Cistanche Deserticola-polysaccharid dæmper osteoklastogenese og knogleresorption via inhibering af RANKL-signalering og produktion af reaktive iltarter

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dezhi Song et al

Osteoporose er en metabolisk sygdom karakteriseret ved osteopeni og knoglemikrostrukturel forringelse. Osteoklaster er de primære effektorceller, der nedbryder knoglematrix, og deres unormale funktion fører til udvikling af osteoporose. Akkumulering af reaktive oxygenarter (ROS) under cellulær metabolisme fremmer osteoklastproliferation og -differentiering, og spiller derfor en vigtig rolle i osteoporose.Cistanchedeserticolapolysaccharid(CDP) har antitumor, anti-inflammatorisk og antioxidant aktivitet. Imidlertid er virkningen af ​​CDP på ​​osteoklaster uklar. I denne undersøgelse blev tartrat-resistent sur phosphatase-farvning, immunfluorescens, revers transkriptionspolymerase-kædereaktion og western blot-analyse brugt til at demonstrere, at CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)hæmmet osteoklastogenese og hydroxyapatitresorption. Derudover CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)hæmmede også ekspressionen af ​​osteoklastmarkørgener, herunder Ctsk, Mmp9 og Acp5, og havde ingen effekt på receptoraktivator af nuklear faktor κB (RANK) ekspression. Mekanistiske analyser afslørede, at CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)øger ekspressionen af ​​antioxidantenzymer for at dæmpe RANKL-medieret ROS-produktion i osteoklaster og hæmmer nuklear faktor af aktiverede T-celler og mitogen-aktiveret proteinkinase-aktivering. Disse resultater tyder på, at CDP kan repræsentere et kandidatlægemiddel til behandling af osteoporose forårsaget af overdreven osteoklastaktivitet.

SØGEORDknogleresorption,Cistanchedeserticolapolysaccharid, MAPK, osteoklast, reaktive oxygenarter

cistanche bodybuilding

1|INTRODUKTION

Balancen mellem knogledannelse, medieret af osteoblaster, og knogleresorption, medieret af osteoklaster, spiller en afgørende rolle i at opretholde knoglemetabolisk homeostase (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Når knogleresorptionen overstiger knogledannelsen, opstår osteoporose, som er karakteriseret ved reduceret knoglemasse og knoglemikrostrukturel skade (Ikeda, 2008). Osteoporose er en almindelig sygdom hos ældre individer og postmenopausale kvinder, og dens patogenese er ikke fuldt ud klarlagt (Cooper & Melton, 1992). Østrogenmangel er en primær årsag til osteoporose (Manolagas, O'Brien, & Almeida, 2013). Derudover kan reaktive oxygenarter (ROS) induceres af receptoraktivator af nuklear faktor κB-ligand (RANKL) og er forbundet med osteoklastdannelse (Yip et al., 2005) og kan således bidrage til udviklingen af ​​osteoporose (Manolagas, 2010). Nogle undersøgelser har fundet, at Nrf2-antioxidantmangel øger ROS-niveauer og fremmer RANKL-induceret osteoklastdifferentiering (Hyeon, Lee, Yang, & Jeong, 2013). Derfor bør reduktion af ROS-produktion under osteoklastdifferentiering vurderes som en terapeutisk strategi til behandling af osteoporose.

Osteoklaster er afledt af den hæmatopoietiske slægt af monocyt eller makrofag og er de eneste multinukleerede celler, der udfører knogleresorption (Teitelbaum, 2000). Derfor er forskning, der involverer osteoklastdannelse, af stor betydning for udvikling af effektive behandlinger for knoglemetabolismesygdomme (Lorenzo, 2017). Makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og RANKL, produceret af osteoblaster og aktiverede T-celler, er vigtige cytokiner, der regulerer osteoklastogenese (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL inducerer ekspressionen af ​​nuklear faktor af aktiverede T-celler (NFATc1), som er en kritisk transkriptionsfaktor, der er aktiv under osteoklastdannelse (Ishida et al., 2002). Aktiveret NFATc1 fremmer ekspressionen af ​​osteoklastmarkørgener såsom tartrat-resistent sur fosfatase (TRAcP) og cathepsin K (CTSK), der regulerer osteoklastogenese og osteoklastfunktion (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008).

