In Silico-design af en promiskuøs kimærisk multi-epitopvaccine mod mycobacterium tuberculosis del 2

 2.15. Oversigt over multi-epitopvaccinedesignet

Fig. 1 opsummerede det overordnede koncept for dette multi-epitopvaccinedesign. Kort fortalt analyserede vi antigeniciteten af ​​M. tuberculosis-proteiner opnået fra IEDB og udvalgte otte antigene kandidater til multi-epitopvaccinekonstruktion under hensyntagen til deres funktionelle klassificering og subcellulære lokalisering. Derefter forudsagde vi de antigene epitoper af disse otte proteiner og udvalgte 15 CTL-epitoper, 16 HTL-epitoper og 10 B-celleepitoper, som yderligere var forbundet til HBHA-adjuvans og PADRE gennem egnede linkere. Desuden forudsagde vi antigenicitet, allergenicitet, fysisk-kemiske egenskaber og immunogene profil af den designede multi-epitopvaccine. I mellemtiden forudsagde vi også de sekundære og tertiære strukturer af vaccinen og analyserede dens potentielle interaktion med TLR4-immunreceptor.

Mycobacterium tuberculosis er et almindeligt patogen, der forårsager tuberkulose. Mycobacterium tuberculosis protein er en af ​​hovedkomponenterne i Mycobacterium tuberculosis, som er meget kritisk for funktionen af ​​det menneskelige immunsystem.

Mycobacterium tuberculosis protein kan aktivere det menneskelige immunsystem og styrke kroppens immunitet. Når kroppen er inficeret af Mycobacterium tuberculosis, vil det menneskelige immunsystem producere en række immunresponser, herunder aktivering og spredning af specifikke T-celler og B-celler. Disse celler kan frigive en række forskellige immunfaktorer, såsom interferon, interleukin osv., samt antistoffer til at hjælpe kroppen med at modstå den invaderende Mycobacterium tuberculosis.

Derudover kan Mycobacterium tuberculosis-proteinet også regulere immunsystemets balance og undgå immunskader forårsaget af overdreven aktivering af kroppens immunrespons. I de senere år har forskningen og udviklingen af ​​tuberkulosevacciner også hovedsageligt fokuseret på anvendelsen af ​​Mycobacterium tuberculosis-protein, som kan øge immuniteten i det menneskelige immunsystem gennem vaccination og effektivt forhindre forekomst og spredning af tuberkulose.

Derfor er Mycobacterium tuberculosis-proteinet meget vigtigt for effekten af ​​menneskelig immunitet. Ved aktivt at styrke immunforsvaret, gennem ordentlig motion og fornuftig ernæring, kan du bedre forebygge tuberkulose og andre infektionssygdomme og bevare et godt helbred. Fra dette synspunkt er vi nødt til at forbedre vores immunitet. Cistanche kan forbedre immuniteten markant, fordi polysacchariderne i kød kan regulere immunresponsen i det menneskelige immunsystem, forbedre immuncellernes stressevne og forbedre immuncellernes immunitet. Baktericid effekt.

Klik cistanche deserticola supplement

3. Resultater

3.1. Genfinding af M. tuberculosis-proteiner til multi-epitopvaccinekonstruktion

For at konstruere en multi-epitopvaccine mod TB analyserede vi først antigeniciteten af ​​proteiner i M. tuberculosis H37Rv. I alt 492 proteiner med validerede immunologiske egenskaber blev opnået fra IEDB-databasen, hvoraf 402 proteiner (81,70 procent) blev forudsagt at være antigene. Til den funktionelle karakterisering af disse 492 proteiner blev 353 beriget i DAVID-databasen, mens 139 ikke var det. Lokaliseringsanalyse viste, at 97 af de 353 berigede proteiner var lokaliseret i det ekstracellulære rum, rummet uden for celleoverfladen. Proteiner lokaliseret i det ekstracellulære rum inkluderer ydre membranproteiner og udskilte proteiner.

Blandt de 97 proteiner er 49 sekretionsproteiner. Yderligere berigelse af 49 udskilte proteiner afslørede, at fem proteiner blev udskilt til det ekstracellulære rum, og fem var nødvendige for patogenese (eksperimentelt valideret af BioCyc) [48]. Når disse ti proteiner blev justeret med de samlede proteiner af H. sapiens, var to proteiner (Mpt83 og Mpt70) desuden meget lig H. sapiens-proteiner. Derfor blev de resterende otte proteiner, der ikke ligner H. sapiens-proteiner (tabel 1), betragtet som endelige kandidater til konstruktionen af ​​en multi-epitopvaccine.

