Immungenekspression og funktionelle netværk i forskellige Lupus Nephritis-klasser Ⅰ

ABSTRAKT

Formål At udforske nytten af ​​NanoString-platformen iopklarende nyreimmuntransskriptioner for klasse III, IV og V lupus nefritis (LN) ved hjælp af en retrospektiv kohorte afformalinfikseret paraffinindstøbt(FFPE) nyrebiopsivæv.

Metoder: Immungentranskriptanalyse blev udført ved hjælp af NanoString nCounter platformen på RNA fra LN (n=55), tynd basalmembran (TBM) sygdom (n=14) og membranøs nefropati (MN) (n{ {2}}) FFPEnyrebiopsivæv. LN-prøver bestod af enkelte klasse III (n=11), IV (n=23) og V (n=21) biopsier uden blandede læsioner. Differentiel genekspression blev udført med NanoString nSolver, med visualiseringer af vulkanplot og heatmaps genereret i R. Signifikante transkripter blev forespurgt for at identificere funktionelle netværk ved hjælp af STRING og gen-ontogeniske termer.

KLIK HER FOR AT FÅ URTEFORMULERING AF CISTANCHE TIL NYRE

Resultater I sammenligning med TBM identificerede vi 52 signifikant differentielt udtrykte gener, der er fælles for alle tre LN-klasser. Pathway-analyse viste berigelse for type I interferon (IFN) signalering, komplement og MHC II pathways, hvor de fleste viste den højeste ekspression i klasse IV LN. Vores klasse IV LN-biopsier viste også signifikant opregulering af NF-KB-signalering og immunologisk berigelse i sammenligning med klasse V LN-biopsier. Transskriptioner fra type I IFN-vejen skelnede klasse V LN fra MN.

Konklusion Vores transkriptomiske analyse af hele nyresektionen gav indsigt i den molekylære profil af klasse III, IV og V LN. Dataene fremhævede vigtige veje, der er fælles for alle tre klasser og veje beriget i vores klasse IV LN-biopsier. Evnen til at afsløre molekylære veje i LN ved hjælp af hele FFPE-biopsisektioner kunne have klinisk nytte ved valg af behandling for LN.

INTRODUKTION

Lupus nefritis(LN) er en vigtig manifestation af systemisklupus erythematosus(SLE) og udvikler sig hos ca. 40 % af patienterne.1 Dens udbredelse er påvirket af alder (højere ved SLE i barndommen) og etnicitet (højere hos ikke-kaukasiske patienter) og er omvendt forbundet med socioøkonomisk status.2nyrebiopsier en vigtig del af håndteringen af ​​LN3 4, og der er gjort en betydelig indsats for at relatere de ændringer, der ses i biopsien, til patogenese, behandlingsvalg og prognose.1 Kritisk for dette var udviklingen af ​​et LN-klassifikationssystem, der inkorporerede standardiserede definitioner af biopsilæsioner for at reducere interrapporterende variabilitet.

International Society of Nephrology/ Renal Pathology Society (ISN/RPS) 2003 konsensusklassificering af LN5 beskrev seks klasser: minimal mesangial LN (klasse I); mesangial proliferativ LN (klasse II); fokal LN (klasse III); diffust LN, som yderligere kunne opdeles i diffus segmental (klasse IV-S) og diffus global (klasse IV-G) proliferativ LN; membranøs LN (klasse V) og fremskreden skleroserende LN (klasse VI). Aktive (A, f.eks. endokapillær hypercellularitet, fibrinoid nekrose, cellulær og mikrocellulær halvmåne) og kronisk (C, f.eks. glomerulær sklerose, fibrøs halvmåne) glomerulære læsioner blev også defineret og angivet, når klasse III og IV blev beskrevet. For eksempel beskrev klasse IV-G (A) diffust globalt proliferativt LN med aktive læsioner. En opdatering af denne klassifikation er blevet foreslået.6 Anbefalinger omfattede eliminering af klasse IV-S og IV-G underopdelingerne, da disse ikke har indflydelse på resultatet. I en metaanalyse er forekomsten af ​​entennyresygdom i slutstadietellerfordobling af serumkreatininadskilte sig ikke mellem IV-S og IV-G klasser.7 Det blev også foreslået at erstatte de aktive og kroniske deskriptorer med aktivitets- og kronicitetsindekser afledt af NIH lupus aktivitets- og scoringssystemet8, hvilket muliggør en kvantitativ vurdering af aktivitet (en score på 0 til 24) og kronicitet (en score på 0 til 12).