Cistanchedeserticolapolysaccharid(CDP) er isoleret fra de kødfulde stængler afCistancheog besidder immunregulering, antitumor, antialdring og andre farmakologiske virkninger (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo, & Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)havde en hæmmende effekt på lipopolysaccharid-induceret nitrogenoxid (NO) produktion i muse mikrogliaceller (BV-2 celler; Nan et al., 2013). Desuden et phenylethanoid-rigt ekstrakt (ECD) afCistancheforbedret svømmekapaciteten hos mus ved at mindske muskelskader, forsinke mælkesyreakkumulering og forbedre energilagring (Cai et al., 2010). Virkningerne af CDP på ​​osteoklastfunktion og aktivitet forbliver dog ukendt.

I denne undersøgelse viste vi, at CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)hæmmer RANKL-induceret osteoklastdifferentiering og knogleresorption. Den underliggende mekanisme var, at CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)øger ekspressionen af ​​antioxidantenzymer for at dæmpe ROS-produktion og undertrykker derefter RANKL-aktiveret NFAT og mitogen-aktiveret proteinkinase (MAPK)-signaleringskaskader. Disse resultater tyder på, at CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)kan bruges til at behandle osteoporose forårsaget af overdreven osteoklastisk knogleresorption.

maca ginseng cistanche

2|MATERIALER OG METODER

2.1|Materialer

CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)(renhed > 98 procent) blev købt fra Solarbio (Beijing, Kina) og fremstillet i en stamkoncentration på 1 mM i phosphatbufret saltvand (PBS). Antistoffer er specifikke for c-Fos, CTSK, GSR, TRX1, NOS2, TRAF6, RANK, NFATc1, ERK, JNK, p38, phosphoryleret (p)-ERK, p-p38, p-JNK og -actin blev opnået fra julemanden Cruz Bioteknologi (San Jose, CA). Antistoffer mod V-ATPase d2 blev produceret som tidligere beskrevet (H. Feng et al., 2009). 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5- (3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) og luciferase assaysystemet blev opnået fra Promega (Sydney, Australien) . Rekombinant M-CSF blev købt fra R&D Systems (Minneapolis, MN). Rekombinant GST-rRANKL-protein blev udtrykt og oprenset som tidligere beskrevet (Xu et al., 2000).

2.2|Cellekultur

RAW264.7-celler (musemakrofagceller) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket i modificeret minimalt essentielt medium (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Australien) suppleret med 10 procent føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 100 U/ml penicillin og 100 ug/ml streptomycin (komplet medium). Knoglemarvs-afledte monocytter (BMM'er) blev isoleret fra 6 uger gamle C57BL/6J-mus, som blev aflivet i henhold til procedurer godkendt af Animal Ethics Committee ved University of Western Australia (RA/3/100/1244). Lange knogler blev dissekeret fri for blødt væv, og knoglemarven blev skyllet fra lårbenet og skinnebenet, som derefter blev dyrket i et komplet medium i nærværelse af M-CSF (50 ng/ml).

2.3|Osteoklastogenese assay

BMM'er blev udpladet i 96-brønds kulturplader med en tæthed på 6 × 103 celler pr. brønd og behandlet med et komplet medium indeholdende M-CSF (50 ng/ml) og GST-rRANKL (100 ng/ml), i nærvær af eller fravær af varierende koncentrationer af CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>tre kerner) blev identificeret som osteoklaster.

