Indvirkning af svangerskabsmæssigt lavt proteinindtag på embryonal nyre-mikroRNA-ekspression og i nefronstamceller fra det mandlige foster

edmund.chen@wecistanche.com

Introduktion

Mangelen på næringsstoffer kan resultere i signalændringer i pivotale veje under forskellige stadier af fosterudviklingen, hvilket kan forårsage irreversible organ- og systemlidelser i voksenalderen [1]. Fosterprogrammering refererer til enhver fornærmelse under udvikling, som forårsager langsigtede virkninger på en organismes struktur eller funktion [2]. Forstyrrelser i føtal programmering resulterer i lav fødselsvægt, færre nefroner og øget risiko for kardiovaskulær ognyrelidelser i voksenalderen [3-6]. Undersøgelser af andre forfattere og os har vist lavere fødselsvægt, 28 procent færre nefroner, reduceretnyresaltudskillelse, kroniskNyresvigt, og arteriel hypertension i svangerskabsindtag af lavt protein (LP) sammenlignet med standard (NP) proteinindtag afkom i voksenalderen [3-7]. Nefrogenese involverer stram kontrol af genekspression, proteinsyntese og vævsremodellering. Undersøgelser har vist, at nefrontal bestemmes af interaktionerne mellem ureterknop (UB) og metanephros mesenchyme (MM) progenitorceller [8-10]. Signaler fra MM inducerer UB-stimuleret vækst og forgrening af tubulisystemet. Til gengæld medieres MM-proliferation og -differentiering, der udgør en mesenkymal cap (CM), af UB-ender [11].

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYRESYGDOMME

Der har været seriøs interesse for rollen som epigenetiske ændringer vedrørende de langsigtede virkninger af prænatal stress på fosterudviklingen [12]. MikroRNA'er (miRNA'er) er genomkodede små ikke-kodende RNA'er med en længde på cirka 22 nukleotider og spiller en væsentlig rolle i den post-transkriptionelle regulering af målgenekspression [13-16]. miRNA'er kontrollerer genekspression post-transkriptionelt ved at regulere mRNA-translation eller stabilitet i cytoplasmaet [17, 18]. Funktionelle undersøgelser indikerer, at miRNA'er er involveret i kritiske biologiske processer under udvikling og i cellefysiologi [13, 16]. Ændringer i deres udtryk er blevet observeret i flere patologier [16, 19]. MiRNAs karakterisering har således hjulpet med at forstå genregulering og cellulær proliferation, differentiering og apoptose og forklare patofysiologiske lidelser, herundernyrelidelser [20-22]. Undersøgelser har rapporteret, at undernyreontogeni miRNA'er er uundværlige for nefronudvikling [23-26]. Desuden reducerer underekspression af nogle miR NA'er i MM progenitorceller celleproliferation, hvilket resulterer i tidlig differentiering og som følge heraf reducerede antallet af nefroner [27, 28]. Dette fænomen er karakteriseret ved øget apoptose og høj Bim-ekspression i progenitorceller [27]. Således modulerer miRNA'er balancen mellem apoptose og proliferation af disse metanefrie primære celler [29].

Vi antog, at ukendte epigenetiske ændringer og miRNA-ekspressionsprofilering er forbundet mednyreudviklingsforstyrrelser hos moderens proteinbegrænsede afkom. Således sigtede vi på at evaluere mønstre af miRNA og forudsagt genekspression i fosteretnyreefter 17 dages gestations (17-DG) proteinbegrænset mandligt afkom for at identificere molekylære veje og lidelser involveret inyrecelleproliferation og -differentiering undernyreudvikling.

