Sådan udtrykkes i menneskelige nyrer og urinveje med humant defensin 5

For flere oplysninger:ali.ma@wecistanche.com

John David Spencer et al

Abstrakt

Baggrund:De mekanismer, der opretholder sterilitet i urinvejene, er ufuldstændigt forstået. Nylige undersøgelser har impliceret vigtigheden af ​​antimikrobielle peptider (AMP) for at beskytte urinvejene mod infektion. Her karakteriserer vi udtrykket og relevansen af ​​AMP human alfa-defensin 5 (HD5) i det menneskeligenyreog urinveje hos normale og inficerede forsøgspersoner.

Metode/hovedfund:Brug af RNA isoleret fra menneskernyre, urinleder og blærevæv udførte vi kvantitativ realtids-PCR for at vise, at DEFA5, genet der koder for HD5, udtrykkes konstitutivt i hele urinvejene. Med pyelonefritis steg DEFA5-ekspression signifikant inyre. Ved hjælp af immunoblotanalyse steg HD5-produktionen også med pyelonefritis. Immunfarvning lokaliserede HD5 til urothelium i blæren og urinlederen. I nyrerne blev HD5 primært produceret i det distale nefron og samlerør. Ved hjælp af immunoblot- og ELISA-assays blev HD5 ikke rutinemæssigt påvist i ikke-inficerede humane urinprøver, mens det betød, at urin-HD5-produktionen steg med E.coli-urinvejsinfektion.

Konklusioner/Betydning:DEFA5 udtrykkes i hele urinvejene hos ikke-inficerede forsøgspersoner. Specifikt udtrykkes HD5 i hele urothelium i de nedre urinveje og i samlerørene inyre. Med infektion øges HD5-ekspression inyre, og niveauer bliver sporbare i urinen. Så vidt vi ved, repræsenterer vores resultater de første til at kvantificere HD5-ekspression og produktion i den menneskelige nyre. Desuden er dette den første rapport, der påviser tilstedeværelsen af ​​HD5 i inficerede urinprøver. Vores resultater tyder på, at HD5 kan have en vigtig rolle i at opretholde urinvejssterilitet.

Cistanche UK for nyresygdom, klik her for at få prøven

Introduktion

Urinvejene, bortset fra urethral meatus, er sædvanligvis sterile på trods af dens nærhed til fækal flora. De præcise mekanismer, hvorved urinvejene opretholder sin sterilitet, er ikke godt forstået. Foreslåede mekanismer, der bidrager til forsvaret af urinvejene, omfatter urinstrømning, ændringer i urinens pH og osmolaritet, regelmæssig blæretømning, kemiske forsvarskomponenter i uroepithelium og epitelafgivelse/tilstrømning af effektorimmunceller med bakteriel stimulering [1]. Derudover har antimikrobielle peptider (AMP'er) for nylig vist sig at have en vigtig rolle i opretholdelse af urinvejssterilitet [2].AMP'er, der fungerer som naturlige antibiotika, produceret af næsten alle organismer, er en allestedsnærværende komponent i det medfødte immunsystem. AMP'er er kationiske molekyler udtrykt af fagocytiske hvide celler og epitelceller. Hos mennesker og andre pattedyr er defensiner en stor familie af AMP'er. Defensiner har typisk bredspektret antimikrobiel aktivitet mod gram-positive og gram-negative bakterier, vira, svampe og protozoer [2,3]. Defensiner syntetiseres oprindeligt som præproproteiner og gennemgår forarbejdning for at blive modne, biologisk aktive peptider [4]. Hos mennesker er defensiner klassificeret i en af ​​to familier afhængigt af deres disulfidbromønster - alfa-defensinerne eller beta-defensinerne [5].

I urinvejene er beta-defensiner bredt udtrykt i hele uroepithelium. Epitelceller foring afnyreløkke af Henle, distale tubuli og opsamlingskanal udtrykker konstitutivt humant beta-defensin 1 (hBD1). Selvom urinniveauer af hBD1 er utilstrækkelige til at dræbe invaderende bakterier, giver hBD1 en hurtigtvirkende antimikrobiel belægning af tubulære lumen og forhindrer infektion ved at hæmme bakteriel tilknytning til urothelium [6]. Nylige undersøgelser viser, at redox-tilstanden af ​​hBD1 signifikant påvirker antimikrobiel styrke, således at det reducerede peptid er meget mere potent end den disulfid-bundne oxiderede form [7]. Betydningen af ​​dette ved uroteloverfladen er ikke blevet bestemt. Et andet defensin, humant beta-defensin 2 (hBD2), udtrykkes ikke konstitutivt i sundt nyrevæv; hBD2-ekspression induceres dog af infektion [8].

I modsætning til beta-defensinerne er rollen af ​​epitelafledte alfa-defensiner ikke godt beskrevet i urinvejene. Ekspressionen og funktionen af ​​alfa-defensiner HD5 og HD6 er for det meste blevet rapporteret i tyndtarmen, hvor de udskilles af Panethceller i tarmkrypterne og bidrager til balancen af ​​tarmmikrobiota [9]. HD5 er også blevet lokaliseret i de mandlige og kvindelige kønsorganer, med beviser, der tyder på, at det er inducerbart og vigtigt til at udrydde infektion [10,11,12]. Urin-HD5 er blevet påvist hos patienter, der har gennemgået ileal neoblærerekonstruktion og ileal conduit urinafledning, hvorved kilden til HD5-produktion primært blev krediteret til ileal Paneth-celler [13,14]. HD5 har antibakteriel aktivitet mod almindelige uropatogene gram-positive bakterier og gram-negative bakterier [15]. HD5 har også antimikrobiel aktivitet mod uropatogene vira som adenovirus og BK-virus [16,17,18]. I denne undersøgelse giver vi den indledende beskrivelse og kvantificering af HD5-ekspression i mennesketnyreog yderligere definere dets udtryk i de nedre urinveje under sterilitet og infektion.

Resultater

DEFA5 mRNA udtrykkes konstitutivt i den menneskelige blære, urinleder og nyre

Kvantitativ realtids-PCR viser, at alle testede blære-, urinleder- og nyreprøver uden infektion konstitutivt udtrykte DEFA5. DEFA5-ekspression var signifikant større i de nedre urinveje end i de øvre urinveje (p= 0.014). I blæren (n=4) var den gennemsnitlige DEFA5-ekspression 4.656.637 transkripter pr. 10 ng RNA, og i urinlederen (n=4) var den gennemsnitlige DEFA5-ekspression 4.1126170 transkripter pr. 10 ncRNA (figur 1A) . I nyren (n=6) var den gennemsnitlige DEFA5-ekspression 2.9376274 transkripter pr. 10 ng RNA. DEFA5-ekspression blev analyseret separat i nyrebarken, medulla og bækken. DEFA5-ekspression varierede ikke signifikant efter nyreregion (p= 0.45).

DEFA5-ekspression og HD5-peptidekspression øges med pyelonefritis

Kvantitativ realtids-PCR-analyse udført på nyrevæv med pyelonefritis viste en signifikant stigning i DEFA5-ekspression sammenlignet med ikke-inficeret nyrevæv. Med pyelonefritis (n= 6), steg gennemsnitlig DEFA5-ekspression til 7.82961.052 transkripter pr. 10 ng RNA (p= 0.019) (figur 2A).

For yderligere at evaluere denne stigning i ekspression med pyelonefritis udførte vi immunoblot-analyse på det samme nyrevæv, der blev brugt til real-time PCR-analyse for at evaluere for samtidige stigninger i HD5-peptidproduktion (figur 2B, midterste panel). Immunoblotanalyse ved anvendelse af polyklonale HD5-antisera viste signifikant større HD5-peptidproduktion i nyrevæv med pyelonefritis (n=6) sammenlignet med ikke-inficeret nyrevæv (n=6). Ikke-inficeret nyrevæv udtrykte 300625 ng HD5/gram vådt vævsvægt, mens nyrevæv med pyelonefritis udtrykte 600621 ng HD5/gram vådt vævsvægt (p,0,0001). Blots blev re-probed med GAPDH for at tjene som en ladningskontrol (figur 2B, midterste panel), og en sølvfarvning blev også udført for at bekræfte ens proteinbelastning (figur 2B, toppanel).

HD5-peptid produceres i hele den menneskelige nyre og urinveje

Immunfarvning blev udført for at lokalisere HD5-produktion i urinvejene. Immunhistokemi (IHC) viste, at HD5-immunoreaktivitet var til stede i hele urothelium i urinlederen og blæren i alle undersøgte prøver (n=4, figur 3). IHC viste også, at HD5 blev produceret i tubuli i nyrebarken og medulla af alle prøver (n= 6, figur 4). Immunfluorescens (IF) viste, at HD5-ekspression var størst i den distale nefron og de samlende tubuli (figur 5). Interstitium og glomeruli viste ikke HD5-immunreaktivitet. Immunfarvningen vist i figur 3, 4 og 5 blev udført under anvendelse af et muse monoklonalt anti-HD5-antistof (8C8), der genkender HD5-propeptidet (Abcam, Cambridge, MA). Resultaterne var ens ved brug af polyklonalt anti-HD5-antistof fra kanin, der genkender HD5-propeptidet og det modne peptid (data ikke vist) - hvilket tyder på, at HD5 er lagret som et propeptid.

Med pyelonefritis steg HD5-immunfarvning markant. HD5-immunreaktivitet steg i hele den proksimale nefron, den distale nefron og de samlende tubuli (figur 4 og figur 5). Som i ikke-inficerede prøver viste glomeruli og interstitium ingen HD5-ekspression med infektion. Negative kontroller viste ingen HD5-immunreaktivitet.

Inficeret menneskelig urin indeholder målbare

koncentrationer af HD5-peptid

Immunoblot-analyse ved anvendelse af kanin-polyklonalt antiserum, der detekterer precursoren proHD5, og yderligere bearbejdede former identificerede målbare niveauer af HD5 i 13 af de 15 testede urinprøver inficeret med uropatogene E. coli (figur 6A og B). Når de var til stede, varierede HD5-niveauer, normaliseret til urinkreatinin, fra 299,8-669,7630 ng HD5/mg urin Cr (110,67 ng/mL-276,67 ng/mL), hvilket svarer til 11,10-27,67 nmol/L. I inficerede urinprøver (n=15), var HD5 ved eller under detektionsgrænsen på (,50 ng). Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) på de samme urinprøver, ved brug af det muse monoklonale antistof (8C8), der kun detekterer precursoren proHD5, påviste målbare niveauer af proHD5 i 13 af de 15 inficerede testede prøver. UrinproHD5-koncentrationer varierede fra 122,78-490,060,03 ng HD5/mg urin-Cr (30,02 ng/mL-200,5 ng/mL), når det er til stede (figur 7).

Diskussion

I denne undersøgelse giver vi den indledende karakterisering af HD5 i den menneskelige nyre, urinleder og blære. HD5 har vist sig at være en vigtig AMP, der forhindrer invasiv infektion i tarmen og opreguleres i kønsorganerne under infektion[11,18,19,20,21]. Epitelafledte AMP'er, som HD5, har vist sig at være vigtige for at opretholde sterilitet i urinvejene [8,22,23,24]. Mangler i disse medfødte slimhindeforsvar kan resultere i akut og/eller kronisk infektion [25,26].

Vores kvantitative real-time PCR-resultater viser, at DEFA5 er konstitutivt udtrykt i de menneskelige nyrer, urinledere og blære. DEFA5-ekspression øges fra de øvre urinveje til de nedre urinveje – efter strømmen af ​​urinstrømmen og den stigende nærhed til mikrobiotaens invasionspunkt. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse, der kvantificerer DEFA5-ekspression i den menneskelige nyre og blære. For nylig demonstrerede Townes et al, at normal distal ureter kan udtrykke DEFA5 [14]. Vores resultater tyder også på, at DEFA5 er konstitutivt udtrykt af den distale ureter. Selvom DEFA5-ekspression i urinvejene er næsten 100-fold lavere end den, der findes i gastrointestinale væv, er basal uroepithelial ekspression af DEFA5 sammenlignelig med ekspressionen af ​​tidligere beskrevne urinvejsforstærkere som cathelicidin, hBD-1, hBD -2 og ribonuklease 7[6,8,22,24,27]. I modsætning til den modne mave-tarmkanal, hvor DEFA5 udtrykkes i høje niveauer i både helbredstilstande og infektion/inflammation, er vores kvantitative realtid PCR-data viser, at DEFA5-ekspression i nyren er signifikant opreguleret med infektion [27,28,29]. Dette inducerbare ekspressionsmønster er analogt med DEFA5-ekspression i den kvindelige forplantningskanal, hvor DEFA5-ekspression øges med salpingitis [30]. I urinvejene har Townes et al vist en tendens i retning af større ureteral ekspression af DEFA5 hos patienter med UTI'er, som har gennemgået ileal conduit urinafledning [14].

Vores immunoblot-analyse supplerer real-time PCR-dataene ved at demonstrere, at HD5-peptidproduktionen stiger med pyelonefritis. Dette inducerbare mønster for HD5-produktion svarer til det, der ses hos nogle medlemmer af beta-defensin-familien. hBD2 viser et inducerbart produktionsmønster med infektion i urinvejene og/eller kronisk pyelonefritis [8,31,32]. HD5-peptidproduktion har vist sig at stige i den øvre kvindelige kønsorgan og mandlige urinrør med betændelse [11,30].

Ved hjælp af immunfarvning demonstrerer vi, at HD5 produceres ensartet i hele urinlederens og blærens urothelium. Fordi langt størstedelen af ​​UTI'er skyldes fækal flora, der stiger ind i blæren, tyder disse resultater på, at HD5-ekspression er til stede på steder, hvor mikrobiel eksponering forekommer hyppigst [33]. Derfor er HD5 ideelt placeret til at forhindre stigende mikrobiel infektion. I nyrerne produceres HD5 primært i den distale nefron og samlerøret. Disse resultater tyder på, at HD5 produceres på steder, hvor det vil være positioneret til at have optimal antimikrobiel aktivitet. Tidligere undersøgelser har vist, at defensinernes antimikrobielle egenskaber er afhængige af saltkoncentrationen - med højere saltkoncentrationer, der reducerer antimikrobiel aktivitet [23,34,35]. Vi spekulerer i, at de lave saltkoncentrationer af det distale nefron og samlende tubuli giver et gunstigt miljø for HD5 antimikrobiel aktivitet.

Immunoblot og ELISA-analyse viser også, at HD5 udskilles i urinen i lave niveauer. I betragtning af størrelsen (8,1 kDa og 3,7 kDa) og den positive ladning af proHD5 og fuldt bearbejdet HD5, er det muligt, at noget HD5-peptid i urin stammer, i det mindste delvist, fra plasmafiltrat. Alligevel er der kun få beviser, der tyder på, at HD5 fortsætter i plasmaet [27]. For at optræde i urinen vil HD5 desuden skulle undslippe de effektive peptidabsorptionsmekanismer i den proksimale tubuli [6,36]. Endelig gennemgik de anvendte urinprøver centrifugering, før analyserne blev udført, hvorved cellulære kilder til HD5 blev fjernet. Ved de påviste koncentrationer er det usandsynligt, at urin HD5 er direkte antimikrobiel mod uropatogene mikroorganismer, da fuldt forarbejdet HD5 har en minimal hæmmende koncentration (MIC) mellem 6-10 mg/ml mod almindelige gramnegative uropatogene bakterier [15]. Imidlertid er slimhindeoverfladekoncentrationer sandsynligvis højere. Ydermere viser immunoblotanalyse, at HD5-koncentrationer er signifikant større i nyrerne. Disse resultater tyder på, at HD5 er involveret i slimhindeforsvaret af urinvejene. Et analogt mønster ses med hBD1, hvor urinkoncentrationer af hBD1 er utilstrækkelige til at udvise antimikrobiel aktivitet, men højere peptidkoncentrationer påvises nær de renale tubuli [6,31].

