Cistanche Herba har antidepressiv effekt ved kronisk uforudsigelig stress

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yang Li, et al

ABSTRAKT

Cistanche tubulosa, en art af Cistanches Herba, blev for nylig bekræftet at have antidepressiv effekt ved inchronic unpredictable stress (CUS) rotter ved at genoprette homeostase af tarmmikrobiota. I denne artikel sigter vi på at udforske den metaboliske profil af C. tubulosa i normale og CUS-inducerede depressive modelrotter in vitro og in vivo.Cistanche tubulosa ekstrakt(CTE) blev evalueret i både normale og CUS-rotter. Samtidig in vivo metabolisme af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)hos normale og deprimerede rotter blev også undersøgt i rotteurin og afføring. I alt 20 og 26 metabolitter blev karakteriseret fra in vitro- og in vivometabolisme i henholdsvis normale og CUS-rotter. CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)blev metaboliseret til aglyconer og nedbrydningsprodukter af phenylethanoid glycosider (PhGs) og iridoid glycosider, hvad enten det er af normal eller deprimeret rotte intestinal mikrobiota in vitro. Fase II-metabolitter af aglyconer og nedbrydningsprodukter af PhG'er og iridoidglykosider var hovedmetabolitterne i rotteurin og -fæces. Derudover var den metaboliske evne til at generere sekundære glycosider og aglyconer i depressiv rotte-tarmmikrobiota meget svagere end den i normal rotte-tarmmikrobiota, hvilket blev tilskrevet de forstyrrede glycosidhydrolaser produceret af intestinal mikrobiota i CUS-deprimerede rotter. Resultaterne af denne undersøgelse lagde grundlaget for at forstå den metaboliske proces og den terapeutiske mekanisme af CTEs antidepressive egenskab.

Nøgleord: Cistanche tubulosa, Depression Metabolisme, In vitro, In vivo, Intestinal mikrobiota

1. Introduktion

Cistanches Herba er officielt registreret som de tørrede saftige stængler af Cistanche deserticola (YC Ma) og C. tubulosa (Schrenk), som bruges til at behandle nyremangel, impotens, kvindelig infertilitet, morbidleucorrhea, voldsom metrorrhagia og senil obstipation [1]. Moderne farmakologiske undersøgelser har vist, at Cistanches Herba besidder forskellige biologiske aktiviteter såsom anti-neurodegeneration, immunregulering og anti-inflammation [2,3]. Vores tidligere undersøgelser har bekræftet detCistanche tubulosa ekstrakt(CTE), som består af 48,6 procent phenylethanoid glycosider (PhGs), 6,9 procent iridoid glycosider og 20,0 procent totale saccharider, kunne markant lindre depressive symptomer på kronisk uforudsigelig stress (CUS)-induceret depressive rotter ved at genoprette homeostase af tarmmikrobiota [4]. Nylige undersøgelser viser, at ændringer i tarmmikrobiotaens sammensætning var forbundet med udviklingen og progressionen af ​​depression [5,6]. De relative mængder af mikrobielle slægter var markant forstyrret i CUS-depressive modelrotter sammenlignet med normale kontroller [7]. Hos deprimerede patienter var mangfoldigheden og rigdommen af ​​tarmmikrobiota også væsentligt ændret [8]. Desuden blev forskellige forbindelser, herunder phenylethanoidglycosider (PhG'er) og iridoidglycosider, betragtet som hovedbestanddelene i Cistanches Herba [2,3], som let blev metaboliseret til deres sekundære glycosider og aglyconer, herunder hydroxytyrosol (HT), 3,4-dihydroxyphenethyl glycosid, deglycosyleret geniposidinsyre osv. af human tarmmikrobiota. Disse metabolitter absorberes lettere gennem tarmen og udøver biologisk aktivitet i overensstemmelse med prototypekomponenten[9-11]. Vi mener således, at under forekomsten og udviklingen af ​​depression vil forstyrrelsen af ​​intestinal mikroflorastruktur uundgåeligt påvirke metabolismen af ​​orale traditionelle kinesiske lægemidler (TCM'er) i mave-tarmkanalen, ud over at påvirke værtens fysiologiske tilstand. De fleste af de eksisterende metaboliske data fra Cistanches Herba kommer fra metaboliske undersøgelser på raske dyr[12-15]. Derfor ville det være af mere klinisk betydning at undersøge den metaboliske profil af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)i den patologiske tilstand ved at belyse dets bioaktive komponenter og forstå virkningsmekanismen for dens antidepressive effekt.