Nøgleord:Nyresvigt; renal tubulær; nyrelidelser; nyreudvikling; nyre

Materiale og metode

Dyr og diæterForsøgene blev udført som beskrevet detaljeret tidligere [5, 6] på aldersmatchede hun- og hanrotter af søskendeparrede Wistar HanUnib-rotter (250-300 g) stammende fra en avlsbestand leveret af CEMIB/UNICAMP , Campinas, SP, Brasilien. Miljø og boliger præsenterede de rette betingelser for at håndtere deres sundhed og velvære under forsøgsproceduren. Umiddelbart efter fravænning ved tre ugers alderen blev dyrene holdt under kontrolleret temperatur (25˚C) og lysforhold (07:00–19:00 timer) med fri adgang til postevand og standard laboratoriefoder (Purina Nuvital) , Curitiba, PR, Brasilien: Na plus indhold: 135 ± 3μEq/g; K plus indhold: 293 ± 5μEq/g), i 12 uger før avl. Den institutionelle etiske komité for dyreanvendelse ved São Paulo State University (#446-CEUA/UNESP) godkendte forsøgsprotokollen, og de generelle retningslinjer, der er fastsat af Brazilian College of Animal Experimentation, blev fulgt under hele undersøgelsen. Det blev betegnet dag 1 af graviditeten som den dag, hvor vaginal udstrygning udviste sperm. Derefter blev mødre opretholdt ad libitum gennem hele graviditeten på en isokalorisk gnaver laboratoriefoder med enten standardproteinindhold [NP, n=36] (17 procent protein) eller lavt proteinindhold [LP, n=51 ] (6 procent protein). Moderens NP- og LP-fødeforbrug blev bestemt dagligt (efterfølgende normaliseret for kropsvægt), og kropsvægten af ​​moderdyr blev registreret ugentligt i begge grupper. På 17 dage af drægtighed (17-DG) blev moderdyrene bedøvet med ketamin (75 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg), og livmoderen blev blottet. Fostrene blev fjernet og straks aflivet ved halshugning. Fostrene blev vejet, og halen og lemmerne blev samlet til kønsbestemmelse. Metanephros blev indsamlet til Next Generation Sequencing (NGS), RT-qPCR og immunhistokemi analyser.

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRESVIGT

KønsbestemmelseDenne undersøgelse blev kun udført i han-17-DG-afkom, og kønsbestemmelsen blev bestemt ved Sry konventionel PCR (Polymerase Chain Reaction) sekvensanalyse. DNA'et blev ekstraheret ved enzymatisk lysis med proteinase K og phenol-chloroform. Til reaktion blev Master Mix Colorless-Promega brugt med producentens cykelbetingelser. The Integrated DNA Technologies (IDT) syntetiserede primeren følgende sekvenser nedenfor: Frem: 5'-TACAGCCTGAGGACATATTA-3'Reverse: 5'-GCACTTTAACCCTTCGATTAG-3'.

Total RNA-ekstraktionRNA blev ekstraheret fra NP (n=4) og LP (n=4) helnyrerved at bruge Trizol-reagens (Invitrogen), i henhold til instruktionerne specificeret af producenten. Den samlede RNA-mængde blev bestemt af absorbansen ved 260 nm ved anvendelse af et nanoVue-spektrofotometer (GE Healthcare, USA). RNA-integritet blev sikret ved at opnå et RNA-integritetsnummer - RIN > 8 med Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Tyskland) [30].

miRNA-Seq og dataanalyseSekventering blev udført på MiSeq-platformen (Illumina). Protokollen fulgte producentens instruktioner tilgængelige iKort fortalt inkluderer sekventeringen bibliotekskonstruktion, og dette blev brugt 1 ug totalt RNA. I dette trin er adapterne tilsluttet, de 3 'og 5'. Efter ligering af adaptorer blev en revers transkriptionsreaktion udført for at skabe cDNA. Det blev derefter amplificeret ved en standard PCR-reaktion, som bruger primere indeholdende et sekvensindeks til prøveidentifikation - dette cDNA-bibliotek, der blev udsat for agarosegelelektroforese til miRNA-isolering. Efter kvantificering blev bibliotekskoncentrationen normaliseret til 2 nM under anvendelse af 10 nM Tris-HCl, pH 8,5, og transkriptomsekventering blev udført med MiSeq Reagent Kit v2 (50 cyklusser).

Dataanalyse blev udført i samarbejde med Tao Chen, Ph.D. fra afdelingen for genetisk og molekylær toksikologisk, National Center for Toxicological Research, Jefferson, AR, USA. Dataene fra Next Generation Sequencing (NGS) af miRNA'er blev genereret i FASTA-format og importeret til BaseSpace.com (Illumina, USA). Datakvaliteten blev evalueret ved hjælp af den grundlæggende kaldende CASAVA-software udviklet af producenten (Illumina). Analyserne blev udført ved BaseSpace miRNA Analysis (fra University of Torino, Canada) og sekvenskortlægningen af ​​forskellige miRNA'er med Small RNA (Illumina, USA) for rottens genom. Det differentielt udtrykte miRNA-studie blev analyseret ved hjælp af Ingenuity Pathway Analysis-software (Ingenuity, USA).