3.2. Forudsigelse af T-celle- og B-celle-epitoper af kandidatproteiner

Før epitopforudsigelse blev signalpeptider identificeret og deleteret fra kandidatproteiner. I alt 623 CTL-epitoper fra otte kandidatproteiner med 135 stærke bindere (16 af A1, 40 af A2, 22 af A3, 19 af A24 og 38 af B7-supertyper af MHC klasse I) blev forudsagt af NetMHCpan{{12} }.1 server (fig. 2A, B). Blandt de 135 stærke bindere var 36 både antigene og immunogene. Til sidst valgte vi 15 ud af 36 CTL-epitoper i henhold til følgende kriterier: tre epitoper pr. supertype og mindst en pr. kandidatprotein (Bemærk: EsxA havde ingen stærk binder, der var både antigen og immunogen) (tabel 2).

Desuden forudsagde vi deres HTL-epitoper (MHC klasse II-epitoper). {{0}}mere epitoper fra fire alleler (HLA_DRB, HLA_DP, HLA_DQ og H-2-I) med en procentvis rangering Mindre end eller lig med 2.0 blev betragtet som stærke bindemidler og rangeret fra den laveste til den højeste score. HLA-DR-allelerne havde det højeste antal MHC II-bindere (2990), mens HLA-DP havde det mindste (601) (fig. 2C, D). Det skal bemærkes, at immunresponset i granulomatøse lidelser såsom tuberkulose, spedalskhed og sarkoidose domineres af IFN-producerende T-hjælper-1 (Th1) celler [97]. Derudover afslørede tidligere rapporter, at ekspressionen af ​​Th1-cytokiner (IFN- og IL2) faldt hos tuberkulosepatienter [98]. For at stimulere Th1-celler forudsagde vi derfor 15-mer IFN- --inducerende peptider af disse proteiner. I alt 534 epitoper med IFN-inducerende aktivitet blev forudsagt under anvendelse af NetMHCIIpan 4.0, hvoraf 315 epitoper er antigene. Af disse 315 epitoper viste 103 stærk bindingsaktivitet til mindst én HLA-allel.

Polymorfi i HLA-alleler resulterer også i allelvariation, hvilket fører til vidt forskellige peptidbindingsspecificiteter [55]. Som et resultat valgte vi én epitop med den stærkeste bindingsaktivitet (den mest promiskuøse epitop) fra hver af de otte kandidatproteiner. Derudover blev de resterende 95 epitoper rangeret baseret på bindingsstyrke, og derefter blev yderligere otte epitoper udvalgt med et maksimum på to epitoper pr. kandidatprotein. Endelig valgte vi 16 ud af 103 HTL-epitoper i henhold til følgende kriterier: mindst én epitop og maksimalt tre epitoper pr. kandidatprotein, stærkeste bindingsaktivitet pr. kandidatprotein og mest antigene og IFN-inducerende. Vi brugte dem derefter til at konstruere denne multi-epitopvaccine (tabel 2).

Hvad angår lineær B-celle epitop forudsigelse, blev to servere (BepiPred2.0 og ABCpred) brugt, og 166 epitoper blev opnået. Vi forudsagde antigeniciteten af ​​de fem øverste epitoper for hvert protein og udvalgte derefter ti antigene epitoper (16-mer, mindst én fra hvert kandidatprotein) (tabel 2).

3.3. Multi-epitop vaccine konstruktion

Til multi-epitop-vaccinekonstruktion blev HBHA, PADRE, 16 HTL (15-mer), 15 CTL og 10 lineære B-celle (16-mer) epitoper forbundet via passende linkere og forsynet med en His × 6 tag (fig. 3). Adjuvanser er vigtige komponenter i vacciner, der kan booste medfødte og adaptive immunresponser [99]. Mange proteiner fra M. tuberculosis har adjuvansegenskaber og er blevet brugt til at designe vacciner [17,27,87,100-105]. En af de mest anvendte er HBHA [100-105], som er et potent immunstimulerende middel, der inducerer modning af dendritiske celler (DC'er) gennem TLR4-behandling [105,106]. DC'er behandlet med HBHA har vist sig at aktivere naive T-celler, polarisere CD4 plus og CD8 plus T-celler for at udskille IFN- og inducere T-celle-medieret cytotoksicitet [47].

I denne undersøgelse placerede vi HBHA som en proteinadjuvans ved N-terminalen, fordi den er egnet til at starte syntesen af ​​vaccinekonstruktionen fra HBHA, et naturligt forekommende protein. HBHA er tidligere blevet placeret i N-terminalen af ​​nogle multiepitopvacciner som en adjuvans [105,107]. Ud over adjuvanser kan PADRE, som er sikkert for mennesker, signifikant forbedre vaccinens immunogenicitet, fordi det binder med høj affinitet til multiple muse- og humane MHC-II-alleller med høj affinitet til at inducere Th-celle-medierede responser [47,62]. HBHA og PADRE blev forbundet med en spiralformet PEAK-linker, som giver stivhed, mens de to proteinkomponenter adskilles for at øge effektiviteten og reducere interferens. Yderligere stabiliserede en Glu-Lys-saltbro dannet i segmenterne linkeren.