I den aktuelle undersøgelse sigter vi mod at karakterisere de metaboliske profiler af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)i både raske og CUS-inducerede depressive modelrotter ved ultra-performance væskekromatografi quadrupol time-of-flight massespektrometri (UPLC-Q-TOF-MS). Mavesaft, tarmvæske og mikrobiota fra normale og depressive patologiske rotter er blevet brugt til at simulere den metaboliske proces af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)i mave-tarmkanalen in vitro, uafhængigt og sekventielt. In vivo metabolitter er også belyst efter oral administration af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)hos normale og CUS-rotter. Denne undersøgelse giver ny indsigt i metabolismen og aktive metabolitter af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)for depression.

2. Materiale og metoder

2.1. Materiale

Tørrede stængler af C. tubulosa blev indsamlet fra Hetian County (Xinjiang, Kina). Kuponprøverne blev autentificeret af prof. Xiaobo Li og deponeret i herbariet på School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Kina). Ekstraktionsmetoden blev brugt som specificeret i vores tidligere publikation [4]. DetCistanche tubulosa ekstrakt(CTE) prøver blev opbevaret ved 4 grader og genopløst med sterilt vand før brug. De sterile vandopløsninger af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)prøven blev derefter filtreret gennem en 0.22 μm membran, og filtraterne blev opsamlet i sterile rør.

Echinacoside blev leveret af Dr. Pengfei Tus laboratorium, PekingUniversity (Beijing, Kina). Acteosid, isoacteosid, 2'-acetylacteosid og cistanosid A blev købt fra Sichuan Weikeqi BiologicalTechnology Co., Ltd. (Chengdu, Kina). Hydroxytyrosol, koffeinsyre, 3,4-dihydroxybenzenpropionsyre, 3-hydroxyphenylpropionsyre og 3-phenylpropionsyre blev købt fra Aladdin IndustrialInc. (Shanghai, Kina). Renheden af ​​hver komponent blev bestemt til at være > 95 procent ved HPLC-UV. Acetonitril af HPLC-kvalitet blev købt fra Merck (Darmstadt, Tyskland). Deioniseret vand blev fremstillet ud fra destilleret vand ved anvendelse af et Milli-Q vandrensningssystem (Millipore, Bedford, MA, USA). Alle andre anvendte reagenser og kemikalier var af analytisk kvalitet.

2.2. Dyreforsøg

Sprague-Dawley-hanrotter (200 ± 20 g) blev anskaffet fra Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Beijing, Kina) og anbragt i Laboratory Animal Center i Shanghai JiaoTong University (Shanghai, Kina). Dyrene blev gruppeopstaldet under kontrolleret stuetemperatur (25 ± 2 grader, 55 ± 10 procent relativ fugtighed) med en lys-mørke-cyklus på 12:12 timer. Rotterne fik fri adgang til almindelige laboratorierotters foder og vand i 1 uge. Dyrefaciliteterne og protokollerne blev godkendt af Animal Ethics Committee of Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Kina).

Efter en uges akklimatisering blev tolv naive rotter tilfældigt opdelt i to grupper (n=6), kontrolgruppen og gruppen med kronisk uforudsigelig stress (CUS). CUS-rotter blev udviklet som i vores tidligere rapport [4], som blev udsat for en række forskellige stressfaktorer: hvid støj (100 dB) i 1 time, stroboskopisk belysning med lav intensitet natten over (120 blink/min), vandmangel i 24 timer, tom vandflasker i 1 time (efter vandmangel), madmangel i 24 timer, fysisk tilbageholdenhed (1-2 timer), tvungen svømning (5 min), snavset bur i 24 timer (200 ml vand i 100 g savsmuld), haleklem ( 1 min), stød i 30 minutter, 45 graders burtilt i 24 timer og belysning natten over (12 timer). Stressorer blev påført kontinuerligt og tilfældigt i 4 uger, detaljeret arrangement er beskrevet i tabel S1. Efter 4 ugers stress blev saccharosepræferencetesten, open-field-testen og nyhedsundertrykt fodringstest udført som beskrevet tidligere [4]. Omridset af CUS og adfærdstesten er vist i Fig. S1. Efter adfærdstest blev der opnået mindst 4 fecalpellets fra hver rotte og anbragt i sterile koniske rør til in vitro analyse af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)stofskifte.

2.3. Gastrointestinal metabolisme af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)af normal og CUS rotte in vitro

2.3.1. Metabolisme af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)i simuleret mave- og tarmsaft

Halvtreds milligram CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)blev tilsat til henholdsvis 10 ml simuleret mavesaft og tarmsaft. Så CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)blev inkuberet ved 37 grader i 4 timer i mavesaft og 6 timer i tarmsaft. Den dyrkede blanding (1 ml) blev standset med 3 ml vandmættet n-butanol umiddelbart efter 0 og 4 timer i mavesaft og ved 0 og 6 timer i intestinaljuice. Behandlingsmetoden for den anvendte prøve var som tidligere beskrevet [9].

