I Silico Design af en promiskuøs kimærisk multi-epitopvaccine mod mycobacterium tuberculosis del 1

Abstrakt

Tuberkulose (TB) er en global sundhedstrussel, der dræber cirka 1,5 millioner mennesker hvert år. Udryddelsen af ​​Mycobacterium tuberculosis, den vigtigste årsag til tuberkulose, er stadig mere udfordrende på grund af fremkomsten af ​​omfattende lægemiddelresistente stammer. Vaccination anses for at være en effektiv måde at beskytte værten mod patogener, men den eneste klinisk godkendte TB-vaccine, Bacillus Calmette-Guérin (BCG), har begrænset beskyttelse hos voksne. Multi-epitopvacciner har vist sig at øge immuniteten over for sygdomme ved selektivt at kombinere epitoper fra flere kandidatproteiner.

Tuberkulose er en infektionssygdom forårsaget af bakterien Mycobacterium tuberculosis, der hovedsageligt rammer lungerne, men som også kan påvirke andre organer. Immunitet spiller en vigtig rolle i udviklingen og behandlingen af ​​TB.

I tilfælde af utilstrækkelig immunitet kan Mycobacterium tuberculosis nemt invadere den menneskelige krop og udvikle sig til tuberkulose. For eksempel øger et kompromitteret immunsystem fra visse sygdomme eller medicinske behandlinger risikoen for TB-infektion. Derudover kan faktorer som underernæring, dårlig livskvalitet og overdreven stress også svække immuniteten, hvilket fører til udvikling af TB.

Derfor er det meget vigtigt at opretholde et godt helbred og styrke immuniteten for at forhindre tuberkulose. Immuniteten kan styrkes gennem en sund kost, regelmæssig livsstil, ordentlig motion og nok søvn, hvilket effektivt kan reducere risikoen for at pådrage sig forskellige sygdomme, herunder tuberkulose.

Immunitet er også vigtig for behandling og bedring, når TB allerede er opstået. Jo stærkere immunforsvaret er, jo mere effektivt kan kroppen forsvare sig mod et angreb fra TB-bacillen og producere nok antistoffer til at bekæmpe sygdommen. Derfor kan opretholdelse af tilstrækkelig ernæring, ordentlig motion og en positiv holdning forbedre immuniteten og fremme restitutionen.

Som konklusion er der en stærk sammenhæng mellem immunitet og TB. Opretholdelse af et godt helbred og forbedring af immuniteten er en af ​​de vigtige måder at forebygge og behandle tuberkulose på. Lad os se livet positivt i øjnene, opretholde en sund livsstil og holde os væk fra sygdomme. Fra dette synspunkt er vi nødt til at forbedre vores immunitet. Cistanche kan forbedre immuniteten markant, fordi kødaske indeholder en række biologisk aktive komponenter, såsom polysaccharider, to svampe, Huang Li osv. Disse komponenter kan stimulere immunsystemet Forskellige typer celler i systemet, øger deres immunaktivitet.

Klik på sundhedsmæssige fordele ved cistanche

Denne undersøgelse havde til formål at designe en multi-epitop-vaccine mod TB ved hjælp af en immuno-informatisk tilgang. Gennem funktionel berigelse identificerede vi otte proteiner udskilt af M. tuberculosis, som enten er nødvendige for patogenese, udskilles i ekstracellulært rum eller begge dele. Vi analyserede derefter epitoperne af disse proteiner og udvalgte 16 hjælper T-lymfocytepitoper med interferon-inducerende aktivitet, 15 cytotoksiske T-lymfocytepitoper og 10 lineære Bcelle-epitoper og konjugerede dem med adjuvans og Pan HLA DR-bindende epitop (PADRE) ved hjælp af passende linkere.

Desuden forudsagde vi den tertiære struktur af denne vaccine, dens potentielle interaktion med Toll-Like Receptor-4 (TLR4) og den immunreaktion, den kunne fremkalde. Resultaterne viste, at denne vaccine havde en stærk affinitet for TLR4, som signifikant kunne stimulere CD4 plus og CD8 plus celler til at udskille immunfaktorer og B-lymfocytter til at udskille immunglobuliner for at opnå god humoral og cellulær immunitet. Samlet set blev dette multi-epitopprotein forudsagt at være stabilt, sikkert, meget antigent og meget immunogent, hvilket har potentialet til at fungere som en global vaccine mod TB.