Da PADRE kan øge aktiviteten af ​​vaccine-HTL-epitoper [54], placerede vi de 16 HTL-epitoper efter PADRE. GPGPG-linkeren blev brugt til at forbinde HTL-epitoper til hinanden og til PADRE, da det letter immuncelleprogression og epitoppræsentation [108,109]. Desuden inducerer GPGPG HTL-immunrespons, som kan forstyrre junctional immunogenicitet og genoprette immunogeniciteten af ​​individuelle epitoper efter behandling [108].

For de 15 CTL-epitoper blev den individuelle epitop forbundet med en AAY-linker, som hjælper epitopen med at producere egnede steder til at binde til TAP-transportøren og forbedre epitoppræsentationen [47]. Ydermere blev hele CTL-epitopunderenheden koblet til opstrøms HTL-epitoper via HEYGAEALERAG-linkeren, der har fem passende spaltningssteder (A7-L8, A5-E6, Y3-G4, R 10-A11 og L8-E9) afgørende for eukaryote proteasomale og lysosomale nedbrydningssystemer. I eukaryoter er proteasomer og lysosomer det vigtigste proteolytiske maskineri, som udnytter henholdsvis ubiquitin-proteasomsystemet (UPS) og autofagi-vejen [110].

HEYGAEALERAG-linker blev også brugt til at binde CTL-epitopunderenheden til de 10 nedstrøms lineære B-celleepitoper bundet sammen af ​​KK-linkere. Ifølge tidligere undersøgelser forhindrer KK-linkeren induktionen af ​​antistoffer i aminosyresekvensen som følge af kombinationen af ​​de to peptider og letter derved den specifikke visning af hvert peptid til antistoffet [111]. Til sidst blev et His×6-mærke fastgjort til C-terminalen af ​​den sidste lineære B-celleepitop til efterfølgende oprensning og karakterisering af vaccinen (fig. 3).

Det endelige kimære protein består af 933 aminosyrerester, startende med HBHA-adjuvans, efterfulgt af 41 epitoper og slutter med et His×6-mærke (fig. 3). Da dette kimære protein er sammensat af multi-epitop-antigener fra otte proteiner, kaldte vi det MTBV8, multi-epitop TB-vaccinen afledt af 8 kandidatproteiner.

3.4. Analyse af antigenicitet, allergenicitet og fysiokemiske parametre for MTBV8

Tidligere undersøgelser har vist, at antigenicitet er påkrævet for humane vacciner for at fremkalde humorale immunresponser, hvilket fører til dannelsen af ​​hukommelsesceller rettet mod epitoper af infektiøse stoffer [112]. Derfor forudsagde vi antigeniciteten af ​​multi-epitopvaccinen MTBV8 ved hjælp af VaxiJen 2.0-serveren og opnåede en antigenicitet på 0.97, hvilket er signifikant højere end tærskelværdien ({{7} }.4) [45,46] for at et bakterieprotein kan anses for antigent. MTBV8 var især mere antigent end alle komponentproteiner (fig. 4), hvilket tyder på, at det effektivt kunne stimulere værtens immunrespons

Desuden er mange mikrobielle makromolekyler blevet rapporteret at have potentialet til at inducere overfølsomhedsreaktioner hos mennesker [113]. For at analysere overfølsomhedsproblemet med MTBV8 og de otte proteiner, der består af, forudsagde vi deres allergenicitet ved hjælp af AllerTOP 2.0-serveren. To af de otte komponentproteiner (LprA og EspC) blev forudsagt at være allergener (tabel 1). Det skal bemærkes, at selvom den designede multi-epitopvaccine (MTBV8) indeholdt ti epitoper opnået fra disse to proteiner, blev den forudsagt at være ikke-allergisk, hvilket indikerer, at denne vaccine er sikker.

For yderligere at karakterisere MTBV8 analyserede vi dens fysisk-kemiske egenskaber gennem ExPASy ProtParam-serveren. Det rekombinante protein har en molekylvægt på 94,84 kDa og et isoelektrisk punkt på 8,91. Desuden blev proteinet betragtet som stabilt med et beregnet ustabilitetsindeks (II) på 26,44 (proteiner med et ustabilitetsindeks > 40 blev betragtet som ustabile) [64]. Den estimerede in vitro halveringstid er 30 timer i pattedyrs retikulocytter, længere end in vivo 20 timer i gær og in vivo 10 timer i E. coli. Derudover var det alifatiske indeks for MTBV8 71,91, og den samlede gennemsnitlige værdi af hydrofilicitet (GRAVY) var -0,32, hvilket indikerer, at det rekombinante protein var hydrofilt. Endelig var den proportionale opløselighedsværdi for MTBV8 (0,54) større end gennemsnittet for populationsdatasættet (0,45), hvilket indikerer, at vaccinekandidaten var mere opløselig end halvdelen af ​​E. coli-proteinerne [114]. Ovenstående resultater indikerede, at MTBV8 har gode fysiske og kemiske egenskaber og er velegnet til brug som vaccine.