miRNA-ekspressionsvalideringFire mandlige afkom fra forskellige kuld blev brugt i hver gruppe til miRNA (miR{{0}}p, -144-3p, -298-5p, let-7a{{ 4}}p, -181a-5p, -181c-3p og -199a-5p) udtryksanalyse. Kort fortalt blev 450 ng RNA revers transskriberet uden præ-amplifikation ved brug af TaqMan1 Micro RNA Reverse Transcription Kit i henhold til producentens retningslinjer. Komplementært DNA (cDNA) blev amplificeret ved hjælp af TaqMan MicroRNA Assays (Life Technologies, USA) med TaqMan1 Universal PCR Master Mix, No AmpErase1 UNG (2x) på StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied BiosystemsTM), i henhold til producentens instruktioner. Dataanalyse blev udført ved hjælp af relativ genekspression evalueret ved hjælp af den komparative kvantificeringsmetode (Pfaffl, 2001). Baseret på stabilitetsanalyse blev U6 snRNA og U87 scaRNA brugt som referencegen. Alle relative kvantificeringer blev evalueret ved hjælp af DataAssist-softwaren, v 3.0, ved hjælp af ΔΔCT-metoden. miRNA-data er blevet genereret efter MIQE-retningslinjerne [31].

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREFUNKTIONEN

RT-qPCR af forudsagte målgenerTil cDNA-syntesen blev High Capacity cDNA revers transkriptionskit (Life Technologies, USA) brugt. RT-qPCR-reaktionerne for Bax, Bim, Caspase-3, Collagen 1, GDNF, PCNA, TGF -1, Bcl-2, Bcl-6, c-Myc, c -ret, cyclin A, Map2k2, PRDM1, Six-2, Ki-67, MTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2, NOTCH1 og IGF1-genet blev udført af SYBR Green Master Mix (Life Technologies, USA ) leveret af IDT1 Integrated DNA Technologies (tabel 1). Reaktionerne blev udført i et samlet volumen på 20 μL under anvendelse af 2 μL cDNA (fortyndet 1:30), 10 μL SYBER Green Master Mix (Life Technologies, USA) og 4 μL af hver specifik primer (5 nM). Amplifikation og detektion blev udført ved hjælp af StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied BiosystemsTM). Ct-værdier blev konverteret til relative ekspressionsværdier ved hjælp af ΔΔCt-metoden med afkom metanephros-data normaliseret med GAPDH som referencegen [32].

Immunhistokemi,Fosteret (n {{0}} pr. gruppe) blev fjernet og straks fikseret i 4 procent paraformaldehyd (0,1 M fosfat, pH 7,4). Materialerne blev dehydreret, diaphaniseret og inkluderet i paraplast, og blokkene blev skåret i 5-μm-tykkelsessnit. Histologiske snit blev afparaffineret og behandlet til immunfluorescens og immunoperoxidase. Afsnittene var

inkuberet med en blokerende opløsning (8 procent føtalt bovint serum, 2,5 procent bovint albumin og 2 procent skummetmælkspulver i PBS). Efterfølgende indstilles med det primære antistof (anti-Six-2) fortyndet i PBS indeholdende 1 procent skummetmælk natten over under afkøling. Efter vask med PBS blev sektionerne inkuberet med et specifikt sekundært antistof, konjugeret til Alexa 488-fluoroforen, fortyndet i den samme buffer, indeholdende 1 procent mælk i 2 timer ved stuetemperatur. Efter successive vask med PBS blev objektglassene monteret med dækglas under anvendelse af Vectashield fluorescerende samlingsmediet (Vector Laboratories, Inc. Burlingame). Fluorescensen i prøven blev detekteret ved laser konfokal mikroskopi. Billederne blev taget med Focus Imagecorder Plus-systemet. For c-Myc, Ki-67, Bcl-2, TGF -1, - catenin, ZEB1, ZEB2, Caspase 3-spaltede, cyclin A og WT1-proteiner blev der udført immunhistokemi. Objektglassene blev hydreret, og efter at være blevet vasket i PBS pH 7,2 i 5 minutter, blev den antigene genvinding foretaget med citratbuffer pH 6.0 i 25 minutter i trykkogeren. Objektglassene blev vasket i PBS. Efterfølgende blev endogen peroxidaseblokade med hydrogenperoxid og methanol udført i 10 minutter i mørke. Sektionerne blev genvasket i PBS. Blokering af ikke-specifik binding blev derefter fulgt, og objektglassene blev inkuberet med en blokerende opløsning (5 procent skummetmælkspulver, i PBS) i 1 time. Sektionerne blev inkuberet med det primære antistof (tabel 2), fortyndet i 1 procent BSA natten over i køleskabet. Efter vask med PBS blev sektionerne udsat for det specifikke sekundære antistof i 2 timer ved stuetemperatur. Objektglassene blev vasket med PBS. Skiverne blev afsløret med DAB (3,3'-diaminobenzidintetrahydrochlorid, Sigma-Aldrich CO1, USA). Efter successiv vask i rindende vand blev objektglassene modfarvet med hæmatoxylin, dehydreret og monteret med et dækglas under anvendelse af Entellan1. Billederne blev taget ved hjælp af fotomikroskopet (Olympus BX51) eller en Zeiss LSM 780-NLO konfokal på et Axio Observer Z.1 mikroskop (Carl Zeiss AG, Tyskland) fra National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biologi (INFABIC) ved State University of Campinas.