2.3.2. Metabolisme af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)af normal og CUS rotte tarmmikrobiota

Friske normale og CUS-fækale prøver af rotter blev først blandet og homogeniseret med 25 gange volumen af ​​GAM-bouillon. Sedimenter blev fjernet ved filtrering gennem tre stykker gaze. Suspensionen blev derefter inkuberet ved 37 grader i en anaerob inkubator, hvor luften blev erstattet af en gasblanding (H2 5 procent, CO2 10 procent, N2 85 procent). Halvtreds milligram CTE blev tilsat til 5 ml normal og CUS rottefækal suspension separat, og suspensionen blev inkuberet ved 37 grader i 48 timer. Den dyrkede blanding blev fjernet og ekstraheret med vandmættet n butanol ved 0, 12, 24 og 48 timer. Prøvebehandlingsmetoden blev tidligere beskrevet [9].

2.3.3. Sekventiel metabolisme af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)af mavesaft, tarmsaft, normal og CUS rotte tarmmikrobiota

For det første 100 mg CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)blev tilsat til 1{{10}} mL simuleret mavesaft og inkuberet ved 37 grader i 4 timer. Hele reaktionen blev quenchet med 3 gange volumenet af vandmættet n-butanol og centrifugeret ved 3000 rpm i 15 minutter, efterfulgt af fordampning af supernatanten under en strøm af nitrogen gas ved 37 grader. For det andet blev resten genopløst i 0,4 ml sterilt vand, tilsat til 8 ml simuleret tarmsaft og inkuberet ved 37 grader i 6 timer. Prøven med mavesaft blev tilberedt på samme måde. Til sidst blev resten genopløst i 0,3 ml sterilt vand, tilsat til henholdsvis 6 ml normal- og CUS-fækal suspension af rotter og inkuberet ved 37 grader i 48 timer i en anaerobicinkubator. En milliliter af reaktionen blev standset med 3 ml vandmættet n-butanol umiddelbart efter 0 og 4 timer i mavesaft, ved 0 og 6 timer i tarmsaft og ved 0, 12, 24 og 48 timer i rotte-tarmmikrobiota . Prøven blev behandlet identisk CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)i simuleret mavesaft.

2.4. Metabolisme af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)af normal og CUS rotte in vivo

Hver rotte i de to grupper blev derefter anbragt i et individuelt metabolisk bur. Efter faste natten over, der kun tillod fri adgang til vand, blev alle rotter indgivet oralt med 2 ml vand via mavesonde. Blanke urin- og fækalprøver blev indsamlet fra alle rotter fra 0 timer til 12 timer. Yderligere, CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)(400 mg/kg) blev indgivet ved sonde. Urin- og fæcesprøver blev opsamlet fra 0 timer til 24 timer. Alle urin- og fækale prøver blev opbevaret ved -80 grader med det samme.

Urin- og fæcesprøver fra normale rotter og CUS-rotter blev forbehandlet som tidligere beskrevet [12]. Alle resulterende prøver blev analyseret ved UPLC-Q-TOF-MS.

2.5. Analytisk metode

UPLC blev udført på et Waters ACQUITY UPLC-system (WatersCorp., Milford, MA, USA) med en ACQUITY UPLC BEH C18-søjle (100 mm × 2,1 mm id, 1,7 μm, Waters Corp. , USA) ved gradienteluering under anvendelse af {{10}},1 procent myresyreacetonitril (A) og 0,1 procent myresyre i vand(B) ved en strømningshastighed på 0,4 ml/min. . Gradientprofilen var: 0-5 min (A: 5-20 procent), 5-7,5 min (A: 20-30 procent), 7,5-10 min (A: 30-70 procent), 10-11 min (A) : 70-100 procent), og blev holdt i 1,5 min. Gradienten blev recirkuleret til 5 procent på 0,5 minutter og blev holdt i 2,5 minutter til næste kørsel. Injektionsvolumenet var 3 μL. Temperaturen i kolonneovnen var sat til 35 grader.

Massespektrometri blev udført under anvendelse af et Waters Vion IMS massespektrometer (Waters Corp., Milford, MA, USA). Ionisering blev udført i negativ elektrospray-tilstand (ESI−). MS-parametrene var som følger: kapillarspænding, −2.0 kV; keglespænding, 20 V; kildetemperatur, 120 grader ; desolvationstemperatur, 500 grader ; gasstrømme af kegle og desolvation, henholdsvis 50 og 1000 L/h. Til nøjagtig massemåling blev leucin-enkephalin brugt som låsemassen til at generere en [M-H]-ion (m/z 554.2615). Et MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) eksperiment i to scanningsfunktioner blev udført som følger: funktion 1 (lavenergi): m/z 50-1000, 0,25 s scanningstid, 0,02 s interscan forsinkelse, 6 eV kollisionsenergi; funktion 2 (høj energi): m/z50–1000, 0,25 s scanningstid, 0,02 s inter-scan forsinkelse, kollisionsenergirampe på 20–45 eV.