3.5. Immunogen profil af MTBV8

For at vurdere immunogenicitetsprofilen for MTBV8 analyserede vi immunresponserne i silico via C-IMMSIM immunserveren. Som vist i fig. 5A var IgM- og IgG1-titerne væsentligt forøget efter sekundær immunstimulering med MTBV8. Desuden steg niveauet af aktive B-celler og forblev på et højt niveau efter hver immunisering (fig. 5B). Selv for B-celler i plasma forblev B-isotyperne IgM og IgG1 høje efter immunisering (Supplerende Fig. 1A, B). Hvad angår virkningen på T-celler, steg niveauerne af Th-hukommelsesceller (y2) (Supplerende Fig. 1C) og aktive Th-celler (Fig. 5C) hurtigt efter primær immunisering og blev signifikant forstærket efter sekundær immunisering. Regulatoriske T-celler (primært aktive celler) blev stimuleret ved initial immunisering og faldt derefter hurtigt (Supplerende Fig. 1D). Interessant nok steg niveauet af aktive cytotoksiske T (Tc)-celler hurtigt efter primær immunisering, forblev højt i den anden immunisering og faldt derefter støt, hvorimod hvilende Tc-celler viste den omvendte tendens til aktive Tc-celler (fig. 5D). I modsætning hertil forblev niveauerne af anergiske (y2) Tc-celler (fig. 5D) og hukommelses-Tc-celler (supplerende fig. 1E) uændrede efter immunisering. Derudover skal det bemærkes, at niveauerne af immunfaktorerne IFN- og IL-2 udskilt af T-celler, som er kritiske for immunresponset mod M. tuberculosis [115] også steg signifikant efter MTBV8-immunisering (fig. 5E).

Desuden forudsagde vi effekten af ​​MTBV8-vaccination på medfødte immuncellepopulationer (fig. 5F og supplerende fig. 1FH). Præsenterende -2 celler i DC'er og makrofager steg hurtigt efter den første immunisering, hvorimod kun en lille stigning blev observeret efter den anden immunisering (fig. 5F og supplerende fig. 1G). I makrofager resulterede den første immunisering desuden i en samtidig stigning eller reduktion af aktive og hvilende makrofager. Et par uger efter den anden immunisering faldt aktive makrofager hurtigt, mens hvilende makrofager steg hurtigt. (Supplerende Fig. 1G). Navnlig udviste naturlige dræberceller og aktive epitelcellepopulationer et ret konstant mønster ved immunisering. (Supplerende Fig. 1F, H). Tilsammen antydede disse forudsigelser, at MTBV8 potentielt kan stimulere både medfødte og adaptive immunresponser, hvilket gør det til en potentielt effektiv vaccinekandidat.

3.6. Forudsagte sekundære og tertiære strukturer af MTBV8

For bedre at karakterisere MTBV8 forudsagde vi dens sekundære og tertiære strukturer, efterfulgt af raffinering af dens tertiære struktur. Den sekundære struktur af MTBV8 bestod af 42,12 procent helixer, 11,79 procent tråde og 46,09 procent spoler (Supplerende Fig. 2). Ifølge DISOPRED3 forudsigelser var 27,11 procent af aminosyrerester forstyrrede.

Den tertiære struktur af MTBV8 blev forudsagt af I-TASSER-serveren, og 5 modeller med gode C-scores blev opnået. C-score er mellem −5.0 og 2.0 og er proportional med forudsigelsens pålidelighed. Disse modeller blev udsat for ProSA-webanalyse og model 4 blev valgt på grund af følgende karakteristika; C-score=−3,8, Z-score=−4,4. Ramachandran-plotanalyse af denne tertiære struktur viste, at mindre end 70,0 procent af resterne var i foretrukne regioner, og derfor er yderligere forfining af den tertiære struktur påkrævet.