Morfologisk kvantificeringParaffin 5 μmnyresektioner blev analyseret ved hjælp af CellSens Dimension-software fra et fotomikroskop (Olympus BX51). DetnyreDer blev adgang til skiver for at bestemme det nefrogene område, CM- og UB-protein og cellenummer, hæmatoxylin-eosin farvet i 17-DG LP-foster(n=5) sammenlignet med aldersmatchede NP-afkom (n {{4 }}) fra forskellige mødre. Vi kvantificerede al CM og UB af hver analyseret metanephros (4NP og 4LP fra forskellige mødre), og statistisk analyse blev udført ved t-test, og værdierne blev udtrykt som middel ± SD. p�0.05 blev betragtet som signifikant. GraphPad Prism v01 Software, Inc., USA, blev brugt til statistisk analyse og figurkonstruktion.

Statistisk analyset-testen blev brugt, og værdierne blev udtrykt som middel ± standardafvigelse (SD). P�0.05 blev betragtet som signifikant. GraphPad Prisma v. 01 software (GraphPad Software, Inc., USA) blev brugt til statistisk analyse og figurkonstruktion.

Resultater

Ekspression af miRNA'er ved miRNA-SeqFor at forstå de mikroRNA-ændringer, der er forbundet med moderens lavt proteinindholdnyreprogrammering udførte vi ekspressionen af ​​en global miRNA-profileringsanalyse. Det blev identificeret 44 deregulerede miRNA'er (p � 0.05), hvoraf henholdsvis 19 og 25 miRNA'er var op- eller nedregulerede (tabel 3). De øverste udtrykte miRNA'er og deres funktioner, veje og netværk blev identificeret ved hjælp af Ingenuity Software (tabel 4).

Validering af miRNA-ekspressionI LP-gruppens dyr blev Let-7a-5p, miR-181a-5p, miR-181c-3p opreguleret, mens miR-127-3p, miR-144-3p og miR-199a-5p var nedreguleret i forhold til NP-dyr. Resultaterne viser ingen forskel i miR-298-udtryk ved at sammenligne begge grupper (fig. 1). Tabel 5 afslørede værdierne opnået ved miRNA-sekventering med RT-qPCR-valideringsdata. Selvom der blev observeret signifikant miRNA-ekspressionsforskel i LP i forhold til NP-afkom, var foldændringen (FC) af de validerede miRNA'er lig med begge teknikker.

miRNA-genmål

Ekspressionsgenerne af forudsagte mål for forskellige miRNA såsom Six-2, Bcl-2, PRDM1, cyclin A, PCNA, GDNF, Collagen 1, Caspase 3 og Bim i LP afveg ikke signifikant fra NP foster. Imidlertid blev Bax, TGF -1 Bcl-6, c-ret, Map2k2, Ki-67, mTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2 og IGF1 genekspression opreguleret i {{15 }}DG LP-gruppe sammenlignet med aldersmatchede kontroller. Omvendt blev c-Myc og NOTHC1 nedreguleret i moderprotein-begrænset afkom (fig. 2).

Fosterets kropsmasse og metanephros morfometri17-DG LP-kropsmassen afveg ikke fra det aldersmatchede NP-afkom. Imidlertid viste LP's metanephros-mesenchym et 7,6 procent reduceret areal og en 29 procent reduktion i cortex-tykkelsen end NP-gruppen (fig. 3).ImmunhistokemiI denne undersøgelse viste LP-fosteret en signifikant reduktion (ca. 69 procent) af Six-2 cap-fluorescens end NP-afkom (fig. 4).