2.4|Cytotoksicitetsassays

BMM'er blev podet i 96-brøndsplader med 6 × 103 celler pr. brønd og efterladt natten over for at klæbe. Den følgende dag blev cellerne inkuberet med varierende koncentrationer af CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid). Efter yderligere 48 timer blev MTS-opløsningen (20 µl/brønd) tilsat og inkuberet med celler i 2 timer. Absorbansen ved 490 nm blev bestemt med en mikropladelæser (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2,5|Immunfluorescerende farvning

BMM'er blev podet med en tæthed på 6 × 103 celler pr. brønd i nærværelse af M-CSF (50 ng/ml) natten over. Celler blev derefter stimuleret med M-CSF og GST-rRANKL (100 ng/ml), indtil modne osteoklaster blev dannet. Osteoklasterne blev derefter behandlet med varierende koncentrationer af CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)i 48 timer før fiksering med 4 procent paraformaldehyd, permeabilisering med 0,1 procent Triton X-100–PBS og blokering med 3 procent bovint serumalbumin i PBS. Fremstillede celler blev inkuberet med rhodamin-konjugeret phalloidin i 45 minutter i mørke for at farve for F-actin. Celler blev derefter vasket med PBS, kerner modfarvet med 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) og monteret med dækglas til konfokal mikroskopi.

cistanche oplevelse

2,6|Hydroxyapatit-resorptionsassay

For at måle osteoklastaktivitet blev BMM'er (1 × 105 celler pr. brønd) dyrket på kollagenbelagte plader med seks brønde (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) stimuleret med GST-rRANKL (100 ng/ml) og M-CSF (50 ng/ ml) indtil modne osteoklaster blev genereret (Zhou et al., 2016). Celler blev derefter forsigtigt løsnet fra pladen under anvendelse af celledissociationsopløsning (Sigma-Aldrich), og lige mange modne osteoklaster blev podet på individuelle brønde i hydroxyapatit-coatede 96-brøndsplader (Corning Osteoassay, Corning, NY). Modne osteoklaster blev inkuberet i et medium indeholdende GST-rRANKL og M-CSF med eller uden CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)ved de angivne koncentrationer. Efter 48 timer blev halvdelen af ​​brøndene immunhistokemisk farvet for TRAcP-aktivitet som beskrevet ovenfor for at vurdere antallet af multinukleerede celler pr. brønd. De resterende brønde blev bleget i 10 minutter for at fjerne celler og tillade måling af de resorberede områder. Resorberede områder blev fotograferet under standard lysmikroskopi, og Image J-softwaren (National Institutes of Health, Bethesda, MD) blev brugt til at kvantificere det procentvise areal af hydroxyapatitoverflade resorberet af osteoklasterne.

2,7|Luciferase reporter assays

For at undersøge NFATc1-transkriptionel aktivering blev RAW264.7-celler stabilt transficeret med en NFATc1-responsiv luciferase-reporterkonstruktion (Cheng et al., 2018; van der Kraan et al., 2013). Transficerede celler blev dyrket i plader med 48 brønde ved en tæthed på 1,5 × 105 celler pr. brønd og forbehandlet med forskellige koncentrationer af CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)i 1 time. Efter forbehandling blev celler stimuleret med GST-rRANKL (100 ng/ml) i 24 timer, og luciferaseaktivitet blev målt ved hjælp af luciferase reporter assaysystemet i henhold til producentens protokol (Promega).

2,8|Kvantitativ omvendt transkriptionspolymerasekædereaktion (RT-PCR) analyse

Total RNA blev isoleret fra celler under anvendelse af Trizol-reagens i henhold til producentens protokol (Thermo Fisher Scientific). Komplementært DNA blev syntetiseret under anvendelse af Moloney murin leukæmivirus revers transkriptase med 1 ug RNA template og oligo-dT primere. Polymerasekædereaktionsamplifikation af specifikke sekvenser blev udført ved hjælp af følgende program: 94 grader i 5 minutter, efterfulgt af 30 cyklusser på 94 grader i 40 s, 60 grader i 40 s og 72 grader i 40 s, og et sidste forlængelsestrin med 5 min ved 72 grader. Den detaljerede information om specifikke primere er vist i tabel 1. Relative messenger-RNA-niveauer blev beregnet ved normalisering til ekspressionen af ​​husholdningsgenet Hmbs.