Den tertiære struktur opnået af I-TASSER blev forfinet af ModRefiner-serveren, efterfulgt af GalaxyRefine-serveren for at generere fem modeller. Blandt de fem raffinerede modeller havde model 2 den bedste struktur, når man betragtede følgende parametre: Global distancetest høj nøjagtighed (0.89), RMSD (0.58), MolProbity (2.31), clash score (14,8), dårlig rotamer-score ({{10}}.80) og Ramachandran-plotscore (86,5 procent) (fig. 6A). Ramachandran-plotanalyse af denne struktur under anvendelse af PROCHECK viste, at af de 753 ikke-glycin-, ikke-prolin- og ikke-terminale rester var 78,9 procent af dem i den mest gunstige region [A, B, L], 17,3 procent var i yderligere tilladte område [a, b, l, p] og 1,5 procent i det generelt tilladte område [-a, ~b, ~l, ~p], med kun 2,4 procent i det ikke-tilladte område (fig. 6B). Da vi analyserede Ramachandran-plottet af den raffinerede struktur ved hjælp af Molprobity, fandt vi, at 86,5 procent af aminosyreresterne var lokaliseret i den gunstige region, hvilket var det samme som opnået af GalaxyRefine-serveren (fig. 6C). . Endvidere var 98,0 procent af resterne i det tilladte område, mens 19 rester var outliers (phi, psi) (fig. 6C). Selvom den raffinerede model har flere rester i den foretrukne region sammenlignet med modellen genereret af I-TASSER, har den brug for yderligere validering.

Modelvalidering er et nøgletrin i modelbygningsprocessen, da det kan identificere potentielle fejl i forudsagte 3D-modeller [116]. For at validere den raffinerede model af MTBV8 blev der udført ProSA-web og ERRAT analyser. ProSA-webanalyse viste en Z-score på -5,76 for MTBV8 (fig. 6D), hvilket var lidt uden for det eksperimentelt bestemte område af score for proteiner af lignende størrelse. ERRAT-analyse viste dog en samlet kvalitetsfaktor på 70,94 for raffineret MTBV8. Da en ERRAT-score større end 50 repræsenterer en god kvalitetsmodel [117], indikerede en score på 70,94, at vi har høj tillid til den modellerede struktur til efterfølgende analyse.

3.7. Molekylær docking af MTBV8 med immuncellereceptorer

Den stærke affinitet af vacciner til immuncellereceptorer frembringer et stabilt immunrespons [118]. For at få indsigt i de potentielle interaktioner mellem MTBV8 og immuncellereceptorer udførte vi molekylær docking mellem MTBV8 og immunreceptoren TLR4 (fig. 7A og B). Tidligere undersøgelser har vist, at TLR4-ligander kan aktivere DC'er, som igen aktiverer naive T-celler, effektivt polarisere T-celler (CD4 plus og CD8 plus celler) til at udskille IFN- og inducere T-celle-medieret-cytotoksicitet [106]. Disse processer ville føre til en stigning i puljen af ​​effektorhukommelsesceller [119]. Da interaktionen af ​​TLR4 med antigene peptider fører til responser mod TB-infektion, fokuserede vi på interaktionerne mellem MTBV8 og TLR4 (fig. 7A). Molekylær docking-resultater fra Firedock viste, at den mest foretrukne raffinerede model havde en global energi på -40,28, en attraktiv van der Waals-energi (aVdW) på -19.86, frastødende energi (rød) på 2.19, en atomkontaktenergi på 4,70 og et bidrag af hydrogenbinding (HB) på - 1,03 (fig. 7B). Derudover forudsagde Prodigy bindingsenergi mellem TLR4 og MTBV8 på -8,6 kcal/mol. Resultaterne ovenfor indikerede, at MTBV8 har en stærk affinitet til TLR4, hvilket gør det muligt for det at generere et stabilt immunrespons.

3.8. Molekylær dynamik simulering

Den molekylære dynamiske simulering blev brugt til at analysere bevægelsen af ​​atomer i vaccinen [120]. Hovedkædedeformerbarhed afslører i hvilken grad et molekyle kan deformeres ved hver bestanddel. Områder med høj deformation indikerede positionen af ​​kæde-"hængslet" (fig. 7C), og den eksperimentelle B-faktor blev opnået fra den tilsvarende PDB-databank, mens beregningen blev udført ved at gange NMA-mobiliteten med 8pi^2 (fig. 7D ). Egenværdien tildelt til hver normal tilstand er et mål for bevægelsesstivhed, som er direkte relateret til deformationsenergien af ​​hele strukturen. Egenværdien er direkte proportional med den lette deformation (fig. 7E). Variansen af ​​hver normal tilstand er omvendt proportional med egenværdien. Individuelle varianser er farvet i brunt, mens kumulative varianser er farvet i grønt) (Fig. 7F). I kovariansmatrixen er der kobling mellem par af rester, og korrelerede (røde), ukorrelerede (hvide) og anti-korrelerede (blå) bevægelser blev vist (fig. 7G). Elasticitetsnetværket repræsenterede par af atomer forbundet med fjedre, og hver prik repræsenterede en fjeder mellem tilsvarende par af atomer. Farven på prikkerne betegnede deres stivhed; mørkere grå prikker illustrerer stivere fjedre og omvendt (fig. 7H). Molekylær dynamik-simuleringer ved hjælp af iMODS-serveren antydede, at dockingkomplekset mellem MTBV8 og TLR4 var stabilt.