2.6. Databehandling

Dataene blev behandlet ved hjælp af UNIFI 1.8.1-software (Waters Corp.,Milford, MA, USA) til identifikation af metabolitter inden for den nøjagtige masse af fuld-scanningsrådata indsamlet gennem MSE. Forbindelser blev identificeret baseret på nøjagtig masse, fragmenter i højenergi-massespektrometri. Intensitetstærsklen blev sat til 100,0 tællinger. Målidentifikationen, fragmentmatchtolerancen og andre parametre blev automatisk indstillet.

3. Resultater

3.1. Adfærdsændringer i CUS-induceret depressionsrotte

Rotterne med CUS-inducerede depressive symptomer blev vurderet ved adfærdsmæssige tests, herunder saccharosepræferencetest, open-field test og nyhedsundertrykt fodringstest. Elevens t-test afslørede, at saccharosepræference i saccharosepræferencetest (p < 0,001),="" total="" distance="" tilbagelagt="" i="" åben-felttesten="" (p="">< 001)="" og="" latens="" til="" at="" spise="" i="" nyhedsundertrykt="" fodringstest="" (p="">< 0,01)="" var="" signifikant="" anderledes="" sammenlignet="" med="" kontrolgruppen="" efter="" 4-uges="" cus-behandling="" (fig.="" 1).="" disse="" resultater="" indikerede,="" at="" den="" kroniske="" uforudsigelige="" stressmodel="" blev="" udviklet="" med="">

3.2. Karakterisering af kemiske bestanddele af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)

En omfattende analyse af prototypebestanddele af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)blev udført af UPLC-Q-TOF-MS. I alt 27 vælgere fra CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)blev detekteret og foreløbigt karakteriseret, herunder 20 PhG'er, 5 iridoid- og iridoidglycosider og 2 oligosaccharider. Detaljerede oplysninger, herunder retentionstid, nøjagtige MS og MS/MS-fragmentioner, er anført i Understøttende information (tabel S2) for at give indsigt i strukturen af ​​disse kemiske bestanddele. UPLC-Q-TOF-MS totalt ionkromatogram (TIC) af CTE blev vist i fig. S2.

3.3. Gastrointestinal metabolisme af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)af normal og CUS rotte in vitro

I denne undersøgelse, de potentielle metabolitter af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)af normale og CUSrotter blev in vitro detekteret fra TIC'erne og identificeret med en kombination af grundstofsammensætninger og MS/MS-fragmentmassespektre efter at have sammenlignet dem med kontrolprøverne. Alle metabolitterne fra CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)i simuleret mave- og tarmsaft er normal og CUS-rottetarmmikrobiota anført i tabel 1.

3.3.1. Metabolisme af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)i simuleret mave- og tarmsaft

Syv metabolitter af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)i simuleret mavesaft blev foreløbigt identificeret ved nøjagtig masse- og MSE-fragmentinformation: M1 (m/z315.1074, C14H20O8, 1,66 min), M4 (m/z 459.1501, C20H28O12, 2.36 min), M5 (m/z 150, C105, C105. 2,60 min.), M7 (m/z179.0338, C9H8O4, 2.85 min.), M12 (m/z 785.2481, C35H46O20, 4.77 min.), M16 (m/z 827.2580, C37H48O73 min.) og Mz. .1968, C29H36O15, 5,81 min). Deglykosylering, dehydroxylering, dehydrogenering og isomerisering blev betragtet som de vigtigste metaboliske veje for CTE i mavesaft. M4 og M5 viste sig at have en molekylvægt på 2 Da og 16 Da lavere end deres prototypekomponent, decaffeoylacteosid, og dermed identificeret som dets dehydrogenerede og dehydroxylerede produkter, henholdsvis. M12 blev identificeret som en isomer af echinacosid, der producerede de samme ioner som echinacosid ved m/z 623.2178, 477.1601, 315.1055, 161.0237.

Samme metabolitter blev påvist efter CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)inkubation i intestinaljuice. Det er bemærkelsesværdigt, at caffeoylgruppen i C-6′-positionen i PhG'er let blev metaboliseret af fordøjelsesenzymer i tarmsaft til at producere dens decaffeylmetabolitter og koffeinsyre.

3.3.2. Metabolisme af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)af normal og CUS rotte tarmmikrobiota

I alt 20 metabolitter biotransformeret fra CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)i normal ratintestinal mikrobiota blev påvist og identificeret (fig. 2). Ud fra resultaterne blev det observeret, at PhG'er blev nedbrudt til aglycon hydroxytyrosol (HT) M2 (m/z 153,0550, C8H10O3, 1,78 min) og koffeinsyre (CA) M7 (m/z 179,0338, C9H8O4 min), derefter 2.855. blev yderligere metaboliseret til M3 (m/z 163,0390, C9H8O3, 2,02 min), M6 (m/z181,0501, C9H10O4, 2,76 min), M10 (m/z 195,0655, C10H12O4, 4,15 min.) og M12 min. , C9H10O3, 4,36 min) gennem dehydroxylering, reduktion og methylering. Derudover er de centrale metaboliske veje, der producerede direkte metabolitter af PhG-prototypeforbindelser fra CTE i normal rotte-tarmmikrobiota, reduktion, methoxylering, deglycosylering, decaffeoyl, dehydrogenering og isomerisering.