LN-klassen er afgørende for at informere ledelsen.3 Immunsuppression anbefales i aktiv klasse III og IV LN, men ikke i klasse II LN. Beslutningen om at starte immunsuppression i klasse V LN er påvirket af graden af ​​proteinuri og dets respons på renin-angiotensin-aldosteron blokade. Manglende kontrol med proteinuri 12 måneder efter behandling er forbundet med progression til kronisk nyresygdom9-11, så ledelsens mål er at reducere proteinuri med henblik på en fuldstændig klinisk respons (<0.5–0.7 g per 24 hours).

LN-klassen alene er mindre robust til at informere om resultater, fordirisikofaktorer for udvikling af kronisk nyresygdomomfattekliniske trækog fordi de inkluderer histologiske træk, der ikke er fanget af LN-klassedefinitionerne. Disse omfatter graden af ​​interstitiel fibrose og tubulær atrofi (IFTA) og specifikke glomerulære læsioner såsom fibrinoid nekrose og fibrøse halvmåner.12 Kvantificering af udvalgte og veldefinerede individuelle nyrelæsioner kan informere om prognosen. Dette er tydeligt i IgA nefropati, hvor scoring af mesangial cellularitet, endocapillær hypercellularitet, segmental sklerose, tubulær atrofi, interstitiel fibrose og halvmåner for at danne MEST-C scoren har vist sig at hjælpe med risikoforudsigelse.13-15 De foreslåede revisioner af ISN /RPS 2003 konsensusklassificering af LN kan løse disse mangler6, men er stadig baseret på brugen af ​​morfologi. Derfor er der behov for at studere de molekylære veje inden for LN-biopsier og forstå, hvordan disse relaterer sig til LN-klasser16 17 og behandlingsresultater.18 19 Med hensyn til klinisk anvendelighed er den transkriptomiske analyse af nyrebiopsier mest avanceret i diagnosticering af antistofmedieret nyreafstødning, hvor en stigning i ekspression af gentranskripter i biopsivæv i afventning af validering er blevet tilføjet til validerede morfologiske kriterier.20 At bestemme nytten af ​​at bruge transkriptomiske data til at forbedre nyrens kliniske nytteværdi. biopsi i SLE brugte vi NanoString-teknologi til at studere ekspressionen af ​​750 immun- og inflammationsrelaterede transkripter i formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) sektioner fra 55 LN-biopsier, 14 biopsier med tynd basalmembran (TBM) sygdom og 9 biopsier med membranøs nefropati (MN).

METODER

Prøver: FFPE-nyrebiopsivæv blev opnået fra arkiverede LN-, TBM- og MN-prøver overskud til klinisk brug, og hvor tilstrækkeligt væv var tilgængeligt til analyse. Lupus-biopsier med enten blandede læsioner eller signifikant ardannelse blev udelukket. TBM blev brugt som sygdomsbekæmpelse på grund af manglende tilgængelighed af normale nyrebiopsier. Kliniske parametre blev indsamlet fra sundhedsjournalerne retrospektivt. Interferon (IFN) scorematrix blev opnået som tidligere rapporteret.21 Komplet respons blev defineret som et urinprotein/kreatinin-forhold (uPCR) på<50mg/mmol and an estimated glomerular filtration rate (eGFR) of ≥60mL/min, or if <60mL/min at baseline not fallen by >20 % efter 1 år efter biopsi. Delvis respons blev defineret som en uPCR<300mg/mmol with a≥50% improvement from baseline and eGFR criteria the same as for complete response. Non-response was defined as failing to achieve partial response by 1 year.

RNA-ekstraktion

Seks 10 μm tykke helvævssektioner blev opnået med mikrotom fra hver FFPE-blok efter fjernelse af to 4 μm sektioner. For at forhindre krydskontaminering blev udstyret renset med RNase Away mellem prøverne, og et frisk blad blev brugt til hver prøve. Helvævs-RNA-isolering blev udført samme dag ved hjælp af RNeasy FFPE-kittet (Qiagen, #73504), og RNA-koncentrationen blev evalueret med NanoDrop ND1000 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA; online supplerende data S1).