3.9. In silico optimering og kloning af MTBV8

Proteinsyntese er en forudsætning for dens aktivitet [121]. I overensstemmelse hermed er øget transkriptionel og translationel effektivitet af vaccinen nødvendig for dens overekspression i E. coli-celler via et selvreplikerende plasmid pET28a( plus ) [103]. Dets optimering blev opnået ved hjælp af Codon Adaptation Index (CAI) på 0,99 og et GC-indhold (54,81 procent) mellem 30 procent og 70 procent, som generelt anses for at være gunstige for proteinekspression i værten. DNA-fragmentet af mtbv8 kunne klones ind i en pET-28a(plus)-vektor mellem NcoI- og XhoI-restriktionsstederne ved hjælp af SnapGene til at generere et pET-28a(plus)-mtbv8-rekombinant plasmid (Supplerende Fig. .3).

4. Diskussion

4.1. Fremkomsten af ​​multi-epitopvacciner mod tuberkulose

Vaccination er den mest pålidelige måde at bekæmpe tuberkuloseinfektion på. I mange år har videnskabsmænd identificeret adskillige lovende vaccinekandidater, der kunne erstatte BCG, den eneste godkendte TB-vaccine [8100,122-125]. For nylig har rekombinante TB-vacciner fået stigende opmærksomhed. Adskillige rekombinante vacciner har vist effektivitet i prækliniske og kliniske forsøg, herunder ID93/GLA-SE bestående af fire vaccinekandidater Rv2608 (PE/PPE-familie), Rv1813 (udtrykt under stress/hypoxi), ESXV og ESXW, som er lovende i mus præklinisk forsøg [122]. Til kliniske forsøg var GamTBvac, opnået ved at fusionere Ag85a og ESAT6-CFP10, vellykket i fase I forsøg [125], mens M72, bestående af to kandidater [Mtb39A (PPE18) og Mtb32A], gav betydelig styrke i fase II forsøg [123].

Succesfulde forsøg med disse rekombinante vacciner indikerer den større styrke af epitopbaserede vacciner, der simpelthen inkorporerer de immunologiske egenskaber af forskellige kandidatproteiner i et syntetisk protein [124]. Navnlig er adskillige TB-underenhedsvacciner blevet afledt af et stort antal vaccinekandidater, og de er dukket op som potentielt attraktive kandidater i dyremodelstudier [100]. For eksempel inducerede MP3RT, en multiepitop peptid TB-vaccinekandidat bestående af seks immunogene HTL-peptider, signifikant højere niveauer af IFN- og CD3 plus IFN- plus T-lymfocytter og lavere kolonidannende enheder (CFU'er) i lungerne og milten hos humaniserede mus end vildtype mus [8]. Fremadrettet har forskningen for større styrke i disse vacciner ført til en berigelse af potentielle proteinkandidater.

Yderligere er proteiner udskilt af M. tuberculosis også blevet overvejet i designet af MTBV8 (tabel 1), fordi de er vigtige for TB patogenese og virulens [126]. Derudover kan nogle udskilte proteiner i de ydre lag af M. tuberculosis-celler tjene som nyttige antigener. For eksempel er EsxA og EsxB blevet oprenset fra kapslen af ​​M. tuberculosis [127], og tilbageholdelse af EsxA i kapslen er blevet impliceret i cytotoksicitet [128]. Derudover er EsxA påkrævet for bakteriel cellevægsintegritet [129]. Samlet set har udskilte proteiner tilstrækkeligt eksponerede overflader, således at de er mål for værtsimmunresponser [130,131].

4.2. Potentiel stimulering af det medfødte immunsystem ved MTBV8

Screening for en epitop i kandidatproteiner involverer aktivering af det medfødte immunsystem efterfulgt af antigengenkendelse af lymfocytter, fordi begge faktorer er nødvendige for den efterfølgende aktivering af det adaptive immunsystem [50]. For den medfødte respons er dannelsen af ​​et stabilt kompleks mellem MTBV8 (hjulpet af TLR4-stimulatoren HBHA som en adjuvans) og TLR4 af DC'er (fig. 5F) vigtig, fordi TLR4-ligander kan aktivere DC'er og aktiverede DC'er kan igen aktivere naive T-celler, polariserer effektivt CD4 plus og CD8 plus T-celler for at udskille IFN- og inducerer T-celle-medieret cytotoksicitet [106] og efterfølgende øget pool af effektorhukommelsesceller [119].