Seks-2-immunoperoxidaseanalysen viste et reduceret celleantal (14 procent) i LP CM fra associeret med 28 procent reducerede seks-2 plus-celler i forhold til hætteområdet sammenlignet med NP-afkom (fig. 4). Den foreliggende undersøgelse viste også en signifikant procent reduktion af c-Myc CM og UB immunfarvede celler (mindre 14 procent) i LP i forhold til NP afkom (fig. 4). Derudover var procentdelen af ​​Ki-67-mærket område i CM 48 procent mindre i LP sammenlignet med NP-foster, mens Bcl-2 og spaltet caspase-3-immunreaktivitet ikke var forskellige fra begge grupper (fig. 5 og 6). Den foreliggende undersøgelse viste også en signifikant procent reduktion af c-Myc CM og UB immunfarvede celler (mindre 14 procent) i LP i forhold til NP afkom (fig. 4). Derudover var procentdelen af ​​Ki-67-mærket område i CM 48 procent mindre i LP sammenlignet med NP-foster, mens Bcl-2 og spaltet caspase-3-immunreaktivitet ikke var forskellige fra begge grupper (fig. 5 og 6). På den anden side, i LP, var de CM- og UB-catenin-mærkede områder henholdsvis 154 og 85 procent hævet sammenlignet med det, der er tilgængeligt i NP-afkom (fig. 7). Samtidig optog mTOR-immunoreaktivitetsfordelingen også et betydeligt mere omfattende område i LP CM (139 procent) og UB (104 procent) end i NP-fosteret (fig. 7). I LP-afkommet steg TGF -1 i UBS-cellefarvning (ca. 30 procent), mens de immunfarvede celler i CM ikke var forskellige relateret til NP-gruppen (fig. 8). Den ZEB1 metanephros-farvede, placeret i CM-kernecellerne, forbedrede 30 procent i LP sammenlignet med NP-fosteret (fig. 8). Samtidig var ZEB2-immunfluorescensen, selvom den var til stede i hele metanephros-strukturer, ens i begge eksperimentelle grupper (fig. 8). Den nuværende undersøgelse, der tager hensyn til miRNA og mRNA ekspression og proteiner

Diskussion

Viden om cellulære og molekylære mekanismer af nefrogenese er øget [33-37]. Imidlertid er mange regulatoriske faktorer og signalveje involveret inyreontogenesen forbliver uklar [38]. miRNA'er spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​genekspression undernyreudvikling [25, 39-41]. Så vidt vi ved, er miRNA- og mRNA-ekspressionsanalyser i maternal LP-indtag 17-DG mandlige mesenchymceller ikke blevet udført. Vi foreslår en ny molekylær mekanisme involveret i inhibering af tidlig nefrogenese, hvilket resulterer i et reduceret antal nefroner. Vi brugte NGS til at evaluere miRNA-ekspression og fandt ud af, at 19 miRNA'er var op- og 25 nedregulerede i 17-DG LP sammenlignet med NP-metanephros. Blandt de top 10 deregulerede miRNA'er udvalgte vi 7 miRNA'er med biologiske mål involveret i proliferation, differentiering og cellulær apoptose. Både miRNA-Seq og TaqMan dataanalyse afslørede konsistente og specifikke ændringer i miRNA-ekspression i LP-dyr i forhold til kontrol-NP-aldersmatchede dyr.

miR-181-familien er sammensat af fire meget bevarede medlemmer, nemlig miR-181a, miR-181b, miR-181c og miR-181d [ 42]. I neoplastiske celler virker miR-181a som en tumorsuppressor, der hæmmer cellulær proliferation og migration og inducerer cellulær apoptose [43]. Denne undersøgelse afslørede øget ekspression af miR-181a-5p i 17-DG LP i forhold til aldersmatchede NP-afkom. Selvom caspase-mRNA-ekspression var uændret, tyder en to gange stigning i Bax/Bcl-2 mRNA-forhold i LP sammenlignet med NP-afkom øget apoptose i CM, hvilket indikerer, at apoptose reguleres post-transkriptionelt. Undersøgelser har vist, at BCL-familien fremmer frigivelse af cytokrom fra mitokondrierne og derefter hæmmer aktiveringen af ​​Casp3 og derved hæmmer cellulær apoptose [44]. Li et al. brugte en akut lungeskademodel til at afsløre, at overudtrykt miR-181a er relateret til nedsat Bcl-2-proteinniveau; omvendt øgede miR-181a-hæmning Bcl-2-niveauer [45]. Denne undersøgelse bekræftede resultaterne af Lv et al., som viste, at miR-181c regulerer ekspressionen af ​​seks-2-ekspression og celleproliferation negativt, parallelt med tabet af mesenkymale cellers fænotype undernyreudvikling i LP 17-DG afkom [25].