Efter inkubation i CUS-induceret depression rotte intestinal mikrobiota, CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)blev omdannet til 20 metabolitter gennem de samme metaboliske veje som normale rotter.

3.3.3. Sekventiel metabolisme af CTE af mavesaft, tarmsaft, normal og CUS rotte intestinal mikrobiota

Efter sekventiel inkubation i mavesaft, tarmsaft, normal og CUS rotte-tarmmikrobiota, CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)blev metaboliseret til 14 metabolitter (herunder 8 med mavesaft, 7 med tarmsaft, 11 med normal og 10 med CUS rotte-tarmmikrobiota). Blandt disse var M2(HT) og M11 (3-hydroxyphenylpropionsyre, 3-HPP) de endelige metabolitter af PhG'er efter sekventiel inkubation af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)i mavesaft, tarmsaft og tarmmikrobiota. Der var ingen signifikant forskel i metabolitter mellem normal rotte og CUS-rotte.

M8, M9, M14, M17, M19 og M20 blev kun påvist i den uafhængige metabolisme af CTE af normal og CUS rotte-tarmmikrobiota. Disse metabolitter var hovedsageligt metaboliske mellemprodukter, der var blevet fuldstændigt metaboliseret til endelige metabolitter i undersøgelsen af ​​den sekventielle metabolisme af CTE og er derfor vanskelige at påvise.

3.3.4. Forskelle mellem metabolisk hastighed af CTE ved normal og CUS ratintestinal mikrobiota

For at belyse forskellene mellem metaboliske hastigheder af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)ved normal og CUS rotte intestinal mikrobiota blev det relative indhold af 27 prototypeforbindelser og 20 metabolitter efter inkubation med mavesaft, tarmsaft, normal og CUS rotte intestinal mikrobiota bestemt separat og sekventielt (Tabel S3 og S4). Resultaterne indikerede, at selvom der ikke var nogen signifikante forskelle mellem CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)metabolitter af normale og depressive rotter, blev der observeret en signifikant forskel i deres metaboliske hastigheder. For eksempel blev C2 og C5 identificeret som 8-epilogansyre eller dens isomer. De blev fuldstændigt metaboliseret i normale prøver inden for 12 timers inkubation. I patologisk deprimeret rotte intestinal mikrobiota blev de imidlertid grundigt metaboliseret efter 48 timers inkubation. Det var tydeligt, at stofskiftehastigheden i den normale rotte var hurtigere end den i CUS-rotten. Lignende resultater blev opdaget fra C18 (isoacteosid). Desuden er det bemærkelsesværdigt, at toparealet af M12 (isomerisering af echinacosid) og M16 (isomerisering af tubulosid A) i normale prøver var meget større end i CUS-prøver, hvilket indikerer, at isomeriseringsreaktionen af ​​CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)var mere udbredt i normal rotte intestinal mikrobiotahan i depression rotte intestinal mikrobiota.

3.4. Metabolisme af CTE af normal rotte og CUS rotte in vivo

Ved at sammenligne biologiske prøver af den CTE-behandlede gruppe med blankbiologiske prøver, i alt 26 metabolitter (forbindelse 1-26) af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)unormale og CUS-rotter blev påvist (tabel 2). Typiske UPLC-kromatogrammer af urinprøver fra normale og CUS-rotter er vist i fig. 3.

3.4.1. Karakterisering af metabolitter af CTE i normal og CUS raturin

I alt 18 in vivo metabolitter af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)i normale rotter blev urinprøver foreløbigt identificeret. Nedbrydningsmetabolitter af PhG'er inklusive HT og CA, og deres yderligere sulfatering (forbindelse 1, 2, 3, 5, 8 og 16), methylering (6, 21, 22 og 24) og methoxylering (13 og 14) metabolitter var hovedmetabolitter i normal rotteurin. Iridoidglycosider blev let metaboliseret til aglyconer (23, 25 og 26) gennem deglycosylering. Det er bemærkelsesværdigt, at der ikke blev påvist nogen prototypekomponent i den normale urinprøve fra rotter.

I den depressive rotteurinprøve, 22 metabolitter af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)blev opdaget og karakteriseret. Én prototypeforbindelse, 8-epilogansyre, blev påvist i patologisk rotteurin. Andre metabolitter var i overensstemmelse med dem, der blev fundet i normal rotteurin, inklusive sulfaterede metabolitter (1, 2, 3, 8, 10 og 16), methylerede metabolitter (6, 11, 19 og 22), methoxylerede metabolitter (13 og 14) af HT og CA, og theaglyconer af iridoidglykosider (25 og 26).