Dette kompleks bidrog sandsynligvis til stigningen i hukommelsescellepopulationen (y2) i B-lymfocytter (Supplerende Fig. 1A) og Th-lymfocytter (Supplerende Fig. 1C) sammenlignet med ikke-hukommelsesceller. Immunstimulering med MTBV8 er sammenlignelig med den opnået med andre multiepitopvacciner mod TB [33,37,39] og andre sygdomme [27,62,107,124,132]. Dette antydede konsistensen af ​​multi-epitopvaccinemekanismen.

4.3. Potentiel stimulering af adaptivt immunsystem ved MTBV8

B- og T-lymfocytter er de primære effektorceller, der koordinerer adaptive immunresponser gennem humoral eller cellemedieret immunitet ved at genkende dele af invaderende patogener, kaldet antigener [50]. For at inducere et humoralt adaptivt immunrespons inkorporerede vi højscorende B-celleepitoper (tabel 2) til genkendelse og ødelæggelse af antistoffer udtrykt og udskilt af B-lymfocytter [50,133]. Vaccinestimulering af aktive B-lymfocytter (fig. 5B), mest IgM- og IgG1--udskillende B-celler (supplerende fig. 1A), kan resultere i overdreven sekretion af IgM og IgG1 (fig. 5A).

Vaccinens høje antigenicitet (fig. 4) kan have vigtige implikationer for at forstærke antistofreaktioner (fig. 5A). Faktisk er cellemedierede immunresponser meget afhængige af T-cellers evne til at genkende antigener [134]. For at opnå dette valgte vi stærke antigene og stærke MHC-bindende CTL- og HTL-epitoper (tabel 2), som forbedrede peptid: MHC-kompleks (pMHC) stabilitet, som er nøglefaktoren, der kontrollerer MHC-peptidimmunogenicitet [135] og spiller en rolle i priming af CD8 plus og CD4 plus T-celler af DC'er, hvilket fører til T-lymfocytresponser (Fig. 5C, Supplerende Fig. 1C) [136].

Inkorporeringen af ​​passende linkere og syntetiske oligopeptider (PADRE og HEYGAEALERAG) og præcis placering af hver komponent kunne lette epitopprocession og præsentation (fig. 3). På grund af allelvariation blandt mennesker valgte vi CTL-epitoper baseret på genkendelse af MHC-I-alleler af større menneskelige racer Supplerende tabel 1 (tabel 2), og promiskuøse HTL-epitoper blev udvalgt efter screening for IFN-inducerende egenskaber og antigenicitet.

4.4. Udviklingsmulighederne for MTBV8

Dette in silico-vaccinedesign er en relevant indikator i screeningsfaserne med hensyn til syntese og effektivitet af kandidatvacciner. Til syntese afslørede vores forudsigelser, at det kan syntetiseres i E. coli-systemet, men andre systemer såsom insekt- og pattedyrceller kunne også overvejes, hvis E. coli-baserede systemer giver vanskeligheder. Våd laboratorievalidering er næste trin i bekræftelsen af ​​vaccinekandidater efter i silico-undersøgelser. Denne metode er faktisk blevet brugt effektivt i nogle vaccinekandidater, som også først blev designet i silico og senere viste sig at være effektive i den eksperimentelle fase [137].

5. Konklusion

En vigtig støtte til WHO's mål for bæredygtig udvikling for fuldstændig udryddelse af TB er adgang til en potent vaccine til at forhindre M. tuberculosis-infektion. Tidligere undersøgelser har vist, at kimære multi-epitopvacciner kan udnytte de immune/antigeniske egenskaber af visse proteiner til at øge immuneffektiviteten. I denne undersøgelse brugte vi en in silico-tilgang til at designe en kimærisk vaccine (MTBV8) ved at integrere 41 promiskuøse epitoper afledt af otte antigene proteiner udskilt af M. tuberculosis H37Rv. MTBV8 blev forudsagt at være stabil, opløselig, sikker, meget antigen og immunogen.

Immuno-informatikanalyse viste, at MTBV8 udviste god affinitet for den vigtigste immuncellereceptor TLR4. Det er vigtigt, at vaccinationsstimulering af MTBV8 signifikant kan øge niveauerne af B-celler, T-celler og medfødte immuncellepopulationer og stimulere produktionen af ​​immunglobuliner (IgG1, IgM osv.) samt immunfaktorer (IFN-, IL{{6) }}, etc). Tilsammen er multi-epitopvaccinen MTBV8 en relevant indikator i designfasen af ​​anti-TB-vacciner og kan blive en potentiel hjørnesten i realiseringen af ​​'The End TB-strategien'.