2,9|Western blot analyse

BMM'er blev dyrket i komplet medium med M-CSF i seks-brønds plader og stimuleret med GST-rRANKL (100 ng/ml) i de angivne tider. Celler blev lyseret i radioimmunpræcipitationslysebuffer, og proteiner blev opløst ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese og overført til poly(vinylidenfluorid)-membraner (GE Healthcare, Silverwater, Australien). Membranerne blev blokeret i 5 procent skummetmælk i 1 time og derefter probet med forskellige specifikke primære antistoffer under forsigtig rystning natten over ved 4 grader. Membraner blev vasket og efterfølgende inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugerede sekundære antistoffer. Antistofreaktivitet blev derefter påvist med forstærket kemiluminescensreagens (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) og visualiseret med en Image-quant LAS 4000 (GE Healthcare).

2,10|Intracellulær ROS-detektion

Intracellulære ROS-niveauer blev påvist ved hjælp af et 2′,7′‐dichlorfluoresceindiacetat cellulært ROS-detektionsassaykit (Abcam, Melbourne, Australien). BMM'er (5 × 103 celler pr. brønd) blev dyrket i plader med 96 brønde og behandlet med RANKL (100 ng/ml), M-CSF (50 ng/ml) og CDP i 72 timer. Intracellulære ROS-niveauer blev målt ved hjælp af 2',7'-dichlorfluoresceindiacetat, som oxideres til fluorescerende DCF i nærvær af ROS. Celler blev vasket i Hanks buffer og inkuberet i mørke i 30 minutter med 10 µM DCFH-DA. Billeder blev taget ved hjælp af konfokal mikroskopi.

2.11|Statistiske analyser

Alle data er repræsentative for mindst tre eksperimenter udført i tre eksemplarer, medmindre andet er angivet. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. Envejs-variansanalyse efterfulgt af Student-Newman-Keuls post hoc-test blev brugt til at bestemme betydningen af ​​forskelle mellem resultater, hvor p < 0.05="" blev="" betragtet="" som="">

3|RESULTATER

3.1|CDP hæmmer RANKL-induceret osteoklastogenese og osteoklastfusion

For at afgøre, om CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)kan undertrykke RANKL-induceret osteoklastdannelse, udførte vi først et osteoklastogeneseassay ved hjælp af muse BMM'er (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). BMM'er blev behandlet med RANKL og M-CSF i 5 dage med stigende koncentrationer af CDP. CDP reducerede antallet af TRAcP-positive multinukleerede celler, når koncentrationen af ​​CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)nåede 5 µM eller højere (figur 1a,b). At evaluere CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)toksicitet og bekræfte, at disse resultater ikke var en afspejling af celledød eller antal, udførte vi et MTS-assay. BMM'er blev behandlet med RANKL og M-CSF i 48 timer med varierende doser af CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid). CDP havde ingen effekt på BMM-proliferation ved koncentrationen på 15 µM eller mindre (figur 1c).

For at teste virkningerne af CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)ved osteoklastfusion blev osteoklaster induceret med RANKL- og M-CSF-behandling, med eller uden varierende doser af CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid). Osteoklaster blev farvet med rhodamin-phalloidin og DAPI for at vurdere antallet af kerner pr. osteoklast (figur 2a). Både antallet af osteoklaster og det gennemsnitlige antal kerner pr. osteoklast faldt efter CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)behandling (5-10 µM; figur 2b,c). Derfor CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)havde hæmmende virkninger på RANKL-induceret osteoklastogenese og osteoklastfusion på en dosisafhængig måde.