Transkriptomanalyse

Transcriptome analysis was performed using 100ng of total RNA on the NanoString nCounter platform (NanoString nCounter FLEX Dx analysis system, NanoString Technologies, Seattle, Washington, USA) with a probe CodeSet comprising the human PanCancer immune profiling panel (730 immune-related genes, 40 housekeeping genes, 6 positive control genes, 8 negative control genes) and additional 20 custom probes selected based on literature review (online supplemental table 1). Samples were run using two CodeSets which differed only by 10 unique probes, enabling us to analyze 750 endogenous transcripts across the 78 samples. CodeSet One: LN class III (n=6), class IV (n=9), class V (n=8), TBM (n=8), MN (n=1). CodeSet Two: LN class III (n=5), class IV (n=14), class V (n=13), TBM (n=6), MN (n=8). All samples passed NanoString quality control parameters (image quality control, binding density, positive control linearity and limit of detection). To control for inter-CodeSet variation and batch variability we used the nSolver Cross Reporter Library File (RLF) function to calibrate raw counts of overlapping probes using an identical sample run on both CodeSets. To reduce technical bias, and increase confidence and reproducibility, background thresholding was set at 100 counts, which is >dobbelt (gennemsnitlig+2 SD) af negative kontrolprober. Optællinger blev normaliseret til det geometriske gennemsnit af 10 husholdningsgener (FCF1, HPRT1, MRPS5, MTMR14, POLR2A, PRPF38A, SDHA, SF3A3, TUBB og ZC3H14), udvalgt som de blev udtrykt på tværs af alle prøvetyper. De normaliserede tællinger for alle prøver er opført i online supplerende data S2.

Statistisk analyse

Differentiel genekspression (DGE) blev udført ved hjælp af solver avanceret analyse (V.4) Fast/Approximate algoritme, som bruger den forenklede negative binomiale model for alle prober undtagen hvor algoritmen ikke konvergerer, og den lineære regressionsmetode anvendes. LN, MN eller LN-klassen (III, IV og V) blev brugt som de uafhængige variable og TBM som vores referencegruppe. Tærskeltællingen blev sat til 100 og observationsfrekvensen i prøver sat til 8 %; P-værdien blev justeret ved hjælp af Benjamini-Hochberg-metoden med den falske opdagelsestærskel for sat til 0.05. Vulkanplot blev produceret ved hjælp af Enhanced Volcano-pakken (https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano) i R.22 Funktionel protein-association netværksvisualisering blev udført ved hjælp af STRING-databasen (https:// string-db.org/) , ved hjælp af hele STRING-netværket. Netværkskanter blev defineret ved tillid, og interaktioner blev sat til den højeste konfidensinteraktionsscore (større end eller lig med 0,9). Afbrudte noder i netværk blev ikke vist. Signifikante differentielt udtrykte gener blev evalueret for berigelse af Gene Ontology (GO) termer (biologiske processer, molekylære funktioner, cellulære komponent), reaktomveje og STRING lokale netværksklynger. Visuelle interaktionsnetværk blev genereret med funktionelle berigelser i GO-termer (biologiske processer) og STRING-analyse. Arealproportional Venn Diagram over overlappende differentielt udtrykte gener mellem LN-underklasser blev genereret med BioVenn (www.biovenn. nl).23 Data fra avanceret analyseløsningssoftware blev læst ind i det statistiske R-miljø, og datavisualisering blev udført ved hjælp af boxplots, principalkomponentanalyse, vulkanplot og varmekort. Heatmaps blev genereret ved hjælp af Z-scorer af normaliserede tællinger og pheatmap i R. Klynger blev analyseret ved hjælp af Fisher eksakte test. Variansanalyse med Sidaks multiple sammenligningstest blev brugt til sammenligning af flere grupper. Data blev analyseret under anvendelse af GraphPad Prism (V.8.0).

Erklæring om patient og offentlig involvering (PPI).

Denne undersøgelse var en del af MASTERPLANS-konsortiet, og patientsamarbejdspartnere deltog i alle arbejdsområder, inklusive denne undersøgelse. En ordliste med termer blev udarbejdet af PPI for at muliggøre yderligere engagement med det bredere patientsamfund, og forskningsresultater blev inkluderet på læggennemgangsdagene. Læganmeldelser af publikationer deles på MASTERPLANS-webstedet (https://sites. manchester.ac.uk/masterplans).

Supportive Service Of Wecistanche - Den største cistanche-eksportør i Kina:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tlf:+86 15292862950

Shop for flere specifikationer detaljer:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

FÅ NATURLIGE ØKOLOGISKE CISTANCHE EKSTRAKT MED 25% ECHINACOSIDE OG 9% ACTEOSIDE TIL NYRE