1. Introduktion

Tuberkulose (TB), en meget smitsom sygdom forårsaget af Mycobacterium tuberculosis, er rangeret af Verdenssundhedsorganisationen (WHO) som den største dødsårsag fra et enkelt smitsomt agens [1-3]. I 2021 nåede det anslåede antal TB-dødsfald og nye tilfælde op på henholdsvis 1,6 millioner og 10,6 millioner [4]. I øjeblikket er den kliniske behandling af tuberkulose relativt sparsom, og kombinationen af ​​flere antimikrobielle lægemidler anvendes hovedsageligt.
Denne kemoterapicyklus er meget lang og tager normalt ni til tolv måneder eller endda længere [5], hvilket øger risikoen for lægemiddelresistente mutationer i M. tuberculosis [6,7]. I de senere år er kemoterapi blevet mindre effektiv på grund af fremkomsten og stigende andel af multi-drug og omfattende lægemiddel-resistente M. tuberculosis [6]. At forhindre TB i at udvikle sig kan være mere effektivt end at behandle det. Vaccination er velkendt for at være en effektiv måde at beskytte værten mod patogene bakterier [8].

I øjeblikket er Bacillus Calmette-Guérin (BCG), udviklet for over 100 år siden, den eneste klinisk godkendte TB-vaccine [9]. Desværre beskytter BCG kun nyfødte og spædbørn og er stort set ineffektiv over for unge og voksne [2,10], selvom WHO rapporterer, at 89 procent af TB-tilfældene i 2021 var voksne [4]. Derfor er der et presserende behov for at udvikle en ny og effektiv anti-TB-vaccine, især til unge og voksne.

TB-vaccineudvikling kompliceres af flere træk ved mykobakterier, såsom latent infektion, persistens og immunundvigelse [11-13]. En ideel TB-vaccine bør designes til at målrette de proteiner/veje, der er ansvarlige for disse egenskaber i M. tuberculosis, og være i stand til effektivt at inducere CD4 plus og CD8 plus T-celle-medierede immunresponser [14].

Desuden bør en effektiv vaccine også målrette værtens vigtigste histokompatibilitetskomplekser (MHC), som er meget polymorfe [15]. Disse egenskaber stiller meget høje krav til vaccinens alsidighed, som naturligvis ikke kan opnås med et enkelt naturligt protein. Multi-epitopvaccine, et rekombinant protein bestående af en række overlappende epitoper (peptider) [16], er en ny type vaccinekandidat, der kan løse ovenstående problemer.

I de senere år har multi-epitopvacciner tiltrukket sig stor opmærksomhed på grund af deres fordele med højere immunitet og lavere allergenicitet end konventionelle vacciner [17,18]. I øjeblikket er multi-epitopvacciner blevet designet mod mange patogene mikroorganismer, herunder Shigella spp. [19], mund- og klovsygevirus [20], Helicobacter pylori [21,22], hepatitis B virus [23], Toxoplasma gondii [24], Leishmania infantum [25], Nipah virus [26], Onchocerca volvulus [27], Pseudomonas aeruginosa [28] og leukosevirus [29].

Især fremkomsten af ​​COVID-19-pandemien har styrket anvendelsen af ​​denne teknologi [16,30-32]. Hvad angår TB, er adskillige multi-epitopvacciner designet til at målrette mod iboende aktiv TB [33-39] og latent TB [40,41]. Blandt dem blev tre vaccinekandidater designet i form af DNA [34,36,40], og to af dem inkorporerede epitoper i proteinrygraden for at generere rekombinante vacciner [34,36].

Det skal bemærkes, at kandidatproteinerne til nogle af de ovennævnte multi-epitopvacciner er tilfældigt udvalgt, og befolkningsdækningen af ​​disse vacciner kræver yderligere undersøgelser.

Desuden blev to multi-epitop TB-vaccinekandidater med bred befolkningsdækning designet, den ene epitop blev udvalgt fra immunogene exosomer vesikelproteiner med patogene egenskaber [39], og den anden fokuserer ikke på kandidatproteiner, men udvælger direkte meget konserverede og eksperimentelt validerede epitoper fra Immune Epitope Database (IEDB) [38]. Disse kandidatproteiner mangler imidlertid funktionel berigelse, og vaccinekandidaters evne til at inducere interferon-(IFN-) sekretion mangler at blive forbedret.