3.4.2. Karakterisering af metabolitter af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)i normal og CUS rottefæces

I denne undersøgelse kun én metabolit (forbindelse 20, 3-HPP) af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)blev identificeret i normal rotteafføring. De fleste PhG'er blev først nedbrudt til CA og undergik følgelig yderligere metabolisme til dens vigtigste mikrobielle metabolit, 3-HPP. I den fækale prøve fra CUS-rotten blev 3 metabolitter foreløbigt karakteriseret, herunder sulfateret 3-HPP (forbindelse 16) og sulfateret HT (forbindelse 2 og 3).

3.4.3. Forskelle mellem in vivo metabolitter af CTE i normale og CUSrotter

Efter oral administration af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt), viste in vivo-metabolitterne åbenlyse forskelle i sunde og depressive modelrotter. 21 metabolitter (forbindelse 1-3, 5, 6, 8-14, 16, 17 og 19-26) blev påvist i både raske og CUS-rotteprøver. Forbindelse 23 (deglycosyleret geniposidinsyre) blev kun identificeret i raske rotteprøver, mens forbindelser 4 (HT), 7 (8-epilogansyre), 15 (3, 4-dihydroxybenzenpropionsyre) og 18 ({{ 19}}HPP-glucuronidkonjugation) blev kun påvist i CUS-modelrotteprøver. Sammenfattende blev prototypebestanddele kun påvist i CUS-rotter, hvorimod flere fase II-metabolitter blev opdaget i normale rotter.

4. Diskussion

I denne undersøgelse blev tre in vitro-inkubationsmodeller, herunder mavesaft, tarmsaft, normal og CUS-rottetarmmikrobiota, anvendt uafhængigt og sekventielt for at undersøge den gastrointestinale metaboliske profil af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)in vitro. Det blev fundet, at PhGsand iridoidglycosider i CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)blev let metaboliseret til deres sekundære glycosider og aglyconer af CUS-induceret depressiv rotte-tarmmikrobiota. Derefter in vivo metabolisme af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)i normale og CUS-rotter blev også verificeret. De foreslåede metaboliske veje for CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)i raske og CUS-inducerede depressive rotter er vist i fig. 4. PhG'er, såsom echinacosid og acteosid, blev metaboliseret til HT og CA, og CA gennemgik yderligere metabolisme til dens vigtigste mikrobielle metabolit, 3-HPP. HT, CA og 3-HPP blev derefter metaboliseret til deres sulfaterede, methylerede og methoxylerede metabolitter. Iridoidglycosider inklusive geniposidinsyre, kankanosid A og kankanosid N blev metaboliseret til deres aglyconer gennem deglycosylering. Disse demonstrerede yderligere, at PhG'er og iridoidglykosider i CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)blev let metaboliseret til sekundære glycosider og aglyconer i CUS-rotter. Disse metabolitter udviser normalt bedre intestinal absorption og biotilgængelighed for yderligere at blive absorberet i blodet for at udøve biologisk aktivitet [16-18]. Det er værd at bemærke, at isomerisering var fremherskende for PhG'er i mave-tarmkanalen, relevante metabolitter blev identificeret efter at være blevet sammenlignet med UPLC-retentionstiden for deres prototypeforbindelser baseret på en optimeret ideel UPLC-gradientprofil.

Koffeinsyre var det primære nedbrydningsprodukt af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)af depressiv patologisk rotte-tarmmikrobiota. Tidligere publikationer rapporterede, at koffeinsyre producerer antidepressiv-lignende virkninger i tvungen svømmetest hos mus. Både hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF) mRNA-niveau i frontal cortex og TrkB mRNA-niveau i theamygdala var signifikant faldet efter den tvungne svømmetest, og den tidligere reduktion blev signifikant hæmmet af koffeinsyre [19]. Hydroxytyrosol var aglyconen af ​​PhG'er, som beskytter neurogenese og kognitiv funktion ved at forhindre stress-induceret nedregulering af neuralt protein BDNF [20]. Det er således nødvendigt at være mere opmærksom på nogle bioaktive metabolitter (dvs. HT og CA) transformeret af tarmmikrobiota efter oral administration.