Xiang et al. påvist, at øget miR-144 udtryk undertrykkernyrecarcinomproliferation, hvilket resulterer i en kortere G2/M-fase. Ydermere har Xiang et al. afslørede, at overekspression af miR-144 hæmmer mTOR-gen- og proteinekspression [46]. Nijland et al. påvist, at en stigning i mTOR-signalering er afgørende for at bestemme antallet af nefroner i embryoner, hvis mødre blev udsat for næringsrestriktioner [47]. Pattedyrmål for rapamycinkompleks 1 (mTORC1) er afgørende for embryoudvikling; hvordan dette kompleks regulerer balancen mellem vækst og autofagi under fysiologiske forhold og miljøbelastning er dog stadig ukendt [48]. Derfor kan mTOR-signalering være involveret i cellulære responser hos dyr udsat for LP-indtag under drægtighed; i perception, induktion og afslutning af autofagi; og som svar på intracellulær tilgængelighed af næringsstoffer [46]. Hypotetisk, under alvorlig proteinrestriktion, kan reduceret ekspression af miR-144-3p være forbundet med øget mTOR-ekspression, ca. 139 procent og 104 procent i henholdsvis CM-celler og UB, for at kompensere for tabet af nefroner i {{ 11}}DG LP afkom Chen et al. defineret miR-127 som en ny regulator af celleældning gennem Bcl-6 [49]. Pan et al. rapporterede, at miR-127 underekspression korrelerer med øget celleproliferation i leverceller [50]. Denne undersøgelse viste et fald i celleproliferation og en signifikant reduktion af celler positivt mærket for Ki-67 i CM af protein-begrænsede dyr. Desuden blev der observeret en reduktion i nefrogent område og proliferation i LP-afkom, hvilket var i overensstemmelse med resultaterne af Menendez-Castro et al. hos 8,4 procent proteinbegrænset afkom [51, 52]. Således kunne øget Ki-67 og Bcl-6 mRNA-ekspression, ledsaget af reduceret miR-127-3p-ekspression i 17-DG LP cap være forbundet med modregulerende mekanismer til at opretholde spredning.

Sun et al. demonstreret, at overekspression af miR-199a-5p reducerer cystisk celleproliferation og inducerer apoptose, udover at kontrollere cellecyklussen [53]. I denne undersøgelse er udtryk for miR-199a-5p reduceret i 17-DG LP er ledsaget af den øgede transkription af Ki-67, en cellulær proliferationsmarkør og Map2k2 er forbundet med nedsat Ki-67-reaktivitet i LP 17-DG metanephros. Svangerskabsunderernæring fremmer således differentiering gennem en post-transkriptionel mekanisme. Vores resultater afslører især en undertrykkende rolle af zink-finger E-boksbindende homeobox 1 (ZEB1), en EMT-inducer, som opretholder stamcellepluripotens under embryonal stamcelledifferentiering. -catenin er kendt for at aktivere nuklear ZEB1-transkription, hvilket resulterer i ZEB1-ekspression [34]. TGF-signalvejen, en af ​​de bedst undersøgte veje, kan inducere EMT under embryonal udvikling. Adskillige TGF-lignende ligander er nødvendige for embryonal udvikling. Imidlertid afhænger ikke alle TGF-medierede effekter på EMT af ZEB1/2, knockout-celler kan inducere ekspressionen af ​​de mesenkymale gener fibronectin og N-cadherin. E-cadherin er dog ikke længere nedreguleret, og der dannes også aktinfibre [54]. Karner et al. rapporterede, at undernyreudvikling, Wnt9b/ -catenin

signalvej, udtrykt i både UB og CM, er påkrævet både for fornyelse og differentiering af nefronstamceller, hvilket er afgørende for dannelsen af ​​nefroner under embryogenese [55]. Den evolutionært konserverede Wnt9b/-catenin-vej spiller en kritisk rolle i udviklingen af ​​organer, væv og skadesreparation i flercellede organismer. En undersøgelse viste, at c-Myc er et transkriptionelt mål for -catenin, der regulerer proliferation og differentiering afnyretubulært epitel [56]. Ekspressionen af ​​-catenin på gen- og proteinniveau steg i de undersøgte perioder afnyreudvikling i 17-DG LP-fosteret. Pan et al. rapporterede, at Myc samarbejder med -catenin for at fremme fornyelsen af ​​nefronstamceller [10]. Her sammenlignet med aldersmatchede NP-afkom, viste LP lavere c-Myc-ekspression. Derfor kan disse dyr have en lavere reserve af vedvarende celler, der er nødvendige for spredning og overlevelse og kan afspejle det mindre antal nefroner i LP-modellen. I øvrigt,