En tidligere undersøgelse har udledt, at rationel optimering af epitoper kan opnås ved en kombination af MHC-bindingskapacitet og epitopens evne til at reagere med T-cellereceptorer [42]. Desuden forudsagde de, at vacciner med cytotoksiske T-lymfocyt (CTL) A1, A2, A3, A24 og B7 bindende epitoper ville have en dækning på næsten 100 procent i de store etniske grupper (sorte, asiater, latinamerikanere og kaukasiere).

Men indtil nu har der ikke været nogen lignende tilgang til at designe en TB-vaccine. I denne undersøgelse designet vi en meget promiskuøs multi-epitop TB-vaccine ved hjælp af forskellige antigene egenskaber af otte funktionsberigede proteiner. Den kimære vaccinekandidat besidder 15 CTL-epitoper, 16 hjælper-T-lymfocyt-epitoper (HTL) med IFN- --inducerende egenskaber og 10 lineære B-celle-epitoper. Immuno-informatik analyse viste, at denne vaccinekandidat var 'altomfattende', hvilket gør den til en potentiel hjørnesten for at opnå 'The End TB-strategien'.

2. Materialer og metode

2.1. Proteinudvælgelse og sekvenssøgning

For at konstruere en multi-epitopvaccine mod TB valgte vi først proteiner af M. tuberculosis-komplekset, som er deponeret i IEDB-databasen [43] og er blevet valideret som MHC klasse I og II bindende epitoper. Aminosyresekvenser (primær struktur) af proteiner fra M. tuberculosis H37Rv-stammen blev opnået fra UniProt-databasen [44]. Alignment-uafhængige forudsigelser af potentielle antigener baseret på fysisk-kemiske egenskaber blev opnået fra VaxiJen 2.0-serveren [45], som undergik automatisk og cross-covariance (ACC) transformation af proteinsekvenser til en ensartet vektor af større aminosyrer egenskaber, med antigenicitetstærsklen sat til 0.4 for hvert bakterieprotein [45,46].

Funktionel annotering af proteiner blev vurderet ved hjælp af Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) 6.8 [47]. Udskilte proteiner blev yderligere beriget ved hjælp af to kategorier: ekstracellulært rum og patogenese gennem henholdsvis DAVID og BioCyc [48] databaserne. Proteomet af Homo sapiens GRCh38.p13 blev downloadet i FASTA-format fra National Center for Biotechnology Information (NCBI) database [49]. BLASTp blev brugt til at forudsige homologi (E-værdi =1e-5) mellem udskilte proteiner og H. sapiens-proteiner.

2.2. T-celle epitop forudsigelse

Forudsigelse og udvælgelse af epitoper er afgørende trin i konstruktionen af ​​multi-epitopvacciner. MHC I-molekyler binder korte peptider (9-11 aminosyrer), fordi den peptidbindende spalte af MHC I-molekyler bestående af en enkelt kæde er lukket [50]. Den frit tilgængelige NetMHCpan-4.1 [51] blev brugt til forudsigelse af CTL-epitoper, som bruger NNAlign_MA til at generere procentranger (procentrangering) baseret på en kombination af MHC I-bindingsaffiniteter og eluerede ligander .

"Procentrangeringen" af en forespørgselssekvens blev bestemt ved at sammenligne dens forudsigelsesscore med fordelingen af ​​forudsigelsesscore for den relevante MHC beregnet under anvendelse af et sæt tilfældigt udvalgte native peptider. Epitoper med en procentrangering < 0,5 procent blev betragtet som stærke bindere, mens epitoper med en procentrangering < 2 procent blev betragtet som svage bindere [51].

Selvom op til 12 supertype MHC klasse I epitoper kan forudsiges på serveren, brugte vi kun A1, A2, A3, A24 og B7, fordi disse fem supertyper dækker 100 procent af de store menneskelige racer [42] . Vi valgte stærke bindere og forudsagde deres antigenicitet ved hjælp af VaxiJen2.0 [45], og derefter forudsagde vi klasse I immunogenicitet ved hjælp af International Epitope Database (IEDB) [52], som bruger 3-fold krydsvalidering.

