-gp-hæmmere. Disse inhibitorer er blevet omfattende karakteriseret for deres signifikante P-gp-hæmmende potentiale, hvilket fører til modulering af både digoxin og rhodamin 123-transport [27, 29, 30]. Som forventet forårsagede disse lægemidler de højeste rhodamin 123-retentioner i RPTEC/TERT1-celler. I modsætning hertil blev der ikke observeret nogen stigning i retentionen af ​​R123 med warfarin, som blev brugt som en negativ kontrol, hvilket bekræfter pålideligheden af ​​RPTEC/TERT1-modellen. Interessant nok forårsagede DOAC'er - inklusive dabigatran etexilat, apixaban og rivaroxaban - blandt alle de testede lægemidler tydelige stigninger i retentionen af ​​R123, selvom de ikke tidligere var karakteriseret som inhibitorer, kun P-gp-substrater [31, 32]. Denne observation kan skyldes eksistensen af ​​såkaldt "kompetitiv" hæmning, hvor lægemidlerne kan interagere med de samme bindingssteder på P-gp. De mest velkarakteriserede steder for P-gp er H-stedet (til binding til Hoechst 33342) og R-stedet (til binding af rhodamin 123). Imidlertid kunne flere andre ukendte lægemiddelbindingssteder spille en rolle i disse interaktioner, hvilket kunne forklare de forskellige effekter af DOAC'erne på akkumulering af R123 [33, 34]. P-gp-hæmningen observeret for et givet lægemiddel er derfor afhængig af det anvendte substrat under in vitro undersøgelser [28, 35]. Brugen af ​​forskellige P-gp-substrater, der interagerer med forskellige lægemiddelbindingssteder, bør derfor overvejes for nøjagtigt at beskrive lægemidlers formodede P-gp-hæmmende styrke. Det er også interessant at bemærke, at flere tilstande fra rhodamine 123-screeningen også blev udført i Caco-2-celler for at sammenligne RPTEC/TERT1-cellerne med en referencemodel i lægemiddeltransportundersøgelser. Som forventet forårsagede cyclosporin A, verapamil og nilotinib de højeste stigninger i rhodaminretention. De samme inhiberingsprofiler blev observeret med både Caco-2- og RPTEC/TERT1-celler. Imidlertid var stigningerne i rhodamin 123-retention genereret af interaktionerne i Caco-2-modellen større end dem, der blev observeret i RPTEC/TERT1-celler, hvilket tyder på en potentiel forskel i ekspressionen af ​​P-glycoprotein mellem modeller. Derfor, i den nuværende undersøgelse blev en anden metode brugt til at vurdere og bekræfte den potentielle hæmning af P-gp af lægemidler.