3.2|CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)dæmper RANKL-induceret osteoklastisk hydroxyapatit-resorptionsaktivitet

Et hydroxyapatitresorptionsassay blev udført for at påvise effekten af ​​CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)på osteoklastfunktion (figur 3a). Efter en 24-timers inkubation ændredes antallet af osteoklaster pr. brønd ikke, mens hydroxyapatitresorptionsområdet blev signifikant reduceret ved behandling med 5 og 10 µM CDP sammenlignet med kontrolgrupper (figur 3b, c). Disse resultater viser, at CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)har stærk hæmmende virkning på både osteoklastdannelse og osteoklastresorptionsaktivitet uden nogen cytotoksiske virkninger.

3.3|CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)hæmmer osteoklastmarkørgenekspression

For yderligere at undersøge de hæmmende virkninger af CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)på osteoklastogenese og osteoklastisk knogleresorption blev BMM'er behandlet med RANKL og M-CSF i 5 dage med varierende koncentrationer af CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid). RT-PCR blev derefter udført for at påvise ekspressionen af ​​osteoklastmarkørgener. Ekspressionen af ​​Nfatc1, en afgørende transkriptionsfaktor under osteoklastogenese, blev hæmmet af CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)på en dosisafhængig måde (figur 4a). Derudover CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)(5 og 10 µM) nedregulerede ekspressionen af ​​knogleresorptionsrelaterede gener, herunder Mmp9, Ctsk og Acp5 (figur 4b-d).

3.4|CDP undertrykker NFATc1-aktivitet og nedstrøms proteinekspression

At undersøge effekten af ​​CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)på RANKL-induceret NFATc1-aktivitet blev der udført et luciferase-reporter-assay. Behandling med CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid), ved koncentrationer på 5 µM og højere, hæmmede signifikant RANKL-induceret NFATc1-aktivitet (figur 5a). Derudover viste western blot-analyse, at CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)signifikant undertrykt proteinekspression af NFATc1 og c-Fos i BMM'er behandlet med RANKL og M-CSF i 3 og 5 dage (figur 5b). Desuden blev ekspressionen af ​​osteoklastfunktionsrelaterede proteiner, såsom V-ATPase-d2 og CTSK, nedreguleret i nærvær af CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)sammenlignet med kontrolgrupper. CDP havde imidlertid ingen effekt på RANK-ekspression (figur 5b).

3,5|CDP fremmer ekspressionen af ​​antioxidantenzymer for at fjerne ROS-produktion under RANKL-induceret osteoklastogenese

For at udforske den underliggende mekanisme for CDP-afhængig osteoklastogenesehæmning blev BMM'er behandlet med RANKL (100 ng/ml) og M-CSF (50 ng/ml) sammen med PBS eller CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)i 72 timer. Vi undersøgte effekten af ​​CDP på ​​intracellulær ROS-produktion stimuleret af RANKL. Intracellulære ROS-niveauer blev øget ved RANKL-behandling, som blev svækket af CDP (5 og 10 µM; figur 6a). Både antallet af ROS-positive celler og intensiteten af ​​ROS-farvning blev reduceret ved CDP-behandling på en dosisafhængig måde (figur 6b, c). Western blot-analyse viste, at CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)fremmet thioredoxin (TRX1) og glutathionreduktase (GSR) ekspression, mens ekspressionen af ​​inducerbar nitrogenoxidsyntase (NOS2) undertrykkes i BMM'er, der blev behandlet med RANKL og M-CSF i 3 dage (figur 6d).

For yderligere at undersøge, om CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)undertrykte osteoklastdifferentiering ved at reducere ROS-produktion, behandlede vi derefter BMM'er med peroxid (10 µM) for at efterligne den høje ROS-status i celler. BMM'er blev induceret af RANKL og M-CSF i 3 dage, og resultaterne af western blot-analyse og RT-PCR viste, at peroxid fremmede NFATc1- og c-Fos-ekspression sammenlignet med kontrolgrupperne. I overensstemmelse med resultaterne i figur 5 blev ekspressionen af ​​NFATc1 og c-Fos undertrykt af CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)mens peroxid reddede den hæmmende virkning af CDP (figur 6e,f). Disse data indikerede, at CDP undertrykte ekspressionen af ​​NFATc1 og c-Fos ved at opfange ROS-produktion.