Til sidst arrangerede vi epitoper, der var både antigene og immunogene i henhold til procentrangering og udvalgte 15 lavscorende epitoper, tre for hver supertype og mindst én for hver kandidatprotein, bortset fra et kandidatprotein, der ikke kunne have en stærk CTL-bindende epitop det er antigent og immunogent. Endelig blev IC50-værdier for hver CTL-epitop forudsagt fra NetMHC-4.0 [53].
Klasse II MHC-molekyler binder til antigene peptider, og det resulterende kompleks kan genkendes af HTL. Typisk varierer antigene peptider i længden fra 12 til 20 aminosyrerester, men peptider mellem 13 og 16 rester i længden observeres ofte [54].

{{0}}mererne var de mest udbredte MHC II-epitoper for M. tuberculosis og er blevet deponeret i IEDB. Som et resultat brugte vi NetMHCIIpan-4.0 [51,55] til at forudsige bindingen af ​​15-mer-peptider til humant leukocytantigen-DR (HLA-DR), HLADQ, HLA-DP, og H-2–1 allel. Forudsigelsen var også baseret på NNAlign_MA med en procentrangering på < 2 procent og < 10 procent, der blev betragtet som henholdsvis stærke og svage bindere [51].

Vi forudsagde også 15-mer IFN-inducerende epitoper for kandidatproteiner ved hjælp af IFNepitope-serveren [56], som bruger en understøttende vektormaskine-hybridtilgang, der tillader virtuel screening af IFN- --inducerende peptid/epitop i et peptid bibliotek bestående af IFN- -inducerbare og ikke-inducerbare MHC II-bindere, der aktiverer T-hjælperceller. Vi forudsagde derefter antigeniciteten af ​​de IFN-inducerende epitoper [45], og til sidst valgte vi de 16 mest promiskuøse epitoper, der var stærk MHC-II-binding, IFN-inducerende og antigene.

Det er vigtigt at bemærke, at signalpeptider blev fjernet fra kandidatproteiner før epitopforudsigelsen. I denne undersøgelse blev signalpeptider screenet ved hjælp af SignalP 5.0 [57] og TargetP2.0 [58].

2.3. Lineær B-celle epitop forudsigelse

Lineære B-celle-epitoper (16-merer) blev forudsagt ved hjælp af ABPred [59,60] med en standardtærskel på 0.51. For at øge pålideligheden af ​​forudsigelsesresultaterne brugte vi desuden BepiPred 2.0 [61] til at forudsige lineære B-celle-epitoper. Epitoper opnået fra disse to software blev yderligere udsat for antigenicitetsforudsigelse under anvendelse af VaxiJen2.0 [45]. Til sidst valgte vi ti lineære B-celle-epitoper baseret på høje ABCpred-scorer og antigenicitet, med mindst én epitop valgt for hvert kandidatprotein.

2.4. Konstruktion af multi-epitopvaccinekandidaten med kimære egenskaber

Den designede multi-epitopvaccine indeholder én HBHA (heparinbindende hæmagglutinin) adjuvans, én Pan HLA DR-bindende epitop (PADRE), 15 CTL, 16 HTL, 10 lineære B-celle epitoper og én His×6 tag (fig. 3). Linkere blev brugt til at forbinde epitoper, forhindre produktionen af ​​junction-epitoper og forbedre processionen og regenereringen af ​​individuelle epitoper i kimære vacciner [62].

Til konstruktionen af ​​denne vaccinekandidat blev HBHA-adjuvansen (UniProt ID: P9WIP9) placeret ved N-terminalen og forbundet til nedstrøms PADRE via en EAAAK-linker. Derefter blev HTL-epitoperne forbundet af GPGPG-linkerne koblet til PADRE. Desuden blev CTL-epitoper forbundet af AAY-linkeren forbundet til HTL-epitoper via HEYGAEALERAG-linkeren, som også forenede CTL-epitopenheden til lineære B-celleepitoper koblet ved hjælp af KK-linkere. Til sidst blev et His×6-mærke fastgjort til C-terminalen af ​​det kimære protein.

2.5. Antigenicitet, allergenicitet og fysisk-kemiske egenskaber

Antigeniciteten af ​​multipelepitopvaccinen og de otte komponentproteiner blev forudsagt af VaxiJen 2.0-serveren [45], mens allergeniciteten af ​​disse proteiner blev forudsagt af AllerTOP 2.0-serveren [ 63]. AllerTOP 2.0 bruger aminosyre E-deskriptorer, ACC-transformation af proteinsekvenser og k-nearest neighbors (kNN) til allergenklassificering.