Derudover giver de nuværende resultater bevis for, at i depressiverat tarmmikrobiota var den metaboliske evne til at generere sekundære glykosider og aglyconer markant svagere end den unormale tarmmikrobiota fra rotter. Årsagen tilskrives sandsynligvis depression-inducerede strukturelle ændringer af tarmmikrobiotaen, som fører til nedsat aktivitet af metaboliske enzymer produceret af tarmmikrobiota [21]. Interessant nok viste en tidligere undersøgelse, at phylum Bacteroidetes kodede for de mest udbredte glycosidhydrolase- og polysaccharidlyasegener til glycosidhydrolysen og spaltningen af ​​komplekse kulhydrater med en elimineringsmekanisme [22]. Specifikt Bacteroides spp. herunder B. caccae, B. dorei, B. finegoldii,B. fragilis, B. intestinalis, B. ovatus, B. thetaiotaomicron, B. uniformis og B. xylanisolvens viste et dominerende totalt antal gener, der koder for GH'er og PL'er. Parabacteroides distasonis har også de samme egenskaber [22]. Vores tidligere undersøgelser bekræftede, at 28-dages kronisk uforudsigelig stressstimulering reducerede den relative mængde af slægterne Bacteroides, Parabacteroides, Butyricimonas og Weissella, hvorimod den øgede Ruminococcus og Deinococcus hos rotter [4]. Det er bemærkelsesværdigt, at Bacteroides og Parabacteroides var de to mest udbredte mikrobielle taxaer, der tegnede sig for cirka 20 procent relative overflod hos normale rotter. Efter CUS-behandling var den relative mængde af Bacteroides og Parabacteroides kraftigt faldet til ca. 5 procent i depressive modelrotter. Derfor vil dette uundgåeligt føre til reduktion i det totale antal GH- og PL-enzymer i CUS-rotter og forstyrrer yderligere den deglycosylerede reaktion af CUS-depressiv tarmmikrobiota efter oral administration af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)hos modelrotter.

5. Konklusion

I denne undersøgelse blev UPLC-Q-TOF-MS-teknikken etableret og anvendt til at screene og identificere metabolitter afCistanche tubulosaekstrakti normale og CUS-depressive rotter in vitro og in vivo. Resultaterne viste, at CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)blev metaboliseret til aglyconer og nedbrydningsprodukter af PhG'er og iridoidglykosider af både rask og deprimeret tarmmikrobiota. Efter oral administration af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt), blev fase II-metabolitter af aglyconer og nedbrydningsprodukter af PhG'er og iridoidglycosider overvejende fundet i rotteurin. Den metaboliske evne til at generere sekundære glycosider og aglyconer i depressiv ratintestinal mikrobiota var meget svagere end den i den normale rottes tarmmikrobiota, som blev tilskrevet de forstyrrede glycosidhydrolaser produceret af intestinal mikrobiota i CUS-deprimerede rotter. Denne undersøgelse giver et nyt perspektiv for de senere udvikling af CTE(Cistanche tubulosa ekstrakt)som et potentielt antidepressivum.

Anerkendelser

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Kinas nationale nøgleforsknings- og udviklingsprogram (2017YFC1702400).

Bilag A. Supplerende data

Supplerende data til denne artikel kan findes online på HTTPS://doi.org/10.1016/j.jchromb.2019.121728

Fra: ' In vitro og in vivo metabolisme afCistanche tubulosa ekstrakti normale og kroniske uforudsigelige stress-inducerede depressive rotter' afYang Li, et al

---Journal of Chromatography B 1125 (2019) 121728

Referencer

[1] Chinese Pharmacopoeia Commission, The Pharmacopeia of the People's Republic of China, 2015 udg., China Medical Science Press, Beijing, Kina, 2015, s. 135 Del I.
[2] Y. Jiang, P.-F. Tu, Analyse af kemiske bestanddele i Cistanche-arter, J. Chromatogr. 1216 (2009) 1970-1979.
[3] Z. Fu, X. Fan, X. Wang, X. Gao, Cistanches Herba: en oversigt over dens kemi, farmakologi og farmakokinetiske egenskaber, J. Ethnopharmacol. (2017), https://doi.org/10.1016/j.jep.2017.10.015.
[4] Y. Li, Y. Peng, P. Ma, H. Yang, H. Xiong, M. Wang, C. Peng, P. Tu, X. Li, Antidepressiv-lignende virkninger afCistanche tubulosa ekstraktpå kroniske uforudsigelige stressrotter gennem restaurering af tarmmikrobiotahomeostase, Front. Pharmacol. (2018), https://doi.org/10.3389/fphar.2018.00967.
[5] JA Foster, MV Neufeld, Tarm-hjerneakse: hvordan mikrobiomet påvirker angst og depression, Trends Neurosci. 36 (2013) 305-312.
[6] E. Sherwin, TG Dinan, JF Cryan, Seneste udvikling i forståelsen af ​​tarmmikrobiotaens rolle i hjernens sundhed og sygdom, Ann. NY Acad. Sci. 12 (2017) e0177977.
[7] Y. Meng, H. Jia, Z. Chao, Y. Yong, Z. Yang, M. Yang, Z. Zou, Variationer i tarmmikrobiota og fækal metabolisk fænotype forbundet med depression ved 16S rRNA-gensekventering og LC/ MS-baseret metabolomics, J. Pharm. Biomed. Anal. 138 (2017) 231-239.