Wnt/ -catenin- og Notch-signalveje kan koordinere reguleringen af ​​seks-2-ekspression og er involveret i nedreguleringen af ​​seks-2-ekspression i nefronstamceller. Undersøgelser har vist, at lave niveauer af -catenin kan være nødvendige for at opretholde seks-2-ekspression og CM-progenitorceller i udifferentieret tilstand; desuden bestemmer forhøjede niveauer af - catenin nefron stamcellers skæbne [57, 58]. Vi antager således, at reduceret cMyc- og Notch-signalering, ledsaget af øget -catenin-ekspression, reducerede Six-2-ekspression med 28 procent i 17-DG LP-afkom og korrelerede med tidlig CM-celledifferentiering og reduceret stamcelle- og nefronnummer i voksenalderen. Desuden kan vores data understøtte, at i LP-afkom MM-celler kan det øgede Let-7a-5p- og -catenin-udtryk og reducerede Notch-signal modulere c-Myc, Six-2, og Ki-67-ekspression, hvilket fører til en reduktion i selvfornyelse af progenitorceller. Udtømningen af ​​de resterende CM-stamceller fører til en reduktion i nefrontal og udvikling af arteriel hypertension ognyrelidelser i voksenalderen (fig. 10). I overensstemmelse med det fra Boivin et al., viser vores resultater, at øget CM-catenin forstyrrer UB-vækst og nefrogenese [59]. Undersøgelser har vist, at vækstfaktor glial-afledt neurotrofisk faktor (GDNF), en afgørende regulator af UB-vækst, signalerer gennem c-Ret-tyrosinkinase-receptoren og Gfra1-co-receptoren [60, 61]. I 17-DG LP afkom, en betydelig

stigning i c-Ret-receptorkodende mRNA ville teoretisk føre til en stigning i UB-vækst. I denne undersøgelse var GDNF-ekspression dog uændret, hvilket tyder på, at trods en stigning i cRet-mRNA blev UB-forgrening reduceret. Tidligere observerede vi en reduktion på 28,3 procent i ureteriske knoppgrene efter 14,5 dages svangerskabsproteinrestriktion [4], hvilket kunne være forbundet med en 28 procent reduktion i seks-2-mærkning af MM-celler, på trods af ingen ændring i GDNF transskription. -catenin interagerer sandsynligvis med c-ret-receptoren og transporteres til UB-cellens kerne, hvilket fremmer TGF -1-ekspression i epitelceller, hæmmer UB-forgrening og forårsager for tidlig differentiering af CM-stamceller, som det ses i {{11} }DG LP afkom [62-64]. Derfor er GDNF muligvis ikke essentiel til at formidle mesenkymale signaler til ureterknoppen; mekanismen mangler dog at blive belyst. Faktisk har vi påvist, at MM fra 17-DG LP-afkom viste en specifik stigning i Let-7 miRNA-ekspression, hvilket resulterede i betydeligt svækketnyreudvikling, hvilket bekræfter den modulerende rolle af disse gener i udviklingstimingen af ​​nefrogenese [65].