Metoden opnåede 85,3 procent nøjagtighed med 5-fold krydsvalidering. Til forudsigelse af fysisk-kemiske egenskaber såsom halveringstid, isoelektrisk punkt, ustabilitetsindeks, alifatisk indeks og grand gennemsnit af hydropaticitet (GRAVY) af denne multipelepitopvaccine blev ExPASy ProtParam-serveren [64] brugt.
Yderligere blev opløseligheden af ​​multi-epitopvaccinepeptid vurderet ved hjælp af proteinSol (PROSO II) serveren [65] baseret på en klassificering, der udnytter de subtile forskelle mellem de velkendte uopløselige proteiner fra TargetDB og de opløselige proteiner fra både TargetDB og PDB [ 66]. Når den blev evalueret ved hjælp af 10-fold krydsvalidering, opnåede den 71,0 procents nøjagtighed (areal under ROC-kurven=0.785).

2.6. Immun simulering

For at karakterisere immunresponsprofilen og immunogeniciteten af ​​vaccinen blev der udført in silico-immunsimuleringer ved hjælp af C-ImmSim-serveren [67]. C-ImmSim forudsiger immuninteraktioner ved hjælp af positionsspecifikke scoringsmatricer afledt af maskinlæringsteknikker til peptidforudsigelse.
Det simulerer samtidig tre rum, der repræsenterer tre separate anatomiske regioner fundet i pattedyr: (i) knoglemarven, hvor hæmatopoietiske stamceller blev simuleret til at producere nye lymfocytter og myeloidceller; (ii) thymus, hvor naive T-celler blev udvalgt for at undgå autoimmunitet; og (iii) det lymfatiske organ, såsom lymfeknuder.

For effektivt at prime og booste vaccinen fulgte vi fremgangsmåden fra [68], hvor to injektioner blev administreret med fire ugers mellemrum. Alle simuleringsparametre blev sat til standardværdier, med tidstrin sat til 10 og 94 (hvert tidstrin er otte timer).

2.7. Forudsigelse af forstyrret region

Intrinsically disordered regions (IDR'er) er til stede i mange proteiner. Den forstyrrede region blev forudsagt ved hjælp af DISOPRED3 [69], som bruger DISOPRED2 og to andre maskinlæringsbaserede moduler trænet på store IDR'er til at identificere forstyrrede rester. De var da anno

2.8. Forudsigelse af sekundær og tertiær struktur

Den sekundære struktur af den designede vaccine blev forudsagt af PSIPRED 4.0-serveren [70], som først bruger PSI-BLAST til at identificere sekvenser, der er tæt relateret til forespørgselsproteinet. Den tertiære struktur af denne vaccine blev forudsagt ved hjælp af Iterative Threading Assembly Refinement (I-TASSER)-serveren [71].

Der er fire nøgletrin i ITASSER-modellering; a) identifikation af gevindskabelon; b) iterativ struktursamlingssimulering; c) modelvalg og forfining; og d) strukturbaseret funktionel annotering [72,73].

I-TASSER genererede fem modeller, som blev screenet ved hjælp af ProSA-web [74], og modellen med den laveste Z-score blev udvalgt til yderligere forfining. ProSA-web sammenligner modelscorerne opnået fra eksperimentelt verificerede strukturer deponeret i PDB. Et lokalt kvalitetsscoreplot hjælper med at identificere problematiske områder i modellen, og de samme scorer blev repræsenteret ved hjælp af en farvekode på præsentationen af ​​3D-strukturen. Dette er nyttigt til tidlig strukturel bestemmelse og forfining.

2.9. Forfining af tertiær struktur

Den "grove" 3D-model af vaccinekandidaten opnået af ITASSER blev forfinet i to trin ved hjælp af to servere; først med ModRefiner [75] efterfulgt af GalaxyRefine [76]. ModRefiner bruger C-spor til at påvirke konstruktionen og raffineringen af ​​proteiner opnået ved to-trins atom-niveau energiminimering.

Først blev C-sporene brugt til at konstruere hovedkæden, efterfulgt af forfining af sidekæderotamerer og rygradsatomer ved hjælp af fysik- og vidensbaserede sammensatte kraftfelter. GalaxyRefine bruger flere skabeloner til at generere pålidelige kernestrukturer, mens upålidelige loops eller terminaler blev genereret ved optimeringsbaseret modellering.