3,6|CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)undertrykker MAPK-veje under RANKL-induceret osteoklastogenese

Dernæst undersøgte vi effekten af ​​CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)behandling på RANKL-medieret TRAF6 ekspression og MAPK pathway aktivering. Efter inkubation i serumfrit medium i 2 timer blev BMM'er stimuleret med RANKL, med eller uden CDP, i 60 min. Stimulering med CDP (10 µM) havde ingen effekt på TRAF6-ekspression og svækket phosphorylering af JNK2 og ERK1/2 efter 10 og 20 minutter (figur 7). Derudover blev p38-phosphorylering signifikant hæmmet af CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)behandling på 60 minutter sammenlignet med kontrolgrupper (figur 7). Disse data afslører, at CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)undertrykker RANKL-inducerede MAPK-signalveje, i overensstemmelse med dets hæmmende effekt på osteoklastdannelse og aktivitet.

4|DISKUSSION

Cistanche, kendt som "ørkenginseng", har på det seneste tiltrukket sig stor opmærksomhed for sin evne til at modulere immunitet og virke beskyttende under aldring og oxidativ stress (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). Phenylpropanoid-substituerede glycosider, de vigtigste aktive komponenter i Cistanche, har vist sig at hæmme NO-aktivitet i makrofager (Ahn, Chae, Chin, & Kim, 2017). Hertil kommer enCistancheekstrakt reduceret oxidativ stress i reperfunderet myokardium efter iskæmi og spillede en væsentlig rolle i hæmningen af ​​apoptotiske veje, der førte til kardiobeskyttelse (Yu, Li, & Cao, 2016). Som en vigtig komponent i Cistanche, CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)har en række farmakologiske funktioner. Vores nuværende undersøgelse viste, at CDP undertrykte RANKL-aktiveret osteoklastdifferentiering og aktivering ved at dæmpe ROS-produktion samt NFAT- og MAPK-aktivering.

Som en sur phosphatase findes TRAcP i en række forskellige celler og er rigeligt i osteoklaster og alveolære makrofager (Snipes, Lam, Dodd, Gray & Cohen, 1986). TRAcP er et karakteristisk enzym for osteoklaster, og dets ekspression er tæt relateret til osteoklastfunktionen, betragtet som en indikator for osteoklastaktivitet og knogleresorption (Minkin, 1982). I vores undersøgelse, CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)hæmmede antallet af TRAcP-positive celler, hvilket indikerer, at RANKL-induceret osteoklastogenese blev blokeret af CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid). Nedbrydning af knoglematrix af osteoklaster afhænger af cathepsin K (CTSK) og MMP'er (Gruber, 2015). Her nedregulerede CDP signifikant ekspressionen af ​​osteoklastfunktionelle gener såsom Mmp9, Ctsk og Acp5.