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRE DIALYSEN

Baseret på rhodamine 123-akkumuleringsassayet blev fire lægemidler valgt til at bestemme deres koncentrationsafhængige effekter på den intracellulære akkumulering af apixaban og rivaroxaban. P-gp har vist sig at spille en hovedrolle i efux af apixaban og rivaroxaban [32, 36]. IC50-værdierne for nilotinib, crizotinib og ketoconazol blev derfor vurderet, med DOAC'er valgt som "offer"-lægemidler. Så vidt vi ved, er denne undersøgelse den første til at udføre intracellulære akkumuleringsundersøgelser med DOAC'er hos menneskernyreceller. IC50-værdierne opnået for nilotinib og crizotinib var i overensstemmelse med deres inhiberingsprofiler opnået fra rhodamin 123-akkumuleringsassayet. Nilotinib, som forårsagede en kraftig stigning i retentionen af ​​R123, præsenterede den laveste IC50-værdi for de to DOAC'er, hvilket bekræftede dets høje hæmningspotentiale. Dette resultat er også i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse, der viste en koncentrationsafhængig stigning i den intracellulære akkumulering af [3H]-paclitaxel i MDR1-transficerede celler, hvilket tyder på, at det har en inhibitorprofil [37]. For crizotinib viste R123-analysen moderat hæmningspotentiale med mindre stigning i R123-retention end den, der var forårsaget af nilotinib. Denne observation understøttes af en tidligere undersøgelse, hvor crizotinib øgede den intracellulære akkumulering af R123 og doxorubicin i MDR1-transficerede celler [38]. Dette resultat er også i overensstemmelse med IC50-værdierne bestemt med DOAC'er, som var højere end de tilsvarende værdier for nilotinib, hvilket bekræfter dets moderate inhiberingsprofil. Det er dog interessant at bemærke, at en koncentration på 10 µM af enten nilotinib eller crizotinib ikke forårsagede de samme stigninger i retentionen af ​​rhodamin 123 og DOAC'er. Ved rhodaminscreening øgede nilotinib retentionen af ​​substratet med omkring 71 procent, mens det var omkring 40 procent for DOAC'er. I modsætning hertil forårsagede crizotinib en lille stigning i retentionen af ​​rhodamin (23 procent), men større stigninger i retentionen af ​​DOAC'er (ca. 50 procent) ved samme koncentration. Som diskuteret tidligere kunne denne observation forklares ved forskelle i bindingsstederne på P-gp. Det er kendt, at mange lægemidler interagerer og konkurrerer med H-bindingsstedet i stedet for R-bindingsstedet (hvilket er hvor rhodamin 123 binder) og omvendt [39]. Interessant nok forårsagede ketoconazol, som er kendt for at være en stærk P-gp-hæmmer, en lidt mindre stigning i retentionen af ​​rhodamin 123 end nilotinib gjorde (henholdsvis 66 procent mod 71 procent). Ikke desto mindre blev en lignende værdi observeret med Caco-2-celler, hvor tilstedeværelsen af ​​ketoconazol forårsagede en stigning på 60 procent i akkumuleringen af ​​R123 [40]. Den intracellulære akkumulering af DOAC'er til bestemmelse af IC50-værdier viste også højere værdier sammenlignet med nilotinib og crizotinib. Interessant nok var de fleste af IC50-værdierne fundet i LLC-PK1- eller Caco-2-modellerne, der brugte digoxin som et P-gp-substrat, mellem 3 og 4 µM for ketoconazol [41, 42]. Disse værdier er ret forskellige fra dem, der er fundet i nærværende undersøgelse (16,5 µM og 16,9 µM med henholdsvis apixaban og rivaroxaban). Denne observation bekræfter, at valgene af substratet og den anvendte model er afgørende påvirkninger ved bestemmelse af P-gp-hæmmende potentiale. Derudover rapporterede en nylig undersøgelse, at ekspressionsniveauerne af ABC-transportører i in vitro cellulære modeller har en indvirkning på lægemiddeltransportassays og derfor på evalueringen af ​​DDI'er relateret til P-gp [43]. Faktisk afslørede bestemmelsen af ​​IC50-værdier for verapamil ved anvendelse af rivaroxaban som et P-gp-substrat en heterogenitet mellem MDCKMDR1- og Caco-2-cellemodellerne med IC50-værdier på henholdsvis 6,94 µM og 21,2 µM [43]. Desuden blev den koncentrationsafhængige effekt af nilotinib på den intracellulære akkumulering af apixaban og rivaroxaban også undersøgt i Caco-2-celler i denne undersøgelse. Interessant nok var IC50-værdier for nilotinib signifikant højere i Caco-2-celler end i RPTEC/TERT1-celler. Denne observation kan forklares ved forskellen i P-gp-ekspression mellem disse modeller. Derudover er det kendt, at P-gp-fordelingen afhænger af det betragtede væv. Fallon et al. viste, at niveauet af P-gp var højere inyreend i levervæv hos mennesker [45]. På den anden side ser ekspressionsniveauet af P-gp ud til at være højere i tarmen end inyrevæv [46]. Brugen af ​​humane celler såsom RPTEC/TERT1-modellen, som ikke overudtrykker transportører, kunne derfor give yderligere data. Disse data kan bruges og imputeres i fysiologisk baseret farmakokinetisk modellering (PBPK) ved at integrere flere parametre, såsom mængden af ​​P-gp i en vævs- eller in vitro-model eller IC50-værdier.

Selvom IC50-værdierne fundet for ketoconazol i RPTEC/TERT1-modellen var højere end dem, der blev observeret i litteraturen, viste [I1]/IC50-forholdet - valideret som en forudsigelse for potentielle klinisk relevante DDI'er for oralt administrerede lægemidler - høje værdier, der var over grænsen på 0,1 defineret af FDA. Dette resultat er i overensstemmelse med en klinisk undersøgelse, der viste en dobbelt stigning i apixaban eksponering ved samtidig administration af ketoconazol [44]. Tilsammen viser alle disse resultater, at RPTEC/TERT1-modellen er et lovende værktøj til at vurdere P-gp-hæmmende potentiale.

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYRESMERTER

Konklusion

Vores undersøgelse viste, at anvendelsen af ​​RPTEC/TERT1-modellen er praktisk til at evaluere P-gp-hæmmende potentialer af forskellige klasser af lægemidler. Rhodamine 123-akkumuleringsassays gjorde det muligt at udføre en indledende lægemiddelscreening. Imidlertid skal de P-gp-hæmmende potentialer af lægemidler, der ikke interagerer med R-stedet af P-gp, også undersøges ved hjælp af yderligere substrater for at bekræfte forudsigelserne. IC50-værdierne bestemt ud fra den intracellulære akkumulering af apixaban og rivaroxaban er i overensstemmelse med inhiberingsprofilerne observeret med rhodamin 123. Desuden bekræftede brugen af ​​ketoconazol og warfarin som henholdsvis en stærk hæmmer og en ikke-hæmmer af P-gp. pålideligheden af ​​RPTEC/TER1-modellen, når den bruges til at opnå in vitro-data om lægemidlers hæmmende potentiale mod P-gp. Endelig fremhævede en sammenligning af resultaterne opnået ved hjælp af RPTEC/TERT1-modellen med dem opnået ved hjælp af Caco-2-celler vigtigheden af ​​at udføre in vitro-undersøgelser i forskellige cellulære modeller for at bekræfte den inhiberende profil for et givet lægemiddel.