2.10. Tertiær strukturvalidering

Den raffinerede struktur af vaccinekandidaten blev valideret af Ramachandran-plot genereret fra PROCHECK [77] og MolProbity [78] databaserne. Ramachandran-plot evaluerer rygradskonformationen af ​​proteiner ved at opdele aminosyrerester i to regioner: tilladt og ikke tilladt. PROCHECK anvender stereokemi til at vurdere nettokvaliteten af ​​proteinstrukturer ved at sammenligne dem med de raffinerede strukturer i samme opløsning og derefter præsentere regioner, der kræver yderligere analyse.

Molprobity validerer lokale og globale makromolekyle (proteiner og nukleinsyrer) modeller ved en blanding af røntgen-, NMR-, beregnings- og cryoEM-kriterier [79]. Kraften og følsomheden til at optimere brintplacering og alle-atom kontaktanalyse er meget brugt i en opdateret version af kriterierne for kovalent geometri og torsionsvinkel [80].

2.11. Diskontinuerlige B-celleepitoper

Diskontinuerlige B-celleepitoper i den native proteinstruktur blev forudsagt ved hjælp af ElliPro [81]. ElliPro implementerer tre algoritmer til at tilnærme proteinformen som en ellipsoide, beregner restprotrusion index (PI) og grupperer naborester baseret på deres PI-værdier. ElliPro giver hver output-epitop en score beskrevet som den gennemsnitlige PI-værdi for epitopresten. En ellipsoide med en PI-værdi på 0.9 består af 90 procent af de indeholdte proteinrester, mens de resterende 10 procent af resterne ligger uden for ellipsoiden. For hver epitoprest beregnes PI-værdien ud fra massecentret af resten, der ligger uden for den størst mulige ellipsoide.

2.12. Molekylær docking af kimære proteiner

Molekylær docking af den designede vaccine (ligand) med Toll-Like Receptor-4 (TLR4) (PDB ID: 3FXI) immunreceptor blev udført ved hjælp af Patchdock [82]. De 10 bedste modeller blev derefter forfinet ved hjælp af FireDock [83]. PatchDock erstatter Connolly-punktoverfladerepræsentationen af ​​molekylerne med konkave, konvekse og flade pletter.

Modellerne blev derefter scoret baseret på geometrisk pasform og atomisk desolvation. [82]. FireDock optimerer sidekædekonformationer og orientering af den stive krop og genererer et output af et 3D-raffineret kompleks baseret på bindingsenergien [83]. Vi valgte den første model af Firedock baseret på global energi som dockingkompleks. Endelig blev bindingsenergien og dissociationsindholdet i dockingkomplekset forudsagt ved hjælp af PRODIGY-serveren [84].

2.13. Molekylær dynamik simulering

Molekylær dynamiske simuleringer blev udført på proteiner ved hjælp af den hurtige og frit tilgængelige webserver, interne koordinater normal mode analyse server (iMODS) [85], og konsistente og optimale docking resultater blev opnået fra PatchDock-FireDock serveren. I interne koordinater genererer Normal Mode Analysis (NMA) kollektive bevægelser, der er kritiske for makromolekylær funktion. iMODS præsenterer mekanismer til at udforske disse tilstande som vibrationsanalyse, bevægelsesanimationer og morphing-baner, der blev udført næsten interaktivt ved forskellige opløsninger [85].

2.14. Omvendt translation, kodonoptimering og in silico-kloning af vaccinen

For effektivt at udtrykke vaccinekandidaten i Escherichia coli-celler blev cDNA genereret i silico gennem kodonoptimering og omvendt translation ved hjælp af Java Codon Adaptation Tool (JCAT) [86].

Optimering involverede (i) undgåelse af rho-uafhængige transkriptionelle terminatorer, ii) undgåelse af prokaryote ribosombindingssteder, (iii) undgåelse af spaltningssted for restriktionsenzymer NcoI og XhoI, der tjener som N-terminale og C-terminale restriktionssteder til insertion af cDNA skabelon af vaccine, og (iv) kun delvis optimering for at anvende stedsrettet mutagenese. Codon Adaptation Index (CAI) og GC-indhold forudsagde kvaliteten af ​​cDNA'et med en opal stopcodon (TGA) indsat efter His× 6-mærket. Derefter blev det optimerede DNA-fragment af den kimære vaccinekandidat integreret i den omvendte streng af pET-28a(plus) ved hjælp af SnapGene-værktøjet [87].

For more information:1950477648nn@gmail.com