I indledende undersøgelser af insulinlignende vækstfaktorer (IGF) blev de dominerende roller af IGF-1 og -2 i fostervækst belyst af rigelige, men for det meste indirekte, beviser. IGF'er viste sig at fungere som proliferations- og differentieringsfaktorer i dyrkede føtale celler og præimplantationsembryoner. Desuden blev IGF'er fundet at blive udskilt af dyrkede føtale celler og eksplantater in vitro [66]. Vækstfaktorer, herunder IGF, kan forårsage en delvis eller fuld epitel-mesenkymal overgang. Aktiveringen af ​​IGF-veje resulterer i opregulering af EMT ved at inducere ZEB1-ekspression [67]. Selvom flere kandidatvækstfaktorer er involveret inyreudvikling, om de er involveret i nefrogenese er ukendt. Forskellige vækstfaktorer kan være nødvendige på forskellige tidspunkter. Nogle vækstfaktorer kan være overflødige i denne sammenhæng. Under embryonal udvikling er sekventielle runder af EMT og MET nødvendige for at differentiere specialiserede celletyper og skabe en tredimensionel struktur. I denne undersøgelse blev mesenkymal-epitelial interkonvertibilitet fundet at opretholde celleplasticitet, hvilket tyder på tilstedeværelsen af ​​et meget inducerbart system under LP-betingelser for embryoet. Ekspressionen af ​​Let-7 miRNA-familien er blevet grundigt undersøgt i forskellige føtale væv. Stigningen i Let-7 miRNA-ekspression er relateret til reduceret proliferation og tidlig stigning af MM-celledifferentiering og følgelig nedsatte nefrontal [27, 15, 68-71]. Højere Let-7-ekspression er blevet påvist i højere organismer under den sidste fase af cerebral embryogenese hos gnavere [72, 73]. Nagalakshmi et al. afslørede, at Let-7 miRNA-ekspression ændrede UB-epitelcelles skæbne fra precursor til differentieret tilstand [71]. I modsætning hertil har Yermalovich et al. demonstreret, at overekspressionen af ​​Lin28b, et RNA-bindende protein, er forbundet med undertrykkende Let-7 miRNA'er. Selvom lin28 og Let-7 er kendte regulatorer af ontogen timing hos hvirvelløse dyr, er disses rolle i pattedyrs organudvikling ikke forstået [65]. I denne undersøgelse kunne stigningen i Let-7a-5p miRNA-ekspression i LP-fosteret være forbundet med reduceret CM-celleproliferation, hvilket kompromitterer nefrogenese i forhold til NP-gruppen. Vi antager således, at undertrykkelse af CM-celleproliferation og tidlig ophør af nefrogenese forårsaget af øget Let-7 miRNA kan forekomme direkte eller indirekte gennem den forbigående reducerede ekspression af Lin28b i 17-DG LP. Denne effekt kan forringe betydeligtnyreudvikling i 17-DG LP, hvilket bekræfter, at dette gen regulerer udviklingstiming under nefrogenese. I denne undersøgelse falder øget Let-7a-5p miRNA-ekspression sammen med et fald i c-Myc-ekspression. Myc er involveret i spredning, vækst, apoptose og celledifferentiering undernyreorganogenese [74-76]. I LP 17-DG-afkommet var MM c-Myc-genekspression reduceret, og arealet af CM c-Myc-immunreaktivitet var 14 procent mindre sammenlignet med NP-afkommet. Samtidig blev et 14 procent fald i CM-celleantal observeret at reducere 48 procent Ki-67-immunreaktivitet i LP i forhold til NP-afkommet. Undersøgelser har konsekvent vist, at c-Myc spiller en vigtig rolle i den sidste fase af UB-forgrening og i stimulering af CM-progenitorcelleproliferation [74].

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYREINFEKTION

reduceret niveau i stamceller, hvilket holder dem i en udifferentieret tilstand. Men i denne undersøgelse nedregulerede stærk ekspression af Let-7a-5p miRNA i CM c-Myc-ekspressionen, hvilket reducerede progenitorcelleproliferation og tidlig celledifferentiering i LP 17-DG afkom (fig. 10). Undersøgelser omnyreraf c-Myc-transgene mus afslørede et samtidig fald i c-Myc- og S-ix-2-immunopositive CM-celler forbundet med reduceret stamcelleproliferation [74]. Denne undersøgelse viser en signifikant (28 procent) reduktion i seks-2 positive celler, en specifiknyrestamcellemarkør, ligesom det observerede fald i antallet af nefroner, i CM af 17-DG LP-afkommet sammenlignet med det i NP-afkommet. I 2009, Fogelgren et al. påvist, at seks-2-genekspression reduceres under føtal ontogenese, når det er forbundet med nedsat nefrontal, hypertension og kroniskNyresvigt[77]. Således indikerer reduceret seks-2-genekspression i CM-progenitorceller undertrykkelse af signal-induceret differentiering undernyreudvikling i 17-DG LP-afkommet. Ikke desto mindre bør redundans anvendes med forsigtighed - subtile defekter i nefrogenese kan blive tydelige med mere detaljeret analyse eller under andre forhold. IGF1 mRNA-niveauer var højest i den indledende periode med metanephrisk udvikling, hvor transkripter blev påvist i hele MM, hvorimod deres niveauer faldt under yderligere udvikling. Dog undernyreembryogenese, en delikat balance mellem nefron-faciliterende vækstfaktorer (IGF1) og hæmmende vækstfaktorer (TGF -1) regulerer UB-forgrening.

Konklusion

Selvom flere forfattere har studeret nefrogenese [34, 37, 78], er lidt kendt om de mekanismer, der bestemmer nefrontal. Denne undersøgelse viser, at mange MM progenitorcelle miRNA'er, mRNA'er og proteiner er ændret i 17-DG LP afkommet, hvilket fører til reduceret proliferation og tidlig celledifferentiering (Fig. 11). Denne delikate balance mellem fornyelse og differentiering af nefronstamfader er afgørende fornyreudvikling, fordi manglende opnåelse af tilstrækkeligt antal nefroner er en risikofaktor for kroniskenyresygdom.