Kreditforfatterbidragserklæring

Binda T. Andongma: Konceptualisering, metodologi, software, skrivning – originalt udkast. Yazheng Huang: Datakurering, software. Fang Chen: Software, visualisering. Qing Tang: Datakuration, formel analyse. Min Yang: Software, visualisering. Shan-Ho Chou: Skrivning – anmeldelse og redigering. Xinfeng Li: Konceptualisering, metodologi, software, anskaffelse af finansiering. Jin He: Supervision, Skrivning – gennemgang og redigering, Finansieringsanskaffelse.

Erklæring om konkurrerende interesse

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen kendte konkurrerende økonomiske interesser eller personlige forhold, der kunne have vist sig at påvirke det arbejde, der er rapporteret i dette papir.

Anerkendelser

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (32200026, 31900057), de åbne midler fra State Key Laboratory of Agricultural Microbiology (AMLKF202108) og China Postdoctoral Science Foundation (2019M662654).

Bilag A. Understøttende oplysninger

Supplerende data knyttet til denne artikel kan findes i onlineversionen på doi:10.1016/j.csbj.2023.01.019.

Referencer

[1] Boineau R, Domanski M, Troutman C, Anderson J, Johnson G, Mcnulty SE, Clappchanning N, Davidson-ray LD, Fraulo ES, Fishbein DP, et al. Amiodaron eller en implanterbar cardioverter-defibrillator til kongestiv hjertesvigt. New Engl J Med 2005;352(3):225–37.

[2] Khoshnood S, Heidary M, Haeili M, Drancourt M, Darban-sarokhalil D, Nasiri MJ, Lohrasbi V. Nye vaccinekandidater mod Mycobacterium tuberculosis. Int J Biol Macromol 2018;120(Pt A):180–8.

[3] Kyu HH, Maddison ER, Henry NJ, Ledesma JR, Wiens KE, Reiner R, et al. Global, regional og national byrde af tuberkulose, 1990-2016: resultater fra den globale byrde af sygdomme, skader og risikofaktorer 2016-undersøgelse. Lancet Infect Dis 2018;18(12):1329–49.

[4] Verdenssundhedsorganisationen (2022). Global tuberkuloserapport. 〈https://www. WHO. int/publications/i/item/9789240061729〉.

[5] Mirzayev F, Viney K, Linh NN, Gonzalez-Angulo L, Gegia M, Jaramillo E, Zignol M, Kasaeva T. Verdenssundhedsorganisationens anbefalinger om behandling af lægemiddelresistent tuberkulose, 2020-opdatering. Eur Respir J 2021;57(6):2003300.

[6] Ahmad Khan F, Fox G, Menzies D. Lægemiddelresistent tuberkulose. New York: Handbook of Antimicrobial Resistance Springer; 2017. s. 263–86.

[7] Mitchison D, Davies G. Kemoterapien af ​​tuberkulose: fortid, nutid og fremtid. Int J Tube Lung Dis 2012;16(6):724–32.

[8] Gong W, Liang Y, Mi J, Jia Z, Xue Y, Wang J, Wang L, Zhou Y, Sun S, Wu X. Peptidbaseret vaccine MP3RT inducerede beskyttende immunitet mod Mycobacterium tuberculosis-infektion i en humaniseret musemodel . Front Immunol 2021;12:1–19.

[9] Lange C, Aaby P, Behr MA, Donald PR, Kaufmann SHE, Netea MG, Mandalakas AM. 100 år med Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guérin. Lancet Infect Dis 2022;22(1):e2–12.

[10] Glaziou P, Floyd K, Raviglione MC. Global epidemiologi af tuberkulose. Semin Respir Crit Care Med 2018;39(3):271–85.

[11] Ernst JD. Mekanismer for M. tuberculosis-immununddragelse som udfordringer for TB-vaccinedesign. Cell Host Microbe 2018;24(1):34–42.

[12] Li X, Chen F, Liu X, Xiao J, Andongma BT, Tang Q, Cao X, Chou SH, Galperin MY, He J. Clp protease og antisense RNA regulerer i fællesskab den globale regulator CarD for at mediere mykobakteriel sultrespons. eLife 2022;11:1–22.

[13] Liu CH, Liu H, Ge B. Medfødt immunitet i tuberkulose: værtsforsvar vs patogenunddragelse. Cell Mol Immunol 2017;14(12):963-75.

[14] Elvang T, Christensen JP, Billeskov R, Hoang TTKT, Holst P, Thomsen AR, Andersen P, Dietrich J. CD4 og CD8 T-celleresponser på M. tuberculosis Ag85B-TB10.4 fremmet af adjuveret subunit, adenovector eller heterolog prime-boost-vaccination. PLoS ONE 2009;4(4):e5139.

[15] Rossjohn J, Gras S, Miles JJ, Turner SJ, Godfrey DI, McCluskey J. T-celleantigenreceptorgenkendelse af antigenpræsenterende molekyler. Annu Rev Immunol 2015;33:169-200.

For more information:1950477648nn@gmail.com