Osteoklastdifferentiering og funktion reguleres af flere signalveje (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). Efter binding til RANK rekrutterer RANKL adapterprotein TRAF6 for at aktivere ekspressionen af ​​NFATc1, som er en vigtig transkriptionsfaktor for osteoklastdannelse, der påvirker osteoklastspecifik genekspression, herunder TRAcP og CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). I denne undersøgelse fandt vi, at CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)havde ingen effekt på RANK og TRAF6 ekspression i osteoklaster. Dog CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)hæmmede RANKL-induceret NFATc1-aktivering under osteoklastogenese af BMM'er. Desuden blev det påvist, at ROS, produceret af mitokondrier i processen med at levere elektroner, fremmede proliferation og differentiering af osteoklaster og regulerede knoglematrix-nedbrydning (Ha et al., 2004). En nylig undersøgelse viste, at RANKL inducerede Bach1-kerneimport og svækkede Nrf2-medieret antioxidantenzymproduktion, og derved øgede intracellulær ROS-ekspression og osteoklastogenese hos mus (Kanzaki et al., 2017). Derudover øgede øget intracellulær ROS-generering af homocystein osteoklastdannelse og aktivitet (Koh et al., 2006). Vores undersøgelse viste, at CDP reducerede ROS-akkumulering i osteoklaster ved at hæmme NOS2-ekspression og fremme ekspressionen af ​​antioxidantenzymer, såsom TRX1 og glutathionreduktase. Da vi behandlede BMM'er med peroxid for at øge intracellulær ROS-akkumulering, viste resultaterne, at øget ROS kunne forbedre NFATc1-ekspression, at ROS var opstrøms for NFATc1. Vi fandt også, at peroxid reddede den hæmmende effekt af CDP på ​​NFATc1-ekspression. Så vores data tyder på, at CDP undertrykker ROS-akkumulering for at hæmme NFATc1-ekspression og derefter undertrykke osteoklastdannelse og -funktion.

ERK, JNK og p38 tilhører MAPK-familien, som også er involveret i reguleringen af ​​osteoklastdifferentiering (Seger & Krebs, 1995). RANKL aktiverer MAPK-vejen ved at øge phosphoryleringen af ​​ERK, JNK og p38 (Mizukami et al., 2002). Vi demonstrerede, at CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)undertrykte den RANKL-medierede phosphorylering af nøgleproteiner i MAPK-vejen og bidrog derved til den hæmmende effekt af CDP på ​​ekspressionen af ​​osteoklastmarkørgener. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse, der viser de hæmmende virkninger af CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)på ROS-produktion, NFAT og MAPK-aktivering, der repræsenterer nye virkningsmekanismer for CDP in vitro.

Sammenfattende viste vi, at CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)dæmper osteoklastogenese og hydroxyapatitresorption og ekspressionen af ​​osteoklastmarkørgener inklusive Ctsk, Mmp9 og Acp5. CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)var i stand til at undertrykke RANKL-medieret ROS-produktion samt NFAT- og MAPK-aktivering (figur 8). Samlet tyder vores resultater på, at CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)kan repræsentere et kandidatlægemiddel til behandling af osteoklast-relaterede tilstande ledsaget af ROS-overproduktion.

FIGUR 8 Skematisk diagram af CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)funktion i osteoklastdifferentiering. CDP(Cistanchedeserticolapolysaccharid)undertrykker RANKL-induceret ROS-produktion samt NFATc1- og MAPK-aktivering, hvilket hæmmer osteoklastogenese. CDP,Cistanchedeserticolapolysaccharid; MAPK, mitogenaktiveret proteinkinase; NFATc1, nuklear faktor af aktiveret T-celle; RANKL, receptoraktivator af nuklear faktor KB-ligand; ROS, reaktive oxygenarter [Farvefigur kan ses på wileyonlinelibrary.com]

ANKENDELSER

Denne undersøgelse blev støttet af Nature Science Foundation of China (81572164), Kinas nationale nøgleteknologiforsknings- og udviklingsprogram (2017YFC1103300), Natural Science Foundation i Guangxi-provinsen (2016GXNSFAA380295) og University Science and Technology Research Project i Guangxi Provins (KY2015YB054). Det er også delvist støttet af Guangxi Scientific Research and Technology Development Plan Project (GKG13349003, 1598013‐15), Western Australia Medical & Health Research Infrastructure Fund, Arthritis Australia Foundation, University of Western Australia (UWA) Research Collaboration Awards og Australian Health and Medical Research Council (NHMRC, nr. 1107828 og 1027932).

INTERESSEKONFLIKT

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter

Fra: 'Cistanchedeserticolapolysacchariddæmper osteoklastogenese og knogleresorption via inhibering af RANKL-signalering og produktion af reaktive oxygenarter af Dezhi Song et al.

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018;233:9674-9684