Hvordan spiller phenylethanoidglycosider, den aktive ingrediens i Cistanche, en neurobeskyttende rolle?

Xue Gong†a , Yan Xu†b , Kai Renc , Xiaorong Baid , Chunhong Zhanga

ABSTRAKTI denne undersøgelse isolerede vi ottephenylethanoidglykosiderfra Paraboea martini for første gang og evaluerede mekanismen bag deresneurobeskyttendeeffektermod H2O2--induceret skade i PC12-celler. MTS-metoden blev brugt til at screenephenylethanoidglykosiderfor beskyttelsesevne. Dernæst blev qRT-PCR og western blotting-analyse brugt til at detektere transkriptionsniveauerne af HO-1 og GCLC, som er reguleret af Nrf2. Inhibitoren ZnPP blev brugt til at analysere involveringen af ​​Nrf2 i HO-1-ekspression. Analyser viste, at caleolariosid B, parabosid B og parabosid II også opregulerede ekspressionen af ​​HO-1, men viste ingen tydelig effekt på GCLC. Forbehandling med ZnPP reducerede markantneurobeskyttendeeffekter. Således inducerede phenylethanoidglycosider isoleret fra P. martini PC12-celler fra H2O2-skade ved at opregulere HO-1. Resultaterne gav bevis for, at P. martini kunne være et potentielt terapeutisk middel til behandling afneurodegenerativsygdomme.

ARTIKELHISTORIEModtaget 8. april 2019 Accepteret 30. juli 2019

SØGEORDParaboea martini;phenylethanoid glycosider; neurobeskyttende virkninger; zinkprotoporphyrin; HO-1

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Mekanismen for den neurobeskyttende virkning af Cistanche deserticola, klik her for at lære mere