[8] JR Kelly, Y. Borre, BC O', E. Patterson, AS El, J. Deane, PJ Kennedy, S. Beers, K. Scott, G. Moloney, Transfering the blues: depression-associeret tarmmikrobiota inducerer neuroadfærdsmæssige ændringer hos rotten, J. Psychiatr. Res.. 82 (2016) 109-118.
[9] L. Yang, P. Ying, M. Wang, P. Tu, X. Li, Human gastrointestinal metabolisme af Cistanches Herba vandekstrakt in vitro: belysning af den metaboliske profil baseret på omfattende metabolitidentifikation i mavesaft, tarm juice, menneskelige tarmbakterier og tarmmikrosomer, J. Agric. Food Chem. 65 (2017) 7447-7456.
[10] Y. Li, G. Zhou, S. Xing, P. Tu, X. Li, Identifikation af echinacoside-metabolitter produceret af humane tarmbakterier ved hjælp af ultra-performance væskekromatografi/quadrupol time-of-flight massespektrometri, J. Agric. Food Chem. 63 (2015) 6764-6771.
[11] Y. Li, G. Zhou, Y. Peng, P. Tu, X. Li, Screening og identifikation af tre typiske phenylethanoid glycosider metabolitter fra Cistanches Herba af humane tarmbakterier ved hjælp af UPLC/Q-TOF-MS, J. Pharm. Biomed. Anal. 118 (2016) 167-176.
[12] L. Yang, P. Ying, M. Wang, G. Zhou, Y. Zhang, X. Li, Hurtig screening og identifikation af forskellene mellem metabolitter af Cistanche deserticola og C. tubulosa vandekstrakt i rotter ved UPLC- Q-TOF-MS kombineret mønstergenkendelsesanalyse, J. Pharm. Biomed. Anal. 131 (2016) 364-372.
[13] C. Q, P. Y, B. X, Z. W, C. L, L. X, Karakteriserer systematisk metabolitterne af echinacosid og acteosid fra Cistanche tubulosa i rotteplasma, galde, urin og fæces baseret på UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr. 30 (2016) 1406-1415.
[14] Y. Wang, H. Hao, G. Wang, P. Tu, Y. Jiang, Y. Liang, L. Dai, H. Yang, L. Lai, C. Zheng, En tilgang til at identificere sekventielle metabolitter af et typisk phenylethanoid glycosid, echinacosid, baseret på væskekromatografi-ionfælde-tid på
flyvemassespektrometrianalyse, Talanta 80 (2009) 572-580.
[15] C. Jia, H. Shi, W. Jin, K. Zhang, Y. Jiang, M. Zhao, P. Tu, Metabolisme af echinacosid, en god antioxidant, i rotter: isolering og identifikation af dets galdemetabolitter, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 431-438.
[16] J. Xu, HB Chen, SL Li, Forståelse af de molekylære mekanismer i samspillet mellem naturlægemidler og tarmmikrobiota, Med. Res. Rev. 37 (2017) 1140-1185.
[17] H. Liu, J. Yang, F. Du, X. Gao, X. Ma, Y. Huang, F. Xu, W. Niu, F. Wang, Y. Mao, Absorption og disposition af ginsenosider efter oral indtagelse administration af Panax notoginseng-ekstrakt til rotter, Drug Metab. Dispos. 37 (2009) 2290-2298.
[18] JM Laparra, Y. Sanz, S. Schaffer, F. Visioli, Interaktioner af tarmmikrobiota med funktionelle fødevarekomponenter og nutraceuticals, Pharmacol. Res. 61 (2010) 219-225.
[19] H. Takeda, M. Tsuji, T. Yamada, J. Masuya, K. Matsushita, M. Tahara, M. Iimori, T. Matsumiya, Koffeinsyre dæmper faldet i kortikalt BDNF-mRNA-ekspression induceret ved eksponering for forceret svømmestress hos mus, Eur. J. Pharmacol. 534 (2006) 115-121.
[20] A. Zheng, L. Hao, C. Ke, X. Jie, Z. Xuan, L. Yuan, C. Cong, J. Liu, Z. Feng, Maternal hydroxytyrosol administration forbedrer neurogenese og kognitiv funktion i prænatalt stressede afkom, J. Nutr. Biochem. 26 (2015) 190-199.
[21] H. Li, J. He, W. Jia, Påvirkningen af ​​tarmmikrobiota på lægemiddelmetabolisme og toksicitet, Ekspertudtalelse. Drug Metab. Toxicol. 12 (2016) 31.
[22] KA El, F. Armougom, JI Gordon, D. Raoult, B. Henrissat, Overfloden og mangfoldigheden af ​​kulhydrataktive enzymer i den menneskelige tarmmikrobiota, Nat. Rev. Microbiol. 11 (2013) 497-504.