Fordi IHC demonstrerer, at proHD5 er en hovedform for HD5 i nyrerne, og fordi både moden og proHD5 detekteres i urinen, spekulerer vi i, at HD5 primært udskilles som et precursor-molekyle og derefter gennemgår proteolytisk behandling for at generere modne former - svarende til mave-tarmkanalen. og genitourinære kanaler [11,30,37]. I tyndtarmen producerer Paneth-celler trypsin, som spalter HD5-propeptidet, så det fuldt bearbejdede peptid er den dominerende form i tarmens lumen [37]. I det mandlige urinrør er nøglebearbejdnings- og aktiverende enzymer for HD5 neutrofile proteaser, der bidrages af

neutrofiler rekrutteret til infektionsstedet [11]. Bidragene fra epiteltrypsinogen, urintrypsin og/eller neutrofile proteaser til HD5-behandling i urinvejene under infektion er endnu ikke fastlagt. Desuden er virkningerne af ændringer i urinmiljøet på HD5-funktionen (ændringer i osmolaritet, pH og kationiske koncentrationer) også endnu ikke fastlagt.

Som konklusion er dette den første undersøgelse, der identificerer og kvantificerer ekspressionen og produktionen af ​​HD5 i urinvejene. Vores resultater tyder på, at HD5 er et epitelafledt AMP, der kan spille en vigtig rolle i den medfødte immunitet af det humane uroepithelium, der forhindrer translokation af invaderende patogener ind i kredsløbet. Belysning af de faktorer, der regulerer HD5-produktion, kan give ny indsigt i patogenesen af ​​UTI'er hos patienter med risiko for UTI'er og patienter med kroniske infektioner.

Metoder

Studiegodkendelse

Der blev indhentet informeret skriftligt samtykke fra alle patienter, der deltog i denne undersøgelse. For forsøgspersoner under 18 år blev der indhentet skriftligt samtykke fra forældre/værge. NationwideChildren's Hospital (NCH) Institutional Review Board godkendte denne undersøgelse sammen med samtykkeprocessen og dokumenterne (IRB07-00383).

Humane vævs- og urinprøver

Ikke-inficeret distalt ureter og blærevæv (n= 4) blev opnået fra børn, der gennemgår ureteral re-implantation af andre årsager end tilbagevendende infektion. Ikke-inficerede nyreprøver (n=6) blev opnået fra patienter, der gennemgår nefrektomi for nyretumorer. Vævsprøver var fri for makroskopiske tegn på sygdom eller betændelse. Nyrevæv fra patienter med kronisk pyelonefritis blev leveret af Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38]. To uafhængige patologer bekræftede den histopatologiske diagnose pyelonefritis. Vævsprøver blev lynfrosset eller konserveret som neutrale formalinfikserede paraffinindlejrede sektioner. Sektioner af ikke-inficeret nyrevæv blev dissekeret i cortex, medulla eller nyrebækken før opbevaring (n=4).

Ikke-inficerede og inficerede urinprøver blev indhentet fra børn, der mødte på NCH skadestuen eller nefrologisk klinik. Diagnosen af ​​en UVI blev stillet af en positiv urinkultur i henhold til American Academy of Pediatrics Guidelines [39]. Alle inficerede urinprøver havde 106 CFU/mL E.coli. Urinernes pH-værdier varierede fra 5,5 til 8,5 (gennemsnitlig urin 6,9). Den urinære ioniske sammensætning blev ikke målt. Urinprøver blev centrifugeret for at fjerne urinsediment, og en proteaseinhibitorcocktail blev tilsat (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).