Oxidativt stress er kendt for at spille en væsentlig rolle i patogenesen af ​​flere sygdomme. Det er knyttet til ætiologien afAlzheimers sygdom(AD), Parkinsons sygdom (PD), epilepsi og andre sygdomme [1-3]. På nuværende tidspunkt er der gjort fortsat fremskridt i studiet af patogenesen af ​​AD, PD og andre sygdomme. Men på grund af den begrænsede viden om de molekylære mekanismer, der ligger til grund for AD, PD og andre sygdomme, er effektive forebyggende eller helbredende strategier for disse sygdomme ikke blevet realiseret [4]. H2O2 er en vigtig bestanddel af reaktive oxygenarter (ROS). Følgelig er H2O2-induceret PC12-celleskade den mest almindeligt anvendte model for oxidativt stress og er meget brugt i eksperimentelle undersøgelser af neurobeskyttende virkninger [5]. Heme-oxygenase 1 (HO-1) og glutamat-cystein-ligase-katalytisk underenhed (GCLC) er vigtige cellulære antioxidantenzymer, og begge gener reguleres nedstrøms for nuklear faktor erythroid 2 (Nrf2), som er ved at fremstå som et lovende terapeutisk middel. mål for neurobeskyttelse [6,7].Phenylethanoidglykosider, afledt af C-6-C-3-enheden, indeholder mange phenoliske hydroxylgrupper og har betydelige antioxidant- og antialdringsaktiviteter. I løbet af de sidste par år har undersøgelser vist, at mange lægeplanter indeholder phenylethanoidglycosider, der viser betydelig antioxidantaktivitet. For eksempel er phenylethanoidglycosider afledt af Herba cistanche kendt for at udøve beskyttende virkninger på kognitive underskud i AD. Denne undersøgelse undersøgte den associerede beskyttelsesmekanisme ved hjælp af en AD-ældningsaccelereret prone mus 8 (SAMP8) model. Resultaterne indikerede, at phenylethanoidglycosiders evne til at forbedre kognitive underskud hos SAMP8-mus kan være relateret til fremme af synaptisk plasticitet, der involverer antioxidantprocesser [8]. I denne undersøgelse blev to phenylethanoid glycosider adskilt og oprenset fra Tectona grandis (teak) træknuder; disse forbindelser udviste bemærkelsesværdige antioxidantvirkninger, som blev bestemt ved hjælp af en amperometrisk metode [9]. Yderligere udøver caffeoylphenylethanoidglycosidforbindelser fra Lindernia ruellioides dosisafhængige antioxidant- og superoxidanionfrie radikaler-fjernende virkninger in vitro [10]. Virkningsmekanismerne for phenylethanoidglycosider er relateret til reguleringen af ​​Nrf2/ARE-signalvejen, som påvirker syntesen af ​​SOD, CAT, GSH-PX og andre antioxidantenzymer [11]. Familien Gesneriaceae, som indeholder 150 slægter og cirka 3700 arter, er primært udbredt i de tropiske og tempererede områder i det østlige og sydlige Asien, Oceanien, Sydamerika, Afrika, Sydeuropa og Mexico [12]. Der er 54 slægter og cirka 463 arter, der tilhører Gesneriaceae i Kina. Det blev rapporteret, at omkring 100 arter har medicinsk effekt, og de fleste af disse er hovedsageligt fordelt i Guangxi og Guizhou provinserne [13]. I de senere år er forskningen i Gesneriaceae-planter gradvist steget i forskellige områder af verden, og der er fundet nogle nye bestanddele med fysiologiske aktiviteter [14]. Paraboea martinii (Levl.) Burtt tilhører Parabola (Gesneriaceae) og er en urteagtig plante. Baseret på "The Chinese Traditional Medicine Resource Records" blev det registreret, at hele planten bruges som medicin. Desuden kan det udøve mange farmakologiske aktiviteter på tilstande som hæmatemese, ødem, dysenteri, traumatisk skade og fraktur [15]. Bai beviste detphenylethanoidglykosiderer en af ​​de vigtigste kemiske bestanddele i Gesneriaceae-planter [16]. Det har nogle forskere også fundet ud afphenylethanoidglykosiderhave significant antioxidant activities [17]. Li demonstrated that phenylethanoid glycosides of Cistanche deserticola have significant antioxidant activity [18]. In addition, Ju systematically studied the neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides using PC12 cell models. The results indicated that phenylethanoid glycosides significantly attenuate the damage induced by Aβ1-42 [19]. In our studies, we isolated eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) from P. martini [20]. All compounds were isolated from the genus Parabola for the first time, and the compounds paraboside A, paraboside B, p paraboside I, paraboside II, and paraboside III were new compounds [20]. In a continuing search for molecules with antioxidant properties, phenylpropanoid glycosides were examined. However, whether these phenylpropanoid glycosides from P. martini could protect against H2O2-induced PC12 cell injury was previously unclear. In this study, we examined the protective effects of phenylpropanoid glycosides on H2O2-induced damage to PC12 cells. We also examined the effects and preliminary mechanism underlying the activity of phenylpropanoid glycosides with respect to the activation of HO-1 and GCLC in vitro. Materials and methods Materials Paraboea martini (Level.) Burtt was collected from Daxin County, Guangxi Autonomous Region in August 2014 and verified by Dr. Minhui Li (Baotou Medical College). Voucher specimens were deposited at the Laboratory of Pharmacognosy and Phytochemistry. Eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) were extracted and separated from P. martinii (Levl.) Burtt by prof. Xiaoqin Wang [20]. The purity (>98 procent) af otte phenylpropanoidglycosider blev målt ved HPLC-toparealnormaliseringsmetoden. Som et eksempel er kromatografidiagrammerne for parabosid B og parabosid II vist i figur 1, og deres relative indhold viste sig at være henholdsvis 98,23 procent og 99,20 procent. Den dårligt differentierede rotte adrenal pheochromocytoma cellelinje (PC12) blev købt fra Cell Bank på China Academy of Science (Shanghai, Kina). Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM) og hesteserum blev købt fra Gibco (Gaithersburg, MD, USA). Føtalt bovint serum (FBS) blev købt fra Thermo Fisher Scientific (Hyclone, Waltham, MA, USA). H2O2 blev opnået fra Tianjin Fu Yu Reagent Co., Ltd. (Tianjin, Kina). Trizol blev købt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). PrimeScriptTM RT reagenskit (Perfect Real Time) blev opnået fra TaKaRa Biotechnology Co. (Dalian, Kina). Primere til HO-1, GCLC og GAPDH blev syntetiseret af Sangon Biotech (Shanghai, Kina). CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit (MTS) blev opnået fra Promega Corp. (Madison, USA). Inhibitorer af HO-1 zinkprotoporphyrin (ZnPP) blev købt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Der blev også brugt en Thermo311 CO2-inkubator (Thermo, USA), StepOnePlusTM Real-Time PCR Instrument Thermal Cycling Block (Thermo), Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo) og xCELLigence RTCA DPlus Analyzer og E-Plate 16 (ACEA Biosciences, USA). .

Cellekultur og behandling

PC12-celler blev dyrket i DMEM indeholdende 5 procent FBS og 5 procent hesteserum ved 37 grader i en befugtet 5 procent CO2-atmosfære. PC12-celler blev opdelt i tre grupper som følger: en kontrolgruppe, en modelgruppe og en behandlingsgruppe. Otte phenylpropanoidglycosider blev opløst i DMSO (< 0.01%)="" and="" then="" diluted="" with="" a="" complete="" culture="" medium.="" to="" study="" the="" effects="" of="" the="" eight="" phenylpropanoid="" glycosides="" on="" h2="" o2-induced="" cell="" injury,="" pc12="" cells="" were="" cultured="" with="" the="" eight="" compounds="" at="" concentrations="" of="" 3.125,="" 6.25,="" 12.5,="" 25,="" and="" 50="" μm="" for="" 12="">

Bestemmelse af H2O2

model, vi bestemte den passende koncentration af H2 O2 ved hjælp af real-time cellulær analyse (RTCA). PC12-celler blev podet i en CIM-plade-16 mikroplade ved et volumen på 100 µL og derefter inkuberet i 12 timer ved 37 grader i en atmosfære på 5 procent CO2. PC12-cellerne blev opdelt i kontrol- og modelgrupper. Derefter blev 10 μL H2O2 (50, 100, 200 og 400 μM) tilsat til modelgrupperne, og kontrolgrupperne blev behandlet med 10 μL komplet DMEM, sat op i tre komplekse brønde. E-pladen 16 blev placeret i xCELLigence RTCA, overvåget hvert 15. minut, og resultaterne blev registreret i 32 timer. Virkningen af ​​H2O2 på PC12-celler blev analyseret ved hjælp af xCELLigence RTCA-dataanalysesoftwaren. Celleindeksværdien (CI) blev brugt til at bestemme den optimale H2O2-koncentration og virkningsvarighed.

Forbindelsesekstraktion og isolering

Fraktioner blev adskilt baseret på deres polaritet under anvendelse af tidligere beskrevne metoder. Lufttørret, pulveriseret P. martinii (4 kg) blev successivt ekstraheret tre gange med en 75 procent vandig ethanolopløsning [20]. De opnåede ekstrakter blev derefter koncentreret under anvendelse af en rotationsfordamper for at fjerne ethanol, og råekstrakter blev opnået. Prøverne blev opløst i deioniseret vand og derefter ekstraheret successivt med petroleumsether, ethylacetat, n-butanol og vand. N-butanolekstrakten (400 g) blev fraktioneret under anvendelse af en AB-8 makroporøs harpikssøjle og en ethanol-H2O2-opløsning (0, 1{{47} }, 30, 50, 70 og 95 procent). Seks fraktioner (fraktion 1-6) blev til sidst opnået. Fraktion 3 og 4 blev udsat for separation ved hjælp af en MCI-søjle med en trin-gradient af MeOH-H2O2 (10-100 procent). Derefter blev produkterne isoleret under anvendelse af Sephadex LH-20 med 50 procent MeOH som eluent. Forbindelser 1 (41,0 mg) og 6 (15,6 mg) blev isoleret fra fraktion 3. Forbindelser 2 (62,0 mg), 3 (34,7 mg), 7 (11,0 mg) og 8 (26,0 mg) blev opnået fra fraktion 4 under anvendelse af Sephadex LH-20-kromatografi med 50 procent MeOH som eluent. Endelige isolationer blev udført ved semi-præp, omvendt fase HPLC (Merck LiChrosorb, RP-18, RP-18, 250 × 10 mm) med 50 procent MeOH og UV-detektion ved 280 nm for at give forbindelser 4 (39,0 mg) og 5 (9,0 mg) [20].

Cellelevedygtighedsanalyse

PC12-celler blev podet i 96-brøndsplader ved en tæthed på 2 × 1{{10}}4 celler/brønd ved et slutvolumen på 100 µL . PC12-celler blev inkuberet ved 37 grader med 5 procent CO2 i 12 timer. Derefter blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af råekstrakter (0.025, 0.05, 0.1, 0.2 og 0.4 mg/ml) og forbindelser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 og 8 ved fem koncentrationer (3,125, 6,25, 12,5, 25 og 50 μM). Efter forbehandling i 24 timer blev cellelevedygtighed bestemt ved MTS-assays. PC12-celler blev præinkuberet med eller uden HO-1-hæmmeren uden ZnPP (15 μM) i 30 minutter, derefter inkuberet med eller uden caleolariosid B, parabosid B og parabosid II (3,125 μM) i 12 timer og til sidst inkuberet med 400 μM H2O2 i yderligere 6 timer. Efter behandling blev antallet af overlevende celler bestemt ved et MTS-assay [6].

Beskyttende virkninger af råekstrakter og monomere forbindelser på H2O2-behandlede PC12-celler

Cellerne blev dyrket i en {{0}}brøndsplade ved et slutvolumen på 100 µL. Seriefortyndinger af råekstrakter (0.025, 0,05, 0,1, 0,2 og 0,4 mg/ml) blev tilsat til den behandlede gruppe. Efter forbehandling i 12 timer blev 400 μM H2O2-opløsning (optimal koncentration) tilsat til den behandlede gruppe og H2O2-gruppen i hver brønd i 6 timer. MTS-opløsning blev derefter tilsat til hver brønd, og pladerne blev inkuberet i 3 timer ved 37 grader C. Pladerne blev oscilleret ved lav hastighed i 5 minutter ved stuetemperatur, indtil alle krystaller var helt opløst. Cellebeskyttelse blev bestemt baseret på MTS-analyseresultater ifølge producentens 2204 X. GONG ET AL. Downloadet fra https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145 af gæst den 27. august 2021instruktioner. Den optiske tæthed blev bestemt ved en absorbansbølgelængde på 490 nm. Vi sporede yderligere aktiviteten af ​​forbindelser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 og 8 isoleret fra fraktion 3 og 4. Seriefortyndinger af forbindelser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 og 8 (3,125, 6,25, 12,5, 25 og 50 μM) blev føjet til den behandlede gruppe for at bestemme deres respektive beskyttende virkninger på H2O2--inducerede PC12-celler.

Kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR)

PC12-celler blev høstet 12 timer efter behandling med 3,125 μM caleolariosid B, parabosid B og parabosid II. Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol-reagens, og alikvoter af totalt RNA blev omvendt transskriberet ved anvendelse af et Primescript RT Master Kit i henhold til producentens instruktioner. Følgende primere blev anvendt til eksperimenterne i overensstemmelse med en tidligere rapport [21]. HO-1: Fremad 5′ -GC CTGCTAGCCTGGTTCAAG-3′, Tilbage 5′ -AGC GGTGTCTGGGATGAACTA-3′; GCLC: Fremad 5′ - GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3′, Reverse 5′ -TG TTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3′; GAPDH: Frem 5′-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3′, Tilbage 5′- GAAGACGCCAGTAGACTCCACG-3′. Alikvoter af de opnåede cDNA'er blev derefter amplificeret ved PCR. Reaktionsbetingelserne var som følger: indledende denaturering ved 95 grader (30 s), efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 grader (5 s), 60 grader (34 s) og 72 grader (35 s). Alle primere blev testet, og FL-fluorescenssignalet blev detekteret; derefter blev △Ct-værdien beregnet, og de relative værdier blev sammenlignet med kontrolgruppens værdier ved hjælp af følgende ligning: △Ct=Ct (prøve) − Ct (endogen kontrol), △△Ct {{36} } △Ct (prøve) −△Ct (ubehandlet), og fold skift=2-△△Ct. Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) blev brugt som en intern kontrol.

Proteinudvinding

PC12-celler blev podet på 100- mm skåle med 1 × 107 celler/skål. Efter vedhæftning blev cellerne henholdsvis behandlet med caleolariosid B, parabosid B og parabosid II (3,125 µM) i 12 timer. Glykosiderne blev derefter fjernet, og cellerne blev inkuberet med H2O2 i yderligere 6 timer. Efter inkubation blev cellerne vasket to gange med kold PBS og skrabet fra skålene med 1 ml PBS. Cellehomogenater blev centrifugeret ved 1500 rpm i 10 min. Efter behandling blev cellulære proteiner ekstraheret under anvendelse af en Beyotime RIPA-cellelysebuffer med 1 mM PMSF ifølge producentens instruktioner. Derudover blev cytoplasmatiske og nukleare proteiner isoleret som beskrevet i Beyotime nuklear og cytoplasmatisk ekstraktionssæt protokol. Proteinkoncentrationerne af prøverne blev påvist ved hjælp af et Beyotime BCA-proteinassay-kit, og alle prøver blev opbevaret ved -80 grader til western blotting-analyse [6].

Western blot analyse

SDS-PAGE-elektroforese blev udført efter ekstraktion og efterfølgende denaturering af totalt protein fra forskellige grupper. Efter elektroforese blev proteinet overført til PVDF-membraner, som derefter blev blokeret med 5 procent skummetmælkspulver i 4 timer. Efter vask primært antistof (kanin polyklonalt antistof GAPDH (1:10,000 fortynding), kanin polyklonalt antistof HO-1 (1:1000 fortynding) eller kanin polyklonalt antistof GCLC (1:1000 fortynding) blev tilsat til membranerne, som blev inkuberet natten over ved 4 grader.Den næste dag blev PVDF-membranerne vasket tre gange i TTBS Dernæst sekundært antistof (konjugeret affinitetsrent gede-anti-kanin-IgG (1:1000 fortynding) mærket med peberrod peroxidase blev tilsat til membranerne, som derefter blev inkuberet ved stuetemperatur i 2 h. PVDF-membranerne blev vasket og underkastet ECL kemiluminescensdetektionsreagens til signalering af eksponering på røntgenfilm, som derefter blev fikseret og scannet [22].

Statistisk analyse

Dataene blev analyseret ved hjælp af SPSS 19.0, og resultaterne præsenteres som gennemsnittet med standardafvigelse (SD) for tre uafhængige eksperimenter. Værdier af p < 0.05="" blev="" anset="" for="" at="" angive="" statistisk="" signifikante="">

Resultater Etablering af H2O2-model

Som vist i figur 2 forårsagede H2O2 ved 50, 100 og 200 μM ikke det passende niveau af celledød. Imidlertid virkede 400 μM H2O2 på PC12-celler inden for 2-6 timer, og den oxidative skade på celler havde en tendens til at være stabil. Derfor vurderede vi, at induktion med H2O2 i en koncentration på 400 μM i 6 timer var passende til at efterligne oxidativ stress-induceret skade på PC12-celler.

Beskyttende virkninger af råekstrakter på PC12-celler behandlet med H2O2

Sammenlignet med det i H2O2-modelgruppen (figur 3), n-butanolekstrakt i koncentrationer på 0.05, 0.1, {{10} }.2 og 0.4 mg/mL forbedrede signifikant oxidativ skade på PC12-celler induceret af H2O2 (p < 0.05)="" på="" en="" koncentrationsafhængig="" måde.="" disse="" data="" antydede,="" at="" n-butanolfraktionen="" indeholdt="" mere="" potent="" beskyttende="" aktivitet.="" petroleumsether-="" og="" ethylacetatekstrakter="" viste="" imidlertid="" kun="" beskyttende="" aktivitet="" ved="" høje="" koncentrationer="" (petroleumsether:="" 0.1="" og="" 0.2="" mg/ml,="" p="">< 0.{{31}="" }5;="" ethylacetat:="" 0,2="" og="" 0,4="" mg/ml,="" p="">< 0,05).="" desuden="" viste="" forskellige="" koncentrationer="" af="" ekstrakter="" i="" vandig="" fase="" ingen="" beskyttende="" virkninger="" (p=""> 0,05). Desuden har vi tilføjet data fra en valideringsundersøgelse ved hjælp af SH-SY5Y humane neuroblastomcellelinjer (SH-SY5Y) i den supplerende fil. Behandling med 250 μM H2O2 resulterede i nedsat cellelevedygtighed; behandling med caleolariosid B, parabosid B og parabosid II (3,125, 6,25, 12,5, 25 og 50 μM) svækkede imidlertid SH-SY5Y-celledød signifikant. Eksperimentresultaterne viste, at caleolariosid B, parabosid B og parabosid II beskyttede SHSY5Y-celler mod H2O2-induceret celleskade.

Strukturer af forbindelser isoleret fra n-butanolfraktionen

For at bekræfte, at n-butanolekstraktet indeholdt aktive komponenter, fraktionerede vi yderligere otte forbindelser fra ekstraktionen. Strukturerne af forbindelser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 og 8 blev identificeret ved hjælp af forskellige spektraldata (1H-NMR, 13C-NMR og ESI-MS) baseret på sammenligninger med offentliggjorte data for paraboside A , parabosid B, parabosid I, parabosid II, parabosid III, nuomiosid A, caleolariosid B og isonuomiosid A, henholdsvis [20]. For eksempel var dataene for parabosid B som følger: brunt gummi; ½ 20 D -55,7 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH maks. nm (loge): 220 (3,61), 291 (3,54), 330 (3,66) [20]; IRKBr max cm−1: 3392, 2943, 2885, 1699, 1683, 1606, 1521, 1361, 1282, 1163, 1114, 1039, 995, 817 cm−1 [120]; for 1H og 13C NMR spektroskopiske detaljerede data vist i reference 20; HR-ESI-MS (negativ) m/z 741,2231 [MH]- (beregnet for C33H41O19, 741,2242) [20]. Dataene for parabosid II var som følger: hvide amorphous pulvere; ½ 20 D -80,5 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH maks. nm (loge): 229 (3,74), 322 (3,73) [20]; IRKBr max cm−1: 3419, 1699, 1625, 1596, 1515, 1456, 1419, 1263, 1159, 1139, 1068, 1022, 808 cm−1 [20]; for 1H og 13C NMR spektroskopiske detaljerede data vist i reference 20; ESI-MS (negativ) m/z 637

Beskyttende virkninger af isolerede forbindelser mod H2O2-induceret toksicitet i PC12-celler

MTS-assays blev brugt til at undersøge effekten af ​​isolerede forbindelser på levedygtigheden af ​​PC12-celler udsat for H2O2-induceret toksicitet. Som vist i figur 5, sammenlignet med det i kontrolgruppen, blev PC12-celler forbehandlet med fem forskellige koncentrationer af caleolariosid B, parabosid B, parabosid II eller parabosid A (3.125, 6.25, 12.5, 25 og 50 μM) i 24 timer viste ingen signifikante forskelle i cellelevedygtighed (p > 0,05). Forbehandling af PC12-celler med caleolariosid B, parabosid B og parabosid II resulterede således i ingen cytotoksicitet. Som vist i figur 6 reducerede 400 µM H2O2 cellelevedygtigheden signifikant sammenlignet med den i kontrolgruppen. Desuden steg cellelevedygtigheden af ​​H2O2--behandlede PC12-celler markant efter forbehandling af PC12-celler med forskellige koncentrationer af caleolariosid B, parabosid B og parabosid II; endvidere var cellelevedygtighed den højeste efter behandling med 50 µM caleolariosid B, 50 µM parabosid B og 12,5 µM parabosid II. De andre fem forbindelser viste ingen signifikant beskyttende virkning på H2O2-behandlede PC12-celler. For at illustrere dette fund diskuterer vi en af ​​disse som et eksempel, mens de andre ikke er beskrevet i manuskriptet.

Transskriptionsniveauer af HO-1 og GCLC

Vi testede derefter de transkriptionelle niveauer af HO-1 og GCLC i PC12-celler behandlet med caleolariosid B, parabosid B og parabosid II. Total mRNA blev opsamlet fra behandlede og ubehandlede PC12-celler i 12 timer og derefter underkastet ekspressionsanalyse ved qRT-PCR. Som vist i figur 7(a,c,e) steg de transkriptionelle niveauer af HO-1 signifikant efter

PC12-celler blev forbehandlet med de angivne koncentrationer af caleolariosid B, parabosid B og parabosid II i 12 timer (p < 0.{{10}}5).="" som="" vist="" i="" figur="" 7(b)="" steg="" de="" transkriptionelle="" niveauer="" af="" gclc="" også="" signifikant="" i="" pc12-celler="" forbehandlet="" med="" de="" angivne="" koncentrationer="" af="" caleolariosid="" b="" i="" 12="" timer.="" niveauer="" af="" gclc="" i="" pc12-celler="" forbehandlet="" med="" parabosid="" b="" i="" 12="" timer="" faldt="" imidlertid="" signifikant="" sammenlignet="" med="" dem="" i="" modelgruppen="" (p="">< 0,05;="" figur="" 7(d)).="" endvidere="" var="" niveauerne="" af="" gclc="" i="" pc12-celler="" med="" parabosid="" ii-behandling="" ikke="" signifikant="" forskellige="" sammenlignet="" med="" dem="" i="" modelgruppen="" (p=""> 0,05; figur 7(f)).

Udtryk af HO-1 og GCLC

HO{{0}} og GCLC er vigtige cellulære antioxidantenzymer, og begge er Nrf2-regulerede nedstrømsgener. Proteinekspressionen af ​​HO-1 og GCLC blev også observeret efter behandling [6]. Figur 8 viser proteinniveauerne af HO-1 og GCLC i PC12-celler efter behandling med 400 μM H2O2; resultaterne indikerede, at FL-fluorescensintensiteterne af HO-1 i caleolariosid B- og parabosid B-grupperne var større end dem i de H2O2-behandlede grupper (figur 8(a,c)). Ekspressionen af ​​GCLC blev imidlertid ikke væsentligt ændret af forbindelserne, bortset fra caleolariosid B (figur 8(b)). Dernæst blev kemiske inhibitorer af HO-1 brugt til yderligere at evaluere rollen af ​​antioxidantenzymer i regulering af de beskyttende virkninger udøvet af caleolariosid B, parabosid B eller parabosid II mod H2O2-induceret cytotoksicitet. Caleolariosid B, parabosid B og parabosid II (3,125 µM) forhindrede H2O2--induceret cytotoksicitet, men sådanne beskyttende virkninger blev vendt af HO-1-hæmmeren ZnPP (p < 0,01)="" ved="" 15="" µm="" (figur="" 8)="">

Diskussion

Befolkningens aldring er et alvorligt globalt problem. Mange sygdomme er relateret til senilitet, såsom AD og PD, som er alvorlige trusler mod folkesundheden. AD og PD er opstået som de tredjemest dødelige sygdomme globalt, efter hjerte-kar-sygdomme og kræft. Derfor er neurodegeneration blevet et presserende forskningsemne verden over. Imidlertid har patogenesen af ​​AD og PD, neurodegenerative sygdomme i centralnervesystemet, været uklar til dato. Desuden er der kun få lægemidler, der effektivt kan behandle AD eller PD på grund af deres komplekse patogene mekanismer [23]. Tidligere undersøgelser viste, at ROS, såsom superoxidanion (O2−) og H2O2, er de vigtigste faktorer, der bidrager til neurodegenerative sygdomme. Patologiske ændringer under PD omfatter neuronal degeneration og død af substantia nigra og striatal dopamin [24,25]. Derfor er det vigtigt at udvikle effektive antioxidantlægemidler til behandling af PD, og ​​en sådan lægemiddelopdagelse er blevet en vigtig forskningsretning [26]. I øjeblikket ser Nrf2/ARE-signalvejen ud til at være den vigtigste endogene antioxidant-stressvej [27]. ARE'er er placeret i de 5'-flankerende områder af gener, såsom HO-1 og GCLC [28,29]. HO-1 og GCLC er Nrf2--relaterede gener, som er reguleret nedstrøms for dette protein [6]. ARE'er kan efterfølgende påvirke niveauerne af antioxidanter og aktivere nedstrøms-ekspressionen af ​​HO-1 og andre beskyttende gener, hvilket kan forbedre cellebeskyttelsesaktiviteter [30,31]. Desuden antydede resultater, at de beskyttende virkninger af resveratrol mod A 1-42--induceret toksicitet i PC12-celler opstår gennem opregulering af HO-1-ekspression via aktivering af Nrf2-intracellulære signalvej [32].

PC12-celler er en accepteret model af neurale celler og bruges i vid udstrækning i undersøgelser af neurobeskyttende effekt [33]. H2O2 kan let passere gennem cellemembranen og kombineres med jern for at danne højaktive frie radikaler, som inducerer oxidativ stress og celleskade [34]. H2O2 er en vigtig ROS, og frie radikaler genereres let og relativt stabile, og derfor bruges de normalt til at etablere en oxidativ stressmodel ved hjælp af PC12-celler [5]. I denne undersøgelse inducerede forbehandling af PC12-celler med ikke-toksiske koncentrationer af planteekstraktet beskyttede celler mod H2O2- cytotoksicitet ved at reducere dannelsen af ​​ROS. Phenylethanoidglycosider indeholder mange phenoliske hydroxylgrupper, der har antioxidant- og antialdringsaktiviteter. I denne undersøgelse fandt vi, at n-butanolekstraktion gav bedre beskyttelse end andre polaritetsfraktioner (figur 3). Således screenede vi yderligere de beskyttende aktiviteter af otte forbindelser isoleret fra n-butanolfraktionen. Resultaterne viste for første gang, at Figur 8. Analyse af HO-1- og GCLC-proteinniveauer på PC12-celler. (a) Western blotting-analyse af ekspressionen af ​​HO-1 og GCLC og GAPDH blev brugt som en ladningskontrol. (b) Western blot-analyse GCLC-proteinekspression. (c) Western blot-analyse HO{{20}}-proteinekspression. (d) HO-1-hæmmer ZnPP reducerede den neurobeskyttende effekt. Data præsenteres som middelværdier ± SD, n=3. ***p < 0.001="" versus="" kontrolgruppe;="" #p="">< 0.05="" versus="" h2o2="" gruppe="" (uden="" znpp="" behandlet),="" ##p="">< 0,01="" versus="" h2o2="" gruppe="" (uden="" znpp="" behandlet),="" ###p="">< 0,001="" versus="" h2o2="" gruppe="" (uden="" znpp="" behandlet);="" og="" p="">< 0,01,="" versus="" h2o2-gruppen="" (med="" znpp="" behandlet),="" og="" &p="">< 0,001,="" versus="" h2o2-gruppen="" (med="" znpp="" behandlet).="" (kontrolgruppe;="" modelgruppe:="" h2o2;="" znpp="" negativ="" gruppe:="" caleolariosid="" b="" plus="" h2o2,="" parabosid="" b="" plus="" h2o2,="" parabosid="" ii="" plus="" h2o2;="" znpp="" positiv="" gruppe:="" znpp="" plus="" caleolariosid="" b="" plus="" h2o2,="" znpp="" plus="" parabosid="" b="" plus="" h2o2,="" znpp="" plus="" parabosid="" ii="" plus="" h2o2).="" 2210="" x.="" gong="" et="" al.="" downloadet="" af="" en="" gæst="" den="" 27.="" august="" 2021="" caleolarioside="" b,="" paraboside="" b="" og="" paraboside="" ii="" har="" betydelige="" beskyttende="" virkninger="" mod="" h2o2--induceret="" oxidativ="" skade="" i="" pc12-celler.="" resultaterne="" indikerede="" også,="" at="" h2o2-behandling="" inducerede="" signifikant="" pc12-celleskade="" og="" nedsatte="" cellelevedygtighed,="" hvorimod="" behandling="" med="" caleolariosid="" b,="" parabosid="" b="" og="" parabosid="" ii="" signifikant="" mindskede="" disse="" virkninger="" (figur="" 6).="" en="" tidligere="" undersøgelse="" rapporterede,="" at="" nrf2/are-vejen="" er="" en="" af="" ​​de="" vigtigste="" endogene="" antioxidantveje="" og="" kan="" opregulere="" ekspressionen="" af="" ​​nedstrømsmarkører,="" såsom="" ho-1,="" for="" at="" beskytte="" celler="" [7].="" resultaterne="" af="" qrt-pcr="" og="" western="" blotting-analyser="" viste,="" at="" caleolariosid="" b,="" parabosid="" b="" og="" parabosid="" ii="" signifikant="" opregulerede="" niveauerne="" af="" ho="" -1.="" imidlertid="" steg="" de="" transkriptionelle="" niveauer="" af="" gclc="" signifikant="" i="" pc12-celler="" forbehandlet="" med="" caleolariosid="" b,="" men="" faldt="" i="" dem,="" der="" var="" forbehandlet="" med="" parabosid="" b="" sammenlignet="" med="" dem="" i="" modelgruppen.="" yderligere="" ændrede="" arabinosid="" ii="" ikke="" ekspressionen="" af="" ​​denne="" markør="" sammenlignet="" med="" den="" i="" modelgruppen="" (figur="" 7="" og="" 8(a-c)).="" derudover="" blev="" de="" beskyttende="" virkninger="" af="" caleolariosid="" b,="" parabosid="" b="" og="" parabosid="" ii="" mod="" h2o2-induceret="" pc12-celleskade="" vendt="" af="" ho-1-hæmmeren="" znpp="" (figur="" 8(d)).="" som="" konklusion="" beskyttede="" phenylethanoidglycosiderne="" caleolariosid="" b,="" arabinosid="" b="" og="" parabosid="" ii="" effektivt="" pc12-celler="" mod="" h2o2-induceret="" oxidativ="" skade.="" følgelig="" kan="" disse="" forbindelser,="" isoleret="" fra="" p.="" martini,="" repræsentere="" potentielle="" lægemiddelkandidater="" til="" behandling="" af="" neurodegenerative="">

ForfatterbidragLM og ZC udtænkte og designede eksperimenterne. GX, RK og BX udførte eksperimenterne. GX og XY skrev papiret. GX, XY, RK, BX, ZC og LM diskuterede resultaterne, kommenterede manuskriptet. Alle forfattere læste og godkendte det endelige manuskript.

OplysningserklæringIngen potentiel interessekonflikt blev rapporteret af forfatterne. Finansiering Dette arbejde blev støttet af forskningsfonde fra Baotou Medical College [bevillingsnummer: BYJJ-YF 201727] og 2018-tilskuddet for kinesisk medicin til det offentlige sundhedsvæsen "den fjerde undersøgelse om kinesisk materia medica-ressource" [bevillingsnummer: Finance Society [2018] ] 43].

Referencer

[1] Butterfield DA. Perspektiver på oxidativt stress i Alzheimers sygdom og forudsigelser om fremtidige forskningsfokus. J Alzheimers Dis. 2018;64:1-11.

[2] Chignon C, Tomas M, Bonnefontrousselot D, et al. Oxidativt stress og amyloid-beta-peptidet i Alzheimers sygdom. Redox Biol. 2018;14:450–464.

[3] Guo JD, Zhao X, Li Y, et al. Skader på dopaminerge neuroner ved oxidativt stress i Parkinsons sygdom (gennemgang). Int J Mol Med. 2018;41:1817-1825.

[4] Bai Y, Dong LH, Huang XH, et al. Sammenslutning af rs823128, rs1572931 og rs823156 polymorfismer med reduceret risiko for Parkinsons sygdom. Neuroreport. 2017;27:936-941.

[5] Han XH, Zhu SL, Wang BX, et al. Antioxidantvirkning af 7,8-dihydroxyflflavon beskytter PC12-celler mod 6-hydroxydopamin-induceret cytotoksicitet. Neurochem Int. 2014;64:18–23.

[6] Li MQ, Xu T, Zhou F, et al. Neuroprotektive virkninger af fire phenylethanoidglycosider på H2O2-induceret apoptose på PC12-celler via Nrf2/ARE-vejen. Int J Mol Sci. 2018;19:1135.

[7] Buendia I, Michalska P, Navarro E, et al. Nrf2-ARE pathway: et spirende mål mod oxidativt stress og neuroinflammation i neurodegenerative sygdomme. Pharmacol Therapeut. 2016;157:84-104.

[8] Jia XJ, Yan XS, Cai ZP, et al. Virkningerne af phenylethanoidglycosider, afledt af Herba cistanche, på kognitive underskud og antioxidantaktiviteter hos SAMP8-hanmus. J Toxicol Env Heal A. 2017;80:1180-1186.

[9] Tsvetkov DE, Dmitrenok AS, Tsvetkov YE, et al. Phenylethanoid glycosider fra teaktræ knaster og deres antioxidant aktivitet. J Biol Active Prod Nat. 2016;6:272-281.

[10] Zhang YQ, Gao EY, Liang CQ, et al. Antioxidantaktivitet af caffeoylphenylethanoidglycosidforbindelser fra Lindernia ruellioides in vitro. Cent South Pharm. 2017;15:1687-1690.

[11] Wu ZH, Ma YF, Zhao L, et al. Rolle af Nrf2-ARE-veje i oxidativ stressskade og dets forhold til andre signalveje. Anim Husbandry Feed Sci. 2016;37:42–48.

[12] Zheng XK, Li J, Feng WS, et al. Fremskridt i studiet af Gesneriaceae. Chin J Nyt lægemiddel. 2003;12:261-263.

[13] Wen F, Li ZD. Forskningsfremskridt om Gesneriaceae-planten. Chin Wild Plant Resour. 2006;25:1-6.

[14] Yan WY, Chen L, Wang JM, et al. Forskningsfremskridt for triterpenoider fra Gesneriaceae-planter. Nat Prod Res Dev. 2012;24:698-701.

[15] Kinesisk urtemedicinvirksomhed. Den kinesiske traditionelle medicin ressourceoptegnelser. Kina: Science Press; 1994.

[16] Bai ZF, Wang XQ, Xiao PG, et al. Phenylethanoid glycosider distribution i medicinske planter af Gesneriaceae. Chin J Chin Mater Med. 2013;38:4267-4270.

[17] He ZD, Lau KM, Xu HX, et al. Antioxidantaktivitet af phenylethanoidglycosider fra Brandisia hancei. J Ethnopharmacol. 2000;71:483-486.

[18] Li L, Shi DF, Gui YG, et al. Undersøgelse af antioxidantaktiviteterne af phenylethanoidglycosider fra Cistanche deserticola. J Anhui Agri Sci. 2009;32:15835-15836.

[19] Ju BW, Yang JH, Yan Y, et al. Beskyttende virkninger af glycosider af cistanche på beskadigelse af PC12-celler PARABOLA MARTINI BESKYTT PC12-CELLER FRA H2O2-INDUCERET